一种抗衰老口服液在预防或治疗卵巢早衰中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体地，涉及一种抗衰老口服液的新用途，具体为一种抗衰老口服液在预防或治疗卵巢早衰中的应用。


背景技术：

2.卵巢早衰(premature ovarian failure，pof)是指女性40岁以前出现闭经或月经稀发的同时伴随着一系列围绝经期症状，如雌激素水平下降、促性腺激素水平升高，其中以血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，fsh)和黄体生成素(luteinizing hormone，lh)的浓度升高以及雌二醇(estradiol，e2)浓度下降为特征，进而出现卵巢功能减弱甚至衰竭现象的一类疾病。在一般人群中，40岁前pof的发病率为1％，30岁前的pof发病率为0.1％。pof临床表现为月经周期延长甚至闭经、生殖能力下降甚至不孕，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状，如潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，可诱发失眠、情绪变化、骨质疏松、心脑血管疾病、自身免疫性疾病等多种疾病，严重影响患者的身心健康。因此，近年来pof的模型建立和治疗受到广泛关注。
3.迄今为止，西医普遍认为pof与遗传突变、自身免疫功能异常、酶缺陷(高半乳糖血症、17-羟化酶缺乏症)、氧化应激及医源性损伤(抗肿瘤治疗、卵巢手术)、环境(病毒感染、二手烟)等多种因素有关，它们可引起卵巢颗粒细胞的凋亡。在哺乳动物的卵巢中，卵巢颗粒细胞与卵母细胞的发育密切相关，它不仅是构成卵泡壁的主要成分，还可以分泌性类固醇激素、生长因子、细胞因子等，这对卵泡的生长与维持均至关重要。卵巢颗粒细胞的凋亡可致使卵泡闭锁，导致pof的发生。而从中医的角度上看，肾虚是pof的致病之基，肝郁脾虚是致病环节，痰湿、血瘀是致病条件。肾乃先天之本，主生殖、藏精，肾中精气充足可使胞宫行经、胎孕正常，是优势卵泡形成的重要因素，肾虚则精气不足，无以滋养胞宫；脾为后天之本、气血生化之源，肝藏血、与肾同源、精血互资，肝郁脾虚使情志不畅、气血瘀滞、月经闭而不行，是卵巢早衰不可或缺的促进因素；痰湿滞留于脾阳，日久不化，加之肾虚使痰浊阻于胞宫，血淤则影响五脏，加快卵巢功能的衰竭，是重要的致病因素。pof发病机制极其复杂，至今尚未明确，同时其病因的复杂性也增加了其治疗的困难性。
4.目前，临床上治疗pof的西药以雌孕激素药为主，但其治标不治本，仅改善症状，并未恢复卵巢功能，且副作用较大。研究证实服用雌孕激素容易导致卵巢处于依赖状态，并且停药之后，症状又会反复出现，引起卵巢功能的紊乱，但长期补充雌孕激素又会增加患者患心脑血管疾病、子宫内膜癌和乳腺癌的风险。此外还有基因疗法、免疫疗法、手术治疗、干细胞移植、卵巢移植等治疗手段，由于治疗费用的高昂，大大加重了患者的家庭负担。而中医主要以补肾填精兼活血化瘀法治疗，药物多为滋肾补阴，调经药，如阳和汤加减、归肾丸加减、二仙汤和二至丸加减、逍遥散加减、左归丸等。但是没有以卵巢早衰为适应症的药物，纯中药治疗起效时间久，治疗周期长，患者依从性差，外加现有的治疗方案不可逆转卵巢颗粒细胞过度凋亡现象。因此，有必要且亟待探索安全性更好的治疗手段与疗效更佳的治疗药物。
5.本发明涉及的抗衰老口服液，为正大青春宝药业有限公司独家生产的已上市的药物(批准文号：国药准字b20021016)，其源自明永乐太医院宫廷秘方“益寿永贞膏”，以红参、生地黄、天冬、麦冬、地骨皮、茯苓为主要原料药制备而成。其中，红参具扶元固本、生津安神之效，可增加心肌营养和延缓衰老，用于妇女崩漏与一切气血津液不足之证；地黄具滋阴补血、益精填髓之效，可用于血崩，月经不调，胎动不安，阴伤便秘等症；天冬具养阴润燥、清肺生津之效，常用于阴虚发热，咳嗽吐血，咽喉肿痛，消渴等症；麦冬能滋养胃阴而生津，故可用于阴虚内热、胃阴耗伤、津少口渴等症，常与麦冬配合使用；地骨皮具凉血降火、清肺滋阴之效，用于阴虚潮热、肺热咳嗽、咯血等症；茯苓具利水渗湿，健脾化痰、宁心安神之效，可治小便不利，痰饮咳逆、遗精、健忘等症。该品说明书称其具益气养阴，宁心安神之功效、适用于中、老年体弱者因气阴两虚所致的神疲乏力、心悸气短、少气懒言、头晕目眩、潮热盗汗、耳鸣健忘、烦躁失眠。目前，尚无对于抗衰老口服液治疗卵巢早衰的文献及专利报道。


技术实现要素：

6.在此背景下，发明人提出一种抗衰老口服液的新用途，即一种抗衰老口服液在预防或治疗卵巢早衰中的应用，以解决现阶段卵巢早衰治疗费用昂贵、副作用大、依赖性强的技术问题。
7.因此，本发明的目的在于提供一种抗衰老口服液在制备预防或治疗卵巢早衰的药物中的应用，所述抗衰老口服液以红参、生地黄、天冬、麦冬、地骨皮、茯苓为主要原料药制备而成。
8.在一个实施方式中，所述抗衰老口服液由正大青春宝药业有限公司生产，国药准字b20021016。
9.在一个实施方式中，所述抗衰老口服液可以施用于哺乳动物，包括人类、小鼠等，但不限于此。
10.在一个实施方式中，所述抗衰老口服液可调节生殖内分泌激素水平。
11.在一个实施方式中，所述抗衰老口服液可增加卵巢组织内卵泡个数，减少卵巢组织形态结构损伤。
12.在一个实施方式中，所述抗衰老口服液可减少卵巢组织中tunel阳性细胞数，降低卵巢颗粒细胞的凋亡百分率。
13.在一个实施方式中，所述抗衰老口服液可改善卵巢颗粒细胞的细胞周期中g2/m期细胞百分率，促进卵巢颗粒细胞的增值。
14.本发明所述应用通过以下实验进行证明：
15.通过建立环磷酰胺(ctx)诱导大鼠卵巢早衰模型，sd大鼠采用一次性腹腔注射ctx进行造模，1周后连续观察阴道脱落细胞涂片10天，观察各组大鼠动情周期，确认是否造模成功。将造模成功的大鼠进行分组给药2周，正常组与模型组给予等量生理盐水，末次给药结束后收集血浆检测大鼠血浆中生殖内分泌激素水平并进行动物解剖取卵巢，制备石蜡切片，用于病理检测及tunel细胞凋亡检测，结果发现抗衰老口服液能明显调节卵巢早衰大鼠模型的生殖内分泌激素水平与保护卵巢组织结构损伤，降低卵巢颗粒细胞的凋亡率。同时通过制备抗衰老口服液含药血清培养卵巢颗粒细胞，并给予ctx造模24h后，检测细胞凋亡与细胞周期，结果显示抗衰老口服液含药血清可抑制卵巢颗粒细胞的凋亡、降低细胞周期
r0451)；harris苏木素液、伊红液(95％乙醇溶液)、tunel细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司(批号ba20100)。
29.1.3实验仪器
30.bsa224s精密电子天平(satorius)；d3024r低温高速离心机(scilogex)；architech i2000全自动化学发光分析仪(雅培)；全波长多功能酶标仪(thermo)；倒置显微镜(olympus cx31)。
31.2实验方法
32.2.1模型建立
33.sd大鼠采用一次性腹腔注射ctx 60mg/kg的方法造模，1周后连续观察阴道脱落细胞涂片10天，各组大鼠动情周期紊乱，动情周期延长，渐至无动情周期，视为造模成功。
34.2.2分组与给药
35.除正常组外，将造模成功的大鼠随机分为：模型组、阳性药雌二醇组(0.18mg/kg/day)、抗衰老口服液低、中、高剂量组(0.9ml/kg/day、1.8ml/kg/day、3.6ml/kg/day)，每组10只，其中中剂量组为临床等效剂量。各组大鼠分别灌胃(i.g.)给予相应的药物，正常组及模型组给予等量的生理盐水，连续给药2周。
36.2.3生殖内分泌激素水平检测
37.末次给药后，采集sd大鼠血液样本，静置30min后3000rpm离心15min收集血浆，按试剂盒说明书进行操作测定血浆内激素含量，采用化学发光法测定血浆中生殖内分泌激素雌二醇(e2)、卵泡刺激素(fsh)、促黄体生成素(lh)、孕酮(p4)水平，采用酶联免疫吸附法测定血浆中促性腺激素释放激素(gnrh)水平。
38.2.4卵巢组织形态学观察
39.末次给药后处死大鼠，取出卵巢组织，置于10％福尔马林内固定24h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制作厚度为5μm的切片。随后对切片进行二甲苯脱蜡，酒精水化，苏木素-伊红染色(he)步骤，置于光学显微镜下观察卵巢组织形态、拍照观察各级卵泡(原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、闭锁卵泡)与黄体，并对卵泡总数与黄体数进行计数统计。
40.2.5卵巢组织细胞凋亡检测
41.取卵巢组织切片，二甲苯脱蜡，酒精水化，晾干后根据tunel试剂盒说明书检测细胞凋亡情况：用proteinase k工作液37℃处理组织15-30min，加50μl tunel反应混合液(由50μl tdt+450μl生物素标记的dutp液混匀制备)于标本上避光反应60min，滴加50μl streptavidin-hrp工作液避光孵育30min，而后进行dab染色10min，期间每个步骤都用pbs冲洗3次，每次5min。用苏木素复染3s后立即用自来水冲洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，在光学显微镜下观察拍照、计数阳性凋亡细胞并计算凋亡指数。
42.2.6统计学方法
[0043]-[0044]
采用graphpad prism 5.0软件进行统计分析，数据用x
±
sd表示，两组间比较采用t-test检验，多组间比较采用单因素方差分析dunnett检验，p《0.05认为差异有统计学意义。
[0045]
3实验结果
[0046]
3.1抗衰老口服液对pof大鼠生殖内分泌激素水平的影响
[0047]
实验结果见表1。
[0048]
表1血浆生殖内分泌激素水平检测结果(n＝10)
[0049][0050]
注：与模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0051]
如表1所示，经ctx造模之后，相比于正常组，模型组大鼠血浆中的e2、gnrh、p4水平显著下降，fsh、lh水平显著升高，表现出严重的生殖内分泌激素水平紊乱现象。经过雌二醇及抗衰老口服液给药之后，e2、gnrh、p4水平明显升高，fsh、lh水平明显下降。表明抗衰老口服液低、中、高剂量均能不同程度地改善大鼠卵巢功能，调节紊乱的生殖内分泌激素水平，使其趋于正常水平，其中以高剂量效果最好。
[0052]
3.2抗衰老口服液对pof大鼠卵巢组织形态的影响
[0053]
实验结果见图1、表2。
[0054]
表2：卵泡和黄体计数结果(n＝6)
[0055][0056]
注：与模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0057]
结合图1与表2所示，正常组大鼠卵巢由皮质和髓质组成，可见原始卵泡，生长卵泡(初级卵泡和次级卵泡)、成熟卵泡，多少不等的闭锁卵泡和黄体。髓质部富含血管及疏松结缔组织，卵泡内有8～9层的颗粒细胞，排列紧凑有序。模型组大鼠病理组织检查形态学表现为卵巢内出现少数卵泡在发育过程中卵细胞退化，转变为闭锁卵泡，卵泡数和黄体数目较正常对照组显著减少，卵泡内颗粒细胞层数减少且排列紊乱。而给予雌二醇及抗衰老口服液不同剂量之后，能不同程度的增加卵巢内卵泡数量和黄体数，表明抗衰老口服液对ctx所致卵巢组织形态改变具有一定的恢复作用，提示抗衰老口服液对卵巢组织结构损伤存在明显的保护作用。
[0058]
3.3抗衰老口服液对pof大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响
[0059]
实验结果见图2、表3。
[0060]
表3：tunel细胞凋亡检测(n＝6)
[0061][0062]
注：与模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0063]
结合图2与表3所示，正常组凋亡率为(5.5
±
0.5)％，模型组凋亡率为(49.8
±
4.5)％，具显著性差异(p《0.01)；阳性药雌二醇组、抗衰老口服液低、中、高剂量组凋亡率分别为：(7.9
±
0.8)％、(37.4
±
2.8)％、(27.8
±
2.7)％、(18.5
±
1.4)％，与模型组相比，除低剂量组外，其余各给药组细胞凋亡指数均显著下降(p《0.01)，表明抗衰老口服液可明显减少pof大鼠卵巢颗粒细胞凋亡现象。
[0064]
4实验结论
[0065]
抗衰老口服液可调节生殖内分泌激素水平，增加卵巢内卵泡数量与黄体数，对卵巢组织形态的恢复效果较好，明显降低模型动物的卵巢颗粒细胞凋亡百分率，表明抗衰老口服液可促进了卵泡发育，对卵巢早衰具有明显的治疗效果，而非单纯的雌激素代替作用。
[0066]
实例2：抗衰老口服液含药血清对卵巢颗粒细胞的作用研究
[0067]
1实验材料
[0068]
1.1动物
[0069]
8-12周龄雌性sd大鼠，体重180g～220g，由南通大学提供，动物许可证号：scxk(苏)2016-0010。
[0070]
1.2药品与试剂
[0071]
抗衰老口服液由正大青春宝股份有限公司生产，批准文号：国药准字b20021016；阳性药雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片复合包装(芬吗通)购买于拜耳医药保健有限公司广州分公司，生产批号：361554；注射用环磷酰胺(ctx)购买于baxter oncology gmbh公司，生产批号91329b；annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司(批号：ba12101)；细胞周期检测试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司(批号：ba40100)。
[0072]
1.3实验仪器
[0073]
精密电子天平(satorius，型号：bsa224s)；低温高速离心机(scilogex，型号：d3024r)；倒置显微镜(olympus cx31)；荧光倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司，xd-202)；生物洁净安全柜(苏州净化设备有限公司，型号：bhc-1300a/b2)；二氧化碳培养箱(日本三洋sanyo，型号：mco-15ac)；流式细胞仪(美国bd公司，型号：accuritm c6)。
[0074]
2实验方法
[0075]
2.1大鼠含药血清制备
[0076]
以临床等效剂量的10倍剂量即18ml/kg的抗衰老口服液给雌性大鼠单次灌胃给药，给药1h后进行大鼠腹主动脉取血，离心后无菌分离血清，56℃水浴30min进行补体灭活，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，-20℃冰箱冻存备用。
[0077]
2.2卵巢颗粒细胞提取
[0078]
颈椎脱臼处死大鼠，无菌收集两侧的卵巢，置于pbs中清洗。随后放入dmem培养基的平皿中，在体视显微镜下，用25号针头刺破卵泡，释放出颗粒细胞后，用红细胞裂解液去除混杂红细胞、胰酶消化卵泡液中黏液团后，经200目不锈钢细胞筛过滤得到细胞悬液，与percoll分离液等体积混合后离心，弃上清收集颗粒细胞，于dmem培养基(含10％胎牛血清)中复悬，镜下计数，制成细胞密度为1
×
105个/ml的卵巢颗粒细胞悬液备用。
[0079]
2.3分组及处理方法
[0080]
取细胞密度为1
×
105个/ml的卵巢颗粒细胞悬液，接种于6孔板中(1ml/孔)，随机分为正常对照组、模型组、阳性药雌二醇组、抗衰老口服液低、中、高剂量组。置于37℃，5％co2培养箱中培养24h后弃掉原培养基，抗衰老口服液低、中、高剂量组分别加入不同浓度含药血清(5％、10％、20％)的培养基，其他组加入含等量正常血清的培养基，其中阳性对照药加入雌二醇组2μm。此外，除正常对照组外，其余各组加入环磷酰胺10μm，将板置于培养箱中培养24h后可用于实验，显微镜下观察各组细胞形态。。
[0081]
2.4细胞凋亡检测
[0082]
采用annexin v-egfp荧光染色试剂盒进行流式细胞术检测细胞凋亡。方法如下：
[0083]
(1)、按常规方法胰酶(不含edta)消化并收集细胞(包括培养基中悬浮的凋亡细胞)，离心(2000rpm，5min)，收集细胞沉淀，并用pbs洗涤一次。
[0084]
(2)、加入500μl结合缓冲液重悬细胞，加入5μl annexin v-egfp，5μl pi，同时设立阴性与阳性对照管，充分混匀。
[0085]
(3)、室温(20-25℃)避光孵育10-30分钟后，流式细胞仪检测分析细胞凋亡百分率。
[0086]
2.5细胞周期检测
[0087]
采用细胞周期试剂盒进行流式细胞术检测细胞周期。方法如下：
[0088]
(1)、按常规的方法用胰酶消化并收集细胞。用pbs洗涤一次，离心(2000rpm，5min)弃掉上清后。加入0.2ml pbs重新悬浮细胞，把制备好的单细胞悬液全部缓慢转移至0.8ml-20℃无水乙醇中，充分吹打均匀后放置于-20℃冰箱中过夜。
[0089]
(2)、离心(2000rpm，5min)，弃掉上清，加入1.0ml pbs重新悬浮细胞，室温放置15min。
[0090]
(3)、离心(2000rpm，5min)，弃掉上清，加100μl rnase a 37℃水浴30min；
[0091]
(4)、再加入400μl pi(50μmg/ml)染色混匀，4℃避光孵育30min；
[0092]
(5)、流式细胞仪检测记录激发波长488nm处红色荧光，分析细胞周期变化。
[0093]
2.6统计学方法
[0094]-[0095]
采用spss 17.0软件进行统计分析，数据用x
±
sd表示，两组组间比较采用t-test检验，多组间比较采用单因素方差分析dunnett检验，p《0.05认为差异有统计学意义。
[0096]
3实验结果
[0097]
3.1抗衰老口服液含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡的影响
[0098]
实验结果见表4，图3。
[0099]
表4：细胞凋亡检测结果(n＝3)
[0100][0101]
注：与模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0102]
如图3与表4中结果所示，模型组相比于正常组，早中晚期细胞凋亡率显著性升高，抗衰老口服液低剂量组、雌二醇组和模型组比较早期凋亡百分率有明显差异(p《0.05)，而抗衰老口服液中剂量、高剂量组和模型组比较仅中晚期凋亡百分率均有显著性差异(p《0.01)。表明抗衰老口服液含药血清培养卵巢颗粒细胞可明显减少其凋亡水平，抑制由ctx诱导的卵巢颗粒细胞凋亡现象。
[0103]
3.2抗衰老口服液含药血清对卵巢颗粒细胞细胞周期的影响
[0104]
实验结果见表5，图4。
[0105]
表5：细胞周期检测结果(n＝3)
[0106][0107]
注：与模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0108]
如图4与表5中结果所示，与正常组比较，模型组中g0/g1期细胞百分率显著下降，g2/m期百分率显著升高；与模型组比较，雌二醇组、抗衰老口服液中、高剂量组显著降低g2/m期细胞百分率(p《0.05)，雌二醇组、抗衰老口服液高剂量组显著升高g0/g1期细胞百分率(p《0.05)。表明ctx可诱导卵巢颗粒细胞阻滞在g2/m期，影响细胞的有丝分裂，导致细胞增殖受抑，而抗衰老口服液可降低细胞周期中g2/m期细胞百分率，改善细胞周期，从而促进卵巢颗粒细胞的增殖。
[0109]
4结论
[0110]
抗衰老口服液可通过抑制ctx引起的卵巢颗粒细胞的凋亡，增加g2/m期细胞百分率，改善细胞周期，促进卵巢颗粒细胞的增殖，从而发挥对卵巢颗粒细胞的保护作用。提示抗衰老口服液对卵巢早衰的改善作用并不局限于临床症状的缓解，还可解决其根源问题，标本兼治，对于卵巢早衰的临床治疗提供新的用药选择，为抗衰老口服液的临床应用开辟了新用途。

技术特征：
1.一种抗衰老口服液在制备预防或治疗卵巢早衰的药物中的应用，所述抗衰老口服液以红参、生地黄、天冬、麦冬、地骨皮、茯苓为主要原料药制备而成。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗衰老口服液由正大青春宝药业有限公司生产。3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗衰老口服液施用于哺乳动物。4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗衰老口服液调节生殖内分泌激素水平。5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗衰老口服液增加卵巢组织内卵泡个数，减少卵巢组织形态结构损伤。6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗衰老口服液减少卵巢组织中tunel阳性细胞数，降低卵巢颗粒细胞的凋亡百分率。7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗衰老口服液改善卵巢颗粒细胞的细胞周期中g2/m期细胞百分率，促进卵巢颗粒细胞的增值。

技术总结
本发明公开了一种抗衰老口服液在预防或治疗卵巢早衰中的应用。所述抗衰老口服液以红参、生地黄、天冬、麦冬、地骨皮、茯苓为主要原料药制备而成。本发明研究发现所述抗衰老口服液可调节生殖内分泌激素水平紊乱现象，保护卵巢组织结构损伤，抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，改善细胞周期、促进卵巢颗粒细胞的增殖而改善卵巢功能、治疗卵巢早衰。治疗卵巢早衰。


技术研发人员：叶冠 徐颖 吴若铭 刘雳 宓寅筱 周琢艳
受保护的技术使用者：正大青春宝药业有限公司
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/7