响应型载药聚合物、铁死亡纳米粒及其制备方法和应用

1.本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种响应型载药聚合物、使用其形成的铁死亡纳米粒、及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。


背景技术：

2.铁死亡是一种不同于细胞凋亡、坏死等新型的细胞死亡形式，主要为细胞内产生了致死水平的脂质活性氧自由基。近年来研究人员发现了各种小分子药物可以作用于铁死亡通路，通过抑制氨基酸交换通路或抑制过氧化脂质修复通路从而诱导肿瘤内脂质过氧化的致命积累，在肿瘤铁死亡中发挥着重要的作用。
3.但是小分子药物存在成药困难，半衰期短，不能精确到达靶器官，在体内循环时容易被代谢，小剂量多次给药容易造成肿瘤过早产生耐药性，大剂量给药又容易对正常器官产生不可忽视的毒副作用，因此，选择合适的药物递送载体达到肿瘤精确给药的目的十分重要。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种响应型载药聚合物。
6.本发明的目的之二在于提供一种所述响应型载药聚合物的制备方法。
7.本发明的目的之三在于提供一种由所述响应型载药聚合物制成的铁死亡纳米粒。
8.本发明的目的之四在于提供一种所述铁死亡纳米粒的制备方法。
9.本发明的目的之五在于提供一种所述铁死亡纳米粒的应用。
10.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
11.本发明第一方面提供了一种式i所示的响应型载药聚合物，
[0012][0013]
其中，
[0014]
x为10-145的整数，例如10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145，优选为100-130的整数，进一步优选为113；
[0015]
y为20-80的整数，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80，优选为55-70的整数，进一步优选为60；
[0016]
z为5-40的整数，例如5、10、15、20、25、30、35、40，优选为10-20的整数，进一步优选为15；
[0017]
r1各自独立地为对ph响应的酸敏感基团；
[0018]
r2选自c6-c12烷硫基、取代或未取代的c6-c12芳基，所述取代的取代基选自c1-c6烷基、c1-c6烷硫基；
[0019]
x为-l-a或-o-(ch2)
n-r3；
[0020]
l为连接聚合物骨架和a的连接基团；
[0021]
a各自独立地为衍生自青蒿素衍生物(优选双氢青蒿素和青蒿琥酯)的基团；
[0022]
n为1-6的整数，优选为1；
[0023]
r3各自独立地为对h2o2响应的ros敏感基团。
[0024]
在一些实施方式中，r1选自如下基团：
[0025][0026]
其中，表示连接位置。
[0027]
优选的，r1为n,n-二异丙基氨基。
[0028]
在一些实施方式中，r2选自c8-c12烷硫基、苯基、c1-c4烷基取代的苯基、c1-c4烷硫基取代的苯基。
[0029]
r2可以是来源于以下raft(可逆加成-断裂链转移，reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization)聚合链转移剂的官能团：
[0030]
[0031][0032]
聚合反应时raft聚合链转移剂会打开以和其他基团进行连接，聚合反应后形成具有r2的raft聚合链转移剂片段。
[0033]
优选的，r2为十二烷硫基。
[0034]
在一些实施方式中，x为-l-a，l选自如式i1、式i2、式i3和式i4所示的基团：
[0035][0036]
其中，m1、m2各自独立地选自碳原子数为1～4的亚烷基；
[0037]
r4、r5各自独立地选自羰基(-c(＝o)-)、亚氨基(-nh-)、-o-；
[0038]
优选的，m1和m2相同。
[0039]
优选的，l选自如下基团：
[0040][0041]
进一步优选的，l为
[0042]
在一些实施方式中，x为-l-a，a的结构如下：
[0043][0044]
此时式i形成一类响应型青蒿素酯类聚合物。
[0045]
在一些实施方式中，x为o-(ch2)
n-r3，r3为对ros敏感的苯硼酸酯类基团，结构如下：
[0046][0047]
其中，r4选自h、c1-c6烷基、卤素(cl、br、f)或nh2，优选的，r4为h；
[0048]
此时式i形成一类响应型苯硼酸酯类聚合物。
[0049]
在一些实施方式中，式i的响应型载药聚合物选自式i-1的响应型载药聚合物和式i-2的响应型载药聚合物：
[0050][0051]
其中，x、y、z、r1、r2、r3、l、a的定义与前述相同。
[0052]
式i-1的响应型载药聚合物包括聚合物骨架、连接基团l和衍生自青蒿素衍生物小分子基团a，彼此之间通过共价键连接，即聚合物骨架一端通过连接基团l与青蒿素衍生物基团a以共价键连接，具体地，聚合物骨架一端通过聚合物骨架中的聚甲基丙烯酰基与连接基团l一端以共价键连接，青蒿素衍生物基团通过双氢青蒿素中的羟基或青蒿琥酯中的羧基与连接基团l的另一端以共价键连接。
[0053]
式i-1的响应型载药聚合物的聚合物骨架包括如下片段：甲氧基，聚乙二醇，酰胺基，raft聚合链转移剂，含有酸敏感基团r1的聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酰基。
[0054]
聚合物骨架中的聚甲基丙烯酰基具有多个甲基丙烯酰基(z的数量)，也就是聚合物骨架是具有多个甲基丙烯酰基端的，每个甲基丙烯酰基端均连接一个连接基团l，每个连接基团l再连接一个基团a(双氢青蒿素或青蒿琥酯基团)，因此，聚合物骨架可以连接多个-l-a。
[0055]
式i-2的响应型载药聚合物包括如下片段：甲氧基，聚乙二醇，酰胺基，raft聚合链转移剂，含有酸敏感基团r1的聚甲基丙烯酸乙酯、含ros敏感基团r3的聚甲基丙烯酸酯，即聚合物骨架上的每个甲基丙烯酸酯与r3以共价键连接。
[0056]
在一种优选的实施方式中，式i-1的响应型载药聚合物选自如下聚合物：
[0057][0058]
在一种优选的实施方式中，式i-2的响应型载药聚合物选自如下聚合物：
[0059][0060]
本发明第二方面提供了一种式i的响应型载药聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0061]
1)将nh
2-peg-och3与raft聚合链转移剂发生酰胺化反应，得到ch3o-peg-nh-co-raft聚合链转移剂
[0062]
2)将所述ch3o-peg-nh-co-raft聚合链转移剂、r1取代的甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯化的l的前体发生raft聚合反应，得到高分子聚合物1
[0063]
3)将所述高分子聚合物1与双氢青蒿素或青蒿琥酯反应，得到式i-1的响应型载药聚合物；
[0064]
在一些实施方式中，l为l的前体为
[0065]
本发明第三方面提供了一种式i-2响应型载药聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0066]
1)将nh
2-peg-och3与raft聚合链转移剂发生酰胺化反应，
得到ch3o-peg-nh-co-raft聚合链转移剂
[0067]
2)将所述ch3o-peg-nh-co-raft聚合链转移剂、r1取代的甲基丙烯酸乙酯和开环的甲基丙烯酸缩水甘油酯发生raft聚合反应，得到高分子聚合物2
[0068]
3)将所述高分子聚合物2与苯硼酸反应，得到式i-2的响应型载药聚合物。
[0069]
本发明第四方面提供了一种铁死亡纳米粒，由式i的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物自组装而成，优选由式i-1的响应型载药聚合物、式i-2的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物自组装而成，进一步优选式i-1的响应型载药聚合物、式i-2的响应型载药聚合物的质量比为1：1。图1显示铁死亡纳米粒的示意图，但本发明不限于此。
[0070]
在一些实施方式中，ph为7.4，铁死亡纳米粒的流体力学直径为40-150nm，优选为40-60nm。
[0071]
所述小分子肿瘤铁死亡诱导药物是激活肿瘤细胞铁死亡类的药物，包括但不限于索拉菲尼，柳氮磺吡啶，erastin，咪唑酮erastin，dpi12、13、17、18、19，ml210，(1s,3r)-rsl-3，ml162，fin56，fino2，ferroptocides，奥曲他明，他汀类药物(氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀酸)，丁硫氨酸亚砜亚胺，拉帕替尼，西拉美新，以及青蒿素类衍生物等中的一种或多种。
[0072]
本发明的铁死亡纳米粒是一种可以同时对ph和ros响应的纳米制剂，包含可以质子化的酸敏感基团和ros响应断裂的苯硼酸酯基团。在7.4的中性ph值下，纳米粒子由细胞内可酸性电离的青蒿素酯类聚合物和同时具有ros和酸响应的苯硼酸酯类聚合物组成，苯硼酸结构可以提供π-π堆叠将包载的小分子药物稳定地封装在疏水纳米粒子核心内。纳米粒外的peg外壳有助于纳米粒在生物体内的长循环，纳米粒通过epr效应被细胞摄取后，在细胞内溶酶体(ph＝5.4-6.2)经过酸和ros触发pdpa和pbe动态共价键裂解和疏水核心质子释放包载的药物，有助于小分子药物在肿瘤中的富集，从而提高靶部位的药物浓度，可以有效地引起肿瘤铁死亡。
[0073]
本发明第五方面提供了一种所述铁死亡纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
[0074]
将式i的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物溶于有机相，然后分散于水中，所得溶液通过超滤或透析得到铁死亡纳米粒；
[0075]
优选地，将式i-1的响应型载药聚合物、式i-2的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物溶于有机溶剂中，然后分散于水中，所得溶液通过超滤或透析得到铁死亡纳米粒。
[0076]
在一些实施方式中，水为去离子水，有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，n,n-二甲基乙酰胺，二甲亚砜中的任一种。
[0077]
超滤过程中可采用超滤管离心超滤或超滤机超滤方式进行，该过程中所使用的超滤管或超滤膜包的截留分子量可为1.5kd、3kd、5kd、10kd，并合理选择其中一种。
[0078]
透析过程中透析袋截留分子量可为800、1000、3500、14000，并合理选择其中一种。透析采用的溶剂为去离子水。
[0079]
本发明第六方面提供了上述铁死亡纳米粒在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的应用，所述恶性肿瘤优选自乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺导管癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌或黑色素瘤。
[0080]
本发明的技术方案至少具有以下技术效果：
[0081]
为了缓解小分子药物的靶向性差，半衰期短，以及对其他正常器官的毒副作用，本发明实施例提出了一种具有酸和ros双响应的铁死亡纳米粒及其制备方法，通过形成载药纳米粒，借助肿瘤细胞的epr效应增强肿瘤细胞对纳米粒的内吞作用，增加细胞对药物的摄取，从而提高肿瘤部位的药物浓度；同时在纳米粒的作用下，药物在生物体内的半衰期有效延长，药物组织分布得到明显改善。本发明实施例的铁死亡纳米粒是由两种响应型聚合物自组装而成。本发明实施例的响应型聚合物通过raft聚合物将peg高分子骨架以及ph敏感、ros敏感的基团和双氢青蒿素与连接基团共价连接，可实现纳米粒在体内的长循环，以及药物在肿瘤部位的可控释放。本发明先将raft反应的链转移剂cta的羧基与ch3o-peg-nh2的氨基反应，所得产物再进行raft聚合反应连接含r1和r3基团的甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯化的苯硼酸酯或带有连接基团的双氢青蒿素。因为其多重响应的功能，可以增加纳米粒在肿瘤特定条件下释放包载的小分子药物。另外对该铁死亡纳米粒通过聚合合成方法的调整以及两种聚合物的配比的调整，可灵活控制小分子药物的荷载数量，进一步提高药物在靶部位的暴露浓度，从而在增加药效的同时可降低耐药性产生的风险。
[0082]
本发明的响应型双氢青蒿素聚合物和响应型苯硼酸酯聚合物自组装所得到的铁死亡纳米粒，其peg外壳有助于纳米粒在生物体内的长循环，通过epr效应被肿瘤细胞摄取，改善其在生物体内的组织分布情况，有效将铁死亡诱导剂选择性递送至肿瘤部位并实现在肿瘤组织的高效蓄积和滞留；通过对肿瘤中的酸和高的ros产生响应，释放包载的小分子肿瘤铁死亡诱导剂，从而提高肿瘤细胞发生铁死亡的几率，同时通改善肿瘤免疫微环境，提高肿瘤免疫治疗效果，有利于抑制肿瘤的生长增殖及转移复发过程。在增强治疗效果的同时降低对其他器官的毒副作用，为应用于临床上有效递送肿瘤治疗药物奠定基础。
[0083]
本发明的铁死亡纳米粒可荷载多种小分子肿瘤治疗药物，具有良好的生物相容性，可通过肿瘤组织的epr效应被肿瘤有效的摄取，具有良好的肿瘤组织蓄积和渗透能力。该纳米粒被肿瘤细胞高效摄取后，其可激活型的响应键断裂以释放包载的小分子药物，从而改善小分子药物的肿瘤组织选择性以及肿瘤细胞对小分子药物的摄取能力，在实现高效
肿瘤组织杀伤效果的同时降低小分子药物对正常组织器官的毒副作用。
附图说明
[0084]
图1示出了本发明的铁死亡纳米粒的示意图；
[0085]
图2示出了本发明实施例1制备的peg-cta核磁图；
[0086]
图3示出了本发明实施例2制备的响应型青蒿琥酯聚合物核磁图；
[0087]
图4示出了本发明实施例3制备的响应型苯硼酸酯聚合物核磁图；
[0088]
图5示出了在本发明的实施例4制备的铁死亡纳米粒的粒径分布图；
[0089]
图6示出了在本发明的实施例4制备的铁死亡纳米粒对铁死亡激动剂rsl-3的包载情况；
[0090]
图7示出了本发明实施例4制备的铁死亡纳米粒在不同ph和h2o2条件下的流体力学粒径和透射电镜图，其中，左1为ph＝7.4，左2为h2o2＝10mm，左3为ph＝5.4，右1为ph＝5.4+10mm h2o2，标尺刻度为100纳米。
[0091]
图8示出了在本发明的实施例4制备的铁死亡纳米粒在体外模拟肿瘤细胞生理微环境中的rsl-3累计释放图；
[0092]
图9示出了在本发明的实施例4制备的铁死亡纳米粒在panc02胰腺癌细胞中的摄取能力；
[0093]
图10示出了在本发明的实施例4制备的铁死亡纳米粒在不同浓度下与panc02细胞共孵育24h后的细胞毒性测定；
[0094]
图11示出了pbs溶液、本发明实施例4中制备的铁死亡纳米粒在雌性balb/c裸鼠中的抑瘤情况，其中，坐标点为圆形表示pbs，正方形表示铁死亡纳米粒；
[0095]
图12示出了pbs溶液、本发明实施例4中制备的铁死亡纳米粒对雌性balb/c裸鼠的体重影响，其中，坐标点为圆形表示pbs，正方形表示铁死亡纳米粒。
[0096]
图13示出了pbs溶液、本发明实施例4中制备的铁死亡纳米粒在c57/bl6免疫健全鼠中的抑瘤情况，其中，坐标点为圆形表示pbs，三角形表示铁死亡纳米粒；
[0097]
图14示出了pbs溶液、本发明实施例4中制备的铁死亡纳米粒对c57/bl6免疫健全鼠的体重影响，其中，坐标点为圆形表示pbs，三角形表示铁死亡纳米粒。
具体实施方式
[0098]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0099]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，提供以下实施例仅出于说明目的并不构成对本发明要求保护范围的限制。
[0100]
实施例中所用的ch3o-peg
113-nh2(peg-nh2，mn＝5000da)购自键凯科技(中国)，甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(dpa)、甲基丙烯酸羟乙酯(hema)、4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(cta)购自西格玛奥德里奇(中国)公司，青蒿琥酯(ars)，苯硼酸，甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)购自阿拉丁(上海)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
(edci)、4-二甲氨基吡啶(dmap)、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二异丙基乙胺(diea)二甲亚砜(dmso)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、偶氮二异丁腈(aibn)购自上海百灵威科技有限公司，双氢青蒿素购自大连美仑生物生物技术有限公司。如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。
[0101]
panc02胰腺癌细胞购自中科院上海细胞库，细胞培养用dmem培养基购自大连美仑生物技术有限公司，胎牛血清购自gibco公司。
[0102]
铁死亡纳米粒的流体力学粒径由马尔文激光粒径仪测定仪(zen3690、malven、usa)测得；纳米粒的形貌考察由120kv透射电子显微镜(talos l120c，fei，usa)完成。电子天平(quintix 224-1，sartorius germany)；旋转蒸发仪(b-40，buchi，switzerland)；恒温磁力搅拌器(df-101s，上海予化仪器有限公司)；核磁共振谱仪(mercury plus 400，varian，usa)；rsl-3的释放由waters 2695高效液相色谱仪(waters e2695色谱泵，xbridge c18 5μm19*250mm色谱柱，waters 2998紫外检测器)完成。流式实验数据由bd facs fortessa流式细胞仪测得。如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。
[0103]
实施例1：peg-cta合成
[0104][0105]
将4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸(228.6mg,0.6mmol)溶于10.0ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，并向其中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu，608mg，1.2mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，2.9mg，0.015mmol)，冰浴下活化羧基2h后，滴加peg-nh2(1.5g，0.3mmol)的n,n-二甲基甲酰胺溶液，室温下反应24h。反应完毕后，选用透析法除去杂质，冷冻干燥得聚合物ch3o-peg
113-cta(1.2g)(缩写为peg-cta)，收率为80％。
[0106]
图2示出了制备的peg-cta的核磁图。
[0107]
实施例2：响应型青蒿琥酯聚合物的合成
[0108][0109]
将peg-cta(200mg，0.019mmol)、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(dpa，256.8mg，2.6mmol)、甲基丙烯酸羟乙酯(hema，48.1mg，0.7mmol)和偶氮二异丁腈(aibn，0.5mg，0.003mmol)溶于2.0ml dmf中，经过三个冷冻-解冻循环除氧后，在70℃下反应24h。反应完毕后，选用透析法除去杂质，冷冻干燥得peg-b-p(dpa-r-hema)(b表示嵌段，r表示接枝，p表
示聚合物)两嵌段共聚物(381.4mg)，收率为74.8％。
[0110]
将青蒿琥酯(ars，115.2mg，0.03mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，170mg，0.09mmol)、4-二甲氨基吡啶(dmap，109.8mg，0.09mmol)、n,n-二异丙基乙胺(diea，116.1mg,0.06mmol)溶解在5ml dmf中，冰浴上活化羧基1.5h后，滴加用dmf溶解的peg-b-p(dpa-r-hema)(200mg，0.01mmol)，反应24h。反应完毕后，选用透析法除去杂质，冷冻干燥得响应型青蒿琥酯聚合物(222mg)，收率为71.2％。凝胶渗透色谱(gpc)测试：mn＝14923，mw＝17761，mw/mn＝1.190。
[0111]
图3示出了制备的响应型青蒿琥酯聚合物的核磁图。
[0112]
实施例3：响应型苯硼酸酯聚合物的合成
[0113][0114]
将peg-cta(100mg，0.019mmol)、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(dpa，162.1mg，0.76mmol)、甲基丙烯酸甘油酯(gma，91.3mg，0.57mmol)和偶氮二异丁腈(aibn，0.5mg，0.003mmol)溶于2.0ml dmf中，经过三个冷冻-解冻循环除氧后，在70℃下反应24h。反应完毕后，选用透析法除去杂质，冷冻干燥得peg-b-p(dpa-r-gma)两嵌段共聚物(222.6mg)，收率为62.3％。
[0115]
将peg-b-p(dpa-r-gma)(100mg，0.003mmol)和苯硼酸(67.6mg，0.55mmol)溶解在10ml甲苯中，120℃回流24h。反应完毕后，选用透析法除去杂质，冷冻干燥得响应型苯硼酸酯聚合物(112.4mg)，收率为67.6％。凝胶渗透色谱(gpc)测试：mn＝10939，mw＝13001，mw/mn＝1.251。
[0116]
图4示出了制备的响应型苯硼酸酯聚合物的核磁图。
[0117]
实施例4：铁死亡纳米粒的制备
[0118]
将1mg实施例2的响应型青蒿素琥酯聚合物，1mg实施例3的响应型苯硼酸酯聚合物和0.018mg的(1s，3r)-rsl-3溶于50μl二甲亚砜溶剂中，然后将上述溶液在超声(功率80w，3min)作用下缓慢滴入1.0ml去离子水中。随后，将所获得的溶液于超滤管中离心超滤，所得即为铁死亡纳米粒(记作pdba@rsl-3，其中，p代表聚合物，d代表甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯，b代表苯硼酸，a代表双氢青蒿素)。
[0119]
对照纳米粒：将2mg实施例2的响应型青蒿素琥酯聚合物和0.018mg的(1s，3r)-rsl-3溶于50μl二甲亚砜溶剂中，然后将上述溶液在超声(功率80w，3min)作用下缓慢滴入1.0ml去离子水中。随后，将所获得的溶液于超滤管中离心超滤，所得即为作为对照的不含对ros响应的苯硼酸酯的纳米粒(记作pda@rsl-3，其中，p代表聚合物，d代表甲基丙烯酸二
异丙氨基乙酯，a代表双氢青蒿素)。
[0120]
实施例5：铁死亡纳米粒的粒径和pdi
[0121]
通过马尔文粒度仪测试实施例4中制备的pdba@rsl-3纳米粒和pda@rsl-3纳米粒在ph 7.4溶液中的粒径，测试条件：25℃，测三次，每次15个循环，结果如图5所示。结果表明，pda@rsl-3的粒径为119.7
±
0.6，pdi为0.196
±
1.4，而pdba@rsl-3纳米粒的粒径为48.8
±
1.1，pdi为0.14
±
0.01，表明pdba@rsl-3中的苯硼酸结构对rsl-3具有更好的压缩和包载作用。
[0122]
实施例6：铁死亡纳米粒对rsl-3的包载效果评价
[0123]
将实施例4中制备的pdba@rsl-3纳米粒和pda@rsl-3纳米粒分别分散于透析袋(14，000da)中，在去离子水中透析24h，将透析袋中的纳米粒子溶液通过超滤离心，加入甲醇(1:9，v/v)，2h后通过紫外分光光度计检测rsl-3的包载情况。
[0124]
如图6所示，带有苯硼酸酯的pdba纳米粒可以包载更多的rsl-3。
[0125]
实施例7:铁死亡纳米粒的酸及ros响应测试
[0126]
取实施例4制备的pdba@rsl-3铁死亡纳米粒溶分别在ph＝7.4、ph＝5.4，10mm h2o2以及含有10mm h2o2的ph＝5.4的缓冲溶液的条件下处理，不同时间点利用动态光散射仪测定纳米粒流体力学半径。
[0127]
结果如图7所示(坐标点方形的表示模拟环境中含有10mm的h2o2，坐标点圆形的表示模拟环境中ph＝5.4，坐标点菱形的表示模拟环境中ph＝7.4，坐标点三角形的表示模拟环境中同时包含10mm的h2o2以及ph＝5.4)，处于含有10mm h2o2的ph＝5.4的缓冲溶液的条件下的铁死亡纳米粒粒径和pdi随时间的延长而逐渐变大。
[0128]
将分别在ph＝7.4，ph＝5.4，10mm h2o2以及含有10mm h2o2的ph＝5.4的缓冲溶液的条件下处理24h的铁死亡纳米粒溶液(1mg/ml)滴加在透射电镜用碳膜支持铜网上，2min后使用滤纸吸除过量液滴，使用0.1％的醋酸铀溶液染色30s，除去过量染色液后使用白炽灯烘干。使用透射电镜对制备的铜网进行观测，考察纳米粒的形貌特征。
[0129]
结果如图7所示，处于ph＝5.4和10mm h2o2中的纳米粒仅表现出溶胀，而处于含有10mm h2o2的ph＝5.4的缓冲溶液的条件下的具有响应型的铁死亡纳米粒解离，呈现无定型状态，而ph＝7.4时的纳米粒，外形圆润且均一。表明纳米粒在ph＝7.4的中性条件下具有稳定性，当同时满ph＝5.4以及ros条件时，纳米粒会发生解离。
[0130]
实施例8：铁死亡纳米粒中rsl-3的释放
[0131]
取实施例4制备的pdba@rsl-3铁死亡纳米粒分散于透析袋(14，000da)中，配置如下的缓冲溶液：1)ph＝7.4的缓冲溶液，2)含有10mm h2o2的ph＝7.4缓冲溶液，3)ph＝5.4的缓冲溶液，4)含有10mm h2o2的ph＝5.4缓冲溶液中，于37℃恒温摇床下，分别在0、2、4、8、12、24h取样，运用高效液相色谱仪计算rsl-3的累积释放量。
[0132]
结果如图8所示(坐标点方形的表示模拟环境中含有10mm的h2o2，坐标点圆形的表示模拟环境中ph＝5.4，坐标点菱形的表示模拟环境中ph＝7.4，坐标点三角形的表示模拟环境中同时包含10mm的h2o2以及ph＝5.4)，结果表明构建的铁死亡纳米粒可以在同时满足ph＝5.4和ros的条件下快速释放rsl-3。
[0133]
实施例9：肿瘤细胞摄取带有苯硼酸酯铁死亡纳米粒的能力测定
[0134]
将panc02细胞按照5
×
104的密度种于24孔板中，24h后，当细胞处于对数生长期时
使用。将实施例4制备的两种pdba@rsl-3纳米粒和pda@rsl-3纳米粒与细胞共孵育0、4、8、12h，摄取结束后，pbs洗涤3次，然后使用流式细胞仪检测其摄取情况(这里制备的纳米粒中存在荧光染料dil(细胞膜红色荧光探针)分子，采用检测细胞内dil的荧光强度)。
[0135]
测试结果如图9所示，含有苯硼酸的pdba@rsl-3铁死亡纳米粒被肿瘤细胞摄取的量显著提高且呈时间依赖性，且比不含苯硼酸酯的pda@rsl-3铁死亡纳米粒摄取量高，这说明含有苯硼酸酯的铁死亡纳米粒可以有效的在肿瘤部位蓄积和解离释放包载的药物。
[0136]
实施例10：铁死亡纳米粒的细胞毒性测定
[0137]
将panc02细胞按照6
×
103的密度种于96孔板中，24h后，将实施例4制备的pdba@rsl-3铁死亡纳米粒以一定浓度(0.625μg/ml、1μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml)分别与细胞共孵育24h后，去除加药培养基，加入含有10％cck8的培养基，共孵育30min后，以酶标仪于450nm处测定吸光度，并计算该纳米粒的细胞毒性。
[0138]
测试结果如图10所示，pdba@rsl-3铁死亡纳米粒对panc02胰腺癌细胞表现出浓度依赖的细胞毒性，表明纳米粒被细胞摄取后，可以释放出包载的药物，致使肿瘤细胞中的药物浓度增加，抗肿瘤细胞毒性增强。
[0139]
实施例11：铁死亡纳米粒对肿瘤生长抑制效果的评价
[0140]
荷瘤小鼠模型建立：将购买的雌性balb/c裸鼠和c57/bl6小鼠饲养一周后，皮下种植panc02胰腺癌细胞(500万/只)。观测肿瘤体积约为100mm3后，将其随机分为2组，每组5只小鼠，分别尾静脉注射pbs缓冲液和pdba@rsl-3铁死亡纳米粒，每三天注射一次，共3次。每隔一天测量小鼠肿瘤体积及小鼠体重，小鼠肿瘤体积计算方法如下(l为最长直径，w为最短直径，单位为毫米)：
[0141]
v＝l
×w×
w/2；
[0142]
测试结果如图11-图14所示，铁死亡纳米粒可有效抑制肿瘤生长，抑制率约为65％，并且小鼠体重没有差异性变化，说明该纳米粒没有明显的毒副作用。
[0143]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种式i所示的响应型载药聚合物，其中，x为10-145的整数，优选为100-130的整数，进一步优选为113；y为20-80的整数，优选为55-70的整数，进一步优选为60；z为5-40的整数，优选为10-20的整数，进一步优选为15；r1各自独立地为对ph响应的酸敏感基团；r2选自c6-c12烷硫基、取代或未取代的c6-c12芳基，所述取代的取代基选自c1-c6烷基、c1-c6烷硫基；x为-l-a或-o-(ch2)
n-r3；l为连接聚合物骨架和a的连接基团；a各自独立地为衍生自青蒿素衍生物的基团；n为1-6的整数，优选为1；r3各自独立地为对h2o2响应的ros敏感基团。2.根据权利要求1所述的响应型载药聚合物，其中，r1选自如下基团：选自如下基团：表示连接位置；优选的，r1为n,n-二异丙基氨基。3.根据权利要求1所述的响应型载药聚合物，其中，r2选自c8-c12烷硫基、苯基、c1-c4烷基取代的苯基、c1-c4烷硫基取代的苯基；优选的，r2为十二烷硫基。4.根据权利要求1所述的响应型载药聚合物，其中，x为-l-a，l选自如式i1、式i2、式i3和式i4所示的基团：
其中，m1、m2各自独立地选自碳原子数为1～4的亚烷基；r4、r5各自独立地选自羰基、亚氨基、-o-；优选的，m1和m2相同；优选的，l选自如下基团：
进一步优选的，l为5.根据权利要求4所述的响应型载药聚合物，其中，x为-l-a，a的结构如下：6.根据权利要求1所述的响应型载药聚合物，其中，x为o-(ch2)
n-r3，r3的结构如下：其中，r4选自h、c1-c6烷基、卤素或nh2，优选的，r4为h。7.根据权利要求1至6任一项所述的响应型载药聚合物，其中，式i的响应型载药聚合物选自式i-1的响应型载药聚合物和式i-2的响应型载药聚合物：
其中，x、y、z、r1、r2、r3、l、a的定义同相应权利要求；优选的，式i-1的响应型载药聚合物选自如下聚合物：优选的，式i-2的响应型载药聚合物选自如下聚合物：8.一种铁死亡纳米粒，其由权利要求1-7任一项所述的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物自组装而成，优选由式i-1的响应型载药聚合物、式i-2的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物自组装而成，进一步优选式i-1的响应型载药聚合物、式i-2的响应型载药聚合物的质量比为1：1；优选地，所述铁死亡纳米粒的流体力学半径为40-150nm，更优选为40-60nm。9.权利要求8所述的铁死亡纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将式i的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物溶于有机相，然后分散于水中，所得溶液通过超滤或透析得到铁死亡纳米粒；优选地，将式i-1的响应型载药聚合物、式i-2的响应型载药聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物溶于有机溶剂中，然后分散于水中，所得溶液通过超滤或透析得到铁死亡纳米粒。10.权利要求8所述的铁死亡纳米粒在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的应用，所述恶性肿瘤优选自乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺导管癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌或黑色素瘤。

技术总结
本发明涉及一种响应型载药聚合物、铁死亡纳米粒及其制备方法和应用。铁死亡纳米粒包括以下成分：响应型青蒿素酯类聚合物、响应型的苯硼酸酯类聚合物以及小分子肿瘤铁死亡诱导药物；其中，在铁死亡纳米粒中，响应型青蒿素酯类聚合物与响应型苯硼酸酯类聚合物形成纳米载体，并通过超声的形式物理负载小分子肿瘤铁死亡诱导药物。本发明的纳米粒可荷载不同的诱导肿瘤发生铁死亡的小分子药物，通过EPR效应在肿瘤部位富集，并具有良好的肿瘤组织蓄积和滞留能力，其可响应性的敏感基团断裂，促进包载的肿瘤治疗药物的释放。载的肿瘤治疗药物的释放。载的肿瘤治疗药物的释放。


技术研发人员：于海军 王颖婕 周惠玲 刘小英 江幸羽
受保护的技术使用者：中国科学院上海药物研究所
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/7