一种丁香酚时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法

1.本发明属于水产品安全快速检验
技术领域：
：，具体涉及一种丁香酚的免疫层析检测；尤其涉及一种丁香酚时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
：：2.丁香酚(eugenol)，化学名2-甲氧-4-丙烯基酚，微黄色至黄色液体，具有强烈的丁香香气，几乎不溶于水，易溶于有机溶剂，广泛存在于丁香油、肉桂叶油、肉桂皮油、樟脑油、肉豆蔻油等芳香油中。自1972年日本远藤发现丁香酚对鱼类具有强烈的麻醉效果以来，因其效果好，来源广泛，性价比高和残留期短等特点，在水产运输领域得到广泛应用。但目前，丁香酚及其同类化合物等渔用麻醉剂的安全性在国际上仍存在较大争议，相关研究表明丁香酚类物质具有肝脏毒性，美国国家毒理学计划(ntp)认为丁香酚类化合物对啮齿动物是致癌物或潜在的致癌物，世界癌症研究机构也将丁香酚列为第3类致癌物，不同国家对丁香酚的使用也存在很大的差异性，日本、澳大利亚、智利等批准异丁香酚作为渔用麻醉剂；美国、加拿大和新西兰拒绝批准丁香酚作为渔用麻醉剂使用；我国对鱼用麻醉剂丁香酚的使用尚无明确规定，但包括本实验室在内的数家单位联合调研表明，我国鲜活水产品流通环节使用的麻醉剂主要为丁香酚，并且水产品中丁香酚类药物残留检出率较高，这给市场的安全监管带来不便，存在较大的安全隐患。因此，加强丁香酚的质量安全监管，特别是开展丁香酚的检测技术研究和应用，开发高灵敏度、准确、快速的检测技术对于有效保证水产品质量安全具有重要意义。3.目前针对丁香酚的检测，主要还是以仪器分析和免疫分析技术，但是仪器分析由于分析设备价格高昂、技术操作要求高、需要专业技术人员操作、分析周期长、样品前处理过程复杂等特点，无法实现在基层和现场的快速监测和推广的目的。解超男等的《基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丁香酚》中提供了一种丁香酚的免疫层析检测方法，但其检测灵敏度仅能达到2.0mg/l，难以满足监管部门或检测机构现场检测的要求。4.时间分辨荧光免疫分析技术是继elisa、常规荧光免疫分析技术和化学发光免疫分析技术之后新的高灵敏度免疫分析技术，与常规采用荧光素作为标记物的分析技术相比，时间分辨荧光免疫分析(trfia)是以镧系稀土元素如la(镧)、er(铒)、eu(铕)和tb(铽)等为标记物的一种新兴免疫分析技术，具有激发光光谱带宽、发射光光谱带窄、荧光信噪比高、stokes位移大、非特异性荧光干扰低、荧光寿命长、自然荧光本底低、标记物稳定性好等优势，有效弥补了传统荧光素标记分析技术中背景干扰强，发射光和激发光交叉干扰严重等问题。5.因此急需找到一种能通过时间分辨荧光免疫分析技术，实现快速现场检测，且具有高灵敏度的丁香酚免疫层析检测方法。技术实现要素：6.为弥补已有技术的缺陷，本发明提供了一种丁香酚时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，通过将eu3+偶联到纳米荧光微球上，再偶联丁香酚单克隆抗体，喷涂于结合垫上；检测线包被偶联丁香酚的载体蛋白，质控线包被羊抗鼠lgg抗体，固定在反应膜上，制成免疫层析试纸条，并对试纸条的制作参数进行优化，包括偶联试剂的浓度、微球活化时间、缓冲液ph、检测线和质控线包被量、硝酸纤维素膜孔径选择等，制得的免疫层析试纸条检测灵敏度达到0.1μg/ml，与hplc测试结果拟合度良好，批内和批间变异系数分别为2％～7.33％和2.73％～6.97％，回收率是94.16％～109.27％，具有较好的准确性和精密度，可用于水产品中丁香酚残留的快速检测，为监管部门及检测机构提供了一种适用于现场快速检测的方法。7.一方面，本发明提供了一种快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条，所述试纸条包括结合垫、检测线(t)和质控线(c)；所述结合垫上含有eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体；检测线包被有偶联丁香酚的载体蛋白；质控线包被有羊抗鼠lgg抗体。8.本发明经过大量研究发现，含有稀土元素eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体，相比其他稀土元素，如la3+、ce3+、er3+、yb3+、tm3+、pr3+标记的纳米荧光微球，制备的eu3+标记的纳米荧光微球用于丁香酚检测时，eu3+标记的纳米荧光微球与丁香酚单克隆抗体偶联的效果更好，能显著提升层析试纸条的性能，提高丁香酚的检测灵敏度，其原因可能是稀土元素eu3+标记的纳米荧光微球，具有更好的空间位置结构，能更好地与丁香酚单克隆抗体偶联，制备的eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的发光特性更好，以及与丁香酚单克隆抗体(eugenol-mab)的结合能力更强。9.在一些方式中，本发明提供的试纸条包括底板、依次粘贴在底板上彼此之间紧密连接的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫。结合垫在覆盖于反应膜之上、样品垫之下，两端重叠宽度约1-2mm。10.在一些方式中，反应膜上固定有丁香酚-载体蛋白偶联物(eugenol-bsa)构成的检测线(t)和固定有羊抗鼠二抗igg构成的质控线(c)；结合垫固定有含有稀土元素eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体为标记物。样品垫将滴加至其上的反应液完全吸收，然后与结合垫上的eu3+标记荧光微球抗体发生特异性结合反应，再通过毛细管的层析作用至反应膜上进行反应。最后通过读取t/c值来判断样品中有无丁香酚，并可根据t/c值的大小来判断丁香酚的含量，可以采用仪器(荧光读数仪)读取也可以采用裸眼读取，仪器检出限相较裸眼检出限更灵敏且客观。11.在一些方式中，试纸条的底板材料可以是abs、ps、pe、pvc或pc中的任意一种。12.在一些方式中，结合垫可以采用玻璃纤维、或纤维素、或纺织聚合物中的任意一种制成。13.在一些方式中，反应膜可以采用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。14.在一些方式中，吸水垫可以采用吸水纸制成。15.在一些方式中，用于制备荧光微球的丁香酚抗体也可以为丁香酚单克隆抗体或丁香酚多克隆抗体。16.在一些方式中，偶联丁香酚的载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)，或为鸡卵清白蛋白(ova)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。17.进一步地，所述eu3+标记的纳米荧光微球的粒径为200nm。18.荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，可与丁香酚单克隆抗体共价偶联，但是不同粒径的荧光微球，其发光特性以及与抗体结合能力也存在不同，进而导致制备的试纸条对丁香酚检测灵敏度的差异，因此选择合适粒径的荧光微球对于试纸条的整体性能有重要影响。研究证明，当纳米荧光微球的粒径为200nm时，制备的试纸条在相同加样条件下，荧光条带最亮，并且t/c比值最小，灵敏度最高。19.进一步地，所述eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体中，每100μl的eu3+标记的纳米荧光微球偶联有100μg的丁香酚单克隆抗体。20.进一步地，所述结合垫中，eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的添加量为4％。21.由于eu3+标记的荧光微球和抗体通过各自表面所带的活性基团羧基和氨基形成酰胺键进行共价偶联，因此，羧基和氨基的数量会对荧光探针形成数量造成影响，当eu3+标记的荧光微球数量一定时，添加的抗体量过少，则会导致偶联率过低，影响标记效率；抗体量过多时，则会因为空间位阻等效应降低标记效果。因此必需找出针对该eu3+标记的荧光微球最合适的丁香酚单克隆抗体的添加量，才能进一步提高丁香酚的检测灵敏度。22.进一步地，所述检测线和质控线都位于硝酸纤维素膜(nc膜)上，所述硝酸纤维素膜为cn140膜，孔径为10μm，爬速为140sec/4cm。23.本发明采用德国sartorius公司旗下不同孔径的三款nc膜产品(cn95、cn140、cn150)作为反应膜制备试纸条，分别添加阴性样本和阳性样本(0.2μg/ml)进行测试，研究证明，采用cn140膜(孔径为10μm，爬速为140sec/4cm)作为反应膜制备试纸条时，荧光信号强度好，反应时间相对更快，灵敏度也相对较好。24.进一步地，其中检测线包被量为0.4mg/ml，质控线包被量为0.6mg/ml。25.t线为检测线，包被量不能过高，不然会降低试纸条灵敏度，c线为质控线，其荧光信号值不能太低，否则不易区别无效检测，亦不能太高，过高的c线荧光信号值情况下，即使t线有明显变动，根据t/c比值绘制的试纸条标曲显示结果不明显，因此，需要选择兼顾t、c线荧光强度和灵敏度的包被量。26.另一方面，本发明提供了一种用于快速检测丁香酚的纳米荧光微球的制备方法，所述方法包括以下步骤：27.(1)制备eu3+标记的纳米荧光微球；28.(2)采用mes缓冲液清洗eu3+标记的纳米荧光微球；29.(3)羧基活化：步骤(2)获得的eu3+标记的纳米荧光微球溶液中加入nhs溶液和edc溶液，孵育，加入mes缓冲液重悬沉淀；30.(4)蛋白偶联：步骤(3)获得的eu3+标记的纳米荧光微球溶液中加入丁香酚单克隆抗体，混匀，超声，室温避光旋转反应1～3h；31.(5)微球封闭。32.进一步地，步骤(1)所述的eu3+标记的纳米荧光微球制备方法为：取羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入去离子水和丙酮混合液，使得羧基化的聚苯乙烯微球的含量为1wt％，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，搅拌均匀，依次加入0.1mol/l的eu(no3)3溶液60μl、0.1mol/lβ-萘甲酰三氟丙酮150μl、0.1mol/l三辛基氧化膦150μl，室温反应16h，减压蒸馏方式去除有机溶剂，离心。33.进一步地，步骤(2)或(3)所述mes缓冲液ph为6；步骤(2)所述孵育时间为30min。34.孵育时间也就是微球活化时间，是影响含有稀土元素eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体性能的一个重要条件，活化时间过短，eu3+标记的纳米荧光微球活化不充分，与丁香酚单克隆抗体偶联率过低，从而影响试纸条灵敏度；活化时间过长，不仅影响实验或生产效率，而且会导致偶联复合物的不稳定，易造成凝集现象，影响试纸条性能。35.根据已有文献，荧光微球表面羧基处于偏酸性环境下的活化效果较好，而当偶联抗体时，偏碱性环境可确保抗体更易接近荧光微球表面的活性基团，从而提高抗体偶联率。但是本发明中，偏酸性的环境下更有利于eu3+标记的荧光微球与丁香酚单克隆抗体偶联。36.进一步地，步骤(4)所述蛋白偶联：取步骤(3)获得的eu3+标记的纳米荧光微球100μl，加入100μg的丁香酚单克隆抗体，混匀，超声，室温避光旋转反应1～3h。37.由于eu3+标记的纳米荧光微球和丁香酚单克隆抗体通过各自表面所带的活性基团羧基和氨基形成酰胺键进行共价偶联，因此，羧基和氨基的数量会对荧光探针形成数量造成影响，当eu3+标记的纳米荧光微球数量一定时，添加的抗体量过少，则会导致偶联率过低，影响标记效率；抗体量过多时，则会因为空间位阻等效应降低标记效果。因此需要选择最佳的eu3+标记的纳米荧光微球和丁香酚单克隆抗体的比例关系，从而进一步提升丁香酚的检测灵敏度。38.再一方面，本发明提供了一种快速检测丁香酚的方法，所述方法采用如上所述的试纸条进行样品检测，根据检测线与质控线的荧光强度比值来判定丁香酚的含量，检测时间为20min。39.合适的检测时间能使免疫反应充分进行，从而检测得更准确的丁香酚含量，提升丁香酚的检测灵敏度。40.本发明研制的灵敏度更高并可用于定量检测的丁香酚免疫层析试纸条，根据试纸条的检测结果进行了各组组成成分以及处理方法的优化，在试纸条的最佳优化条件下，丁香酚时间分辨免疫荧光层析试纸条的消线浓度为1.0μg/ml，裸眼检出限为0.3μg/ml，仪器检出限为0.1μg/ml，以丁香酚标样浓度的对数值为横坐标，t/c值为纵坐标可得到线性拟合方程为y＝-2.415lnx+2.5894，r2＝0.994。试纸条与hplc测试结果拟合可得到y＝-1390.1x+1767.9，r2＝0.995的方程，证明试纸条检测结果的准确性；批内和批间变异系数均小于8％，表明试纸条具有较好的精密度；37℃和50℃下的加速破坏性实验结果显示，试纸条具备较好的稳定性，有效期至少为12个月。41.本发明的有益效果为：42.1、特异性强，敏感性高。通过将eu3+偶联到纳米荧光微球上制备成时间分辨荧光微球，再偶联丁香酚单克隆抗体，从而制备试纸条，并对试纸条的制作参数进行优化，包括偶联试剂的浓度、微球活化时间、缓冲液ph、检测线和质控线包被量、硝酸纤维素膜孔径选择等，制得的疫层析试纸条检测灵敏度达到0.1μg/ml，与hplc测试结果拟合度良好，批内和批间变异系数分别为2％～7.33％和2.73％～6.97％，回收率是94.16％～109.27％，具有较好的准确性和精密度；43.2、快捷检测、简单操作、便于携带。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加80μl左右待检样品于样品垫上，在20min内即可判定检测结果，可满足丁香酚的快速、大量和便捷的现场检测，解决了检测工作中仪器周期长且昂贵、操作要求高和样品前处理过程复杂等实际问题；44.3、结果显示直观、准确。本测试纸条通过便携式荧光读数仪分别读取试纸条检测线t线和质控线c线的荧光信号强度，以及根据两者比值的t/c值，判定试样中有无丁香酚的存在，仪器检出限相较裸眼检出限更灵敏且客观，不易出现假阴性和假阳性误判；45.4、成本低，投资少。使用快速检测试纸条，只需荧光读数仪，不需另配其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用；46.5、应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。附图说明47.图1为实施例1制备的快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图；48.图2为实施例1中的快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测原理示意图；49.图3为实施例1中的快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测结果读取示意图；50.图4为实施例6中荧光标记缓冲液ph对丁香酚检测结果的影响结果示意图；51.图5为实施例7中eu3+标记的纳米荧光微球偶联丁香酚单克隆抗体含量对丁香酚检测结果的影响结果示意图；52.图6为实施例9中紫外光下不同eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体添加量对试纸条的影响结果图；53.图7为实施例10中阴性样本的试纸条动力学曲线；54.图8为实施例10中阳性样本的试纸条动力学曲线；55.图9为实施例11中荧光免疫层析试纸条的标准曲线；56.图10为实施例11中标准曲线试纸条紫外下检测结果；57.图11为实施例12中荧光免疫层析方法准确性验证结果图。具体实施方式58.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。59.实施例1本发明提供的快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备与使用60.本实施例提供的快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备包括以下步骤：61.1、丁香酚与载体蛋白的偶联62.采用碳化二亚胺法将丁香酚和牛血清蛋白bsa(或鸡卵清蛋白ova，本实施例优选牛血清蛋白)偶联得到包被原(用于固定在反应膜上)和免疫原(用于制备单克隆抗体)。具体方法如下：将0.2mmol丁香酚溶解在1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入0.25mmol的n,n-二环已基碳二亚胺(dcc)，搅拌反应15min，再加入0.25mmol的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温下搅拌反应过夜，4000rpm离心10min，吸取300μl的上清缓慢滴加到6ml溶有120mgbsa(或者ova)的cbs(碳酸盐缓冲液)溶液中，搅拌反应4h。待反应完成后，装入14000分子量的透析袋中用0.01mol/l的pbs透析3d，每天换液3-4次。取出分装于-20℃冰箱中保存。63.2、丁香酚单克隆抗体的制备64.(1)动物免疫：将免疫原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。65.(2)细胞融合和克隆：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7:1比例(数量配比)与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。66.(3)细胞冻存和复苏：将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。67.(4)单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射丁香酚药物的单克隆杂交瘤细胞株5×107个/只，7d后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到丁香酚单克隆抗体(eugenol-mab)，于-20℃保存。68.3、荧光微球的制备69.(1)制备eu3+标记的纳米荧光微球：取羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入100ml去离子水和丙酮混合液(去离子水和所述丙酮的体积比为1:1)，使得羧基化的聚苯乙烯微球的含量为1wt％，搅拌均匀，依次加入0.1mol/l的eu(no3)3溶液60μl、0.1mol/lβ-萘甲酰三氟丙酮150μl、0.1mol/l三辛基氧化膦150μl，室温反应16h，减压蒸馏方式去除有机溶剂，离心。70.(2)采用mes缓冲液清洗eu3+标记的纳米荧光微球：将eu3+标记的纳米荧光微球超声(固含量1％)2min并摇匀，取100μl于2ml离心管中，13000rpm，4℃，离心10min，弃上清，加入400μlmes缓冲液(0.05mol/l，ph6.0)，再次超声混匀后离心，重复此步骤1次，除去上清后，加入800μlmes缓冲液(0.05mol/l，ph6.0)，超声均匀；71.(3)羧基活化：加入45μl100mg/mlnhs溶液，混匀，加入25μl100mg/mledc溶液，混匀，避光室温孵育30min，13000rpm，4℃，离心10min，弃上清，加入1mlmes缓冲液重悬沉淀，超声均匀，用荧光手电观察溶液中是否有肉眼可见颗粒存在，若有，则需重新超声；72.(4)蛋白偶联：加入100μgeu3+标记的丁香酚单克隆抗体于活化好的100μl微球溶液中，旋涡混匀，反应1～2min后，超声30s，室温避光旋转反应2h；73.(5)微球封闭：蛋白偶联结束后，取下超声30s后，再加入25μl封闭液(15％bsa)，旋涡混匀，室温避光旋转反应1h后，13000rpm，4℃，离心10min，弃上清，除去未偶联的抗体，加入100μl微球复溶液，超声2min重悬沉淀后于4℃避光保存备用。74.4、试纸条的组装75.将样片垫、结合垫、吸水垫分别粘贴于已粘有烘干nc膜的pvc底板上，按如图1所示结构安装，其组装顺序如下：76.①贴nc膜：于尺寸为60mm×300mm的pvc底板上的相应位置贴上nc膜，随后进行划膜操作，c线在t线上方，包被羊抗鼠二抗和固定化抗原；②贴吸水垫：将吸水垫裁剪至17mm×300mm的尺寸，粘贴于nc膜上方靠近c线处，与nc膜上端边缘重叠1.8-2mm；③贴结合垫：将喷有荧光微球标记抗体的结合垫沿荧光条带边缘裁剪，粘贴于nc膜下方靠近t线处，与nc膜下端边缘重叠1-1.5mm；④贴样品垫：将尺寸为17mm×300mm的样品垫贴于结合垫下方；⑤切条：通过切条机将已粘贴好的pvc底板切割成60mm×4mm的尺寸，装入对应卡壳即可，放入装有干燥剂的密封袋中4℃避光保存。77.5、丁香酚快速检测免疫层析试纸条反应原理78.分别吸取80μl阴性和阳性样本，滴加于卡壳加样孔，等待15min反应时间，等待显色。其显色原理(如图2)：样品溶液在毛细管作用下延试纸条向上运动，并在反应膜上进行竞争反应。溶液中不含丁香酚的阴性样本，借助层析作用使结合垫上包被带有荧光标记的丁香酚抗体与t线上固定化完全抗原特异性结合，剩余抗体与c线上固定的羊抗鼠igg结合，在紫外光照射下，t、c线均显色，形成明亮的橘红色条带；溶液中含有丁香酚的阳性样本，首先与结合垫上包被带有荧光标记的抗体特异性结合，然后剩余未结合的抗体再与t线固定化抗原结合，随着丁香酚浓度的增加，与t线抗原结合的荧光探针抗体减少，荧光条带颜色变浅，直至消失，然后试样中的抗原抗体结合物及未结合的抗体，继续向上层析与c线固定的羊抗鼠二抗结合，c线显色。79.6、检测样品液的制备：80.收集水产品检测运输过程中的养殖水，离心取出固体杂质，即可。81.7、检测操作方法：从包装袋中取出试纸条，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约80μl)，加样后开始计时，结果应在20min读取。82.8、检测结果定性判断：83.分别吸取80μl阴性和阳性样本，滴加于卡壳加样孔，在荧光手电的照射下，可清晰看到带有eu3+标记的纳米荧光微球在毛细管作用下快速向上进行层析运动，经过nc膜时，与固定在上面的包被抗原和羊抗鼠二抗进行反应，从而使t线和c线显色，15min反应时间后判读显色结果。试纸条显色结果如图3所示：如果在荧光或紫外照射下纤维素膜上t线比c线颜色浅(两条亮橘色标记“ⅱ”)或只有c线出现(一条亮橘色标记“ⅰ”)，两条亮橘色标记“ⅱ”显示，且读数结果t/c《1，检侧结果呈阳性，表示在被检测样品液中含丁香酚药物，如果丁香酚药物快速检测试纸条上的纤维素膜上出现两条亮橘色标记“ⅱ”，t线比c线颜色深或一样深，并且读数t/c≥1，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含丁香酚药物成份，如未出现c线，可能操作不当或试剂板已失效。84.9、检测结果定量判读：丁香酚标样浓度与t/c值呈线性关系，制备标准曲线，可定量检测丁香酚浓度(详见实施例12)。85.实施例2不同稀土元素标记纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体对丁香酚检测结果的影响86.本实施例按照实施例1提供的方法制备层析试纸条，其中分别采用lacl3、ce2(so4)3、eu(no3)3、ercl3、ybcl3、tm(no3)3、pr(no3)3溶液，制备la3+、ce3+、eu3+、er3+、yb3+、tm3+、pr3+标记的纳米荧光微球，再经活化后分别与丁香酚当克隆抗体偶联，标记完成的eu-eugenol-mab，使用喷金划膜仪，喷涂于结合垫，喷量为2.0μl/cm，再分别于样品垫、nc膜、吸水垫组装成试纸条，检测同一浓度的加标样本，每组试纸条重复检测5次，并通过荧光免疫层析试纸条读数仪(fic-s2011-b20，helmen公司)，读取t、c线的荧光强度综合比较，选择较优荧光微球。向制备完成的不同荧光微球的试纸条加样孔内，分别加入80μl的阴性样本，层析反应15min后，记录试纸条t线和c线荧光信号强度，结果如表1所示。87.表1、不同荧光微球的荧光信号强度88.table1fluorescencesignalintensityofdifferentfluorescentmicrospheres[0089][0090]因此由表1的数据结果可得，采用不同的稀土元素标记荧光微球时，制备的荧光微球-丁香酚单克隆抗体，用于制备免疫层析试纸条后，对样本中丁香酚的检测灵敏度有着非常显著的影响，当采用eu3+标记荧光微球时，层析试纸条检测的t线和c线的荧光信号强度均最高，表明其荧光条带最亮，并且在相同加样条件下，t/c比值明显小于la3+、ce3+、er3+、yb3+、tm3+、pr3+标记的纳米荧光微球。可见，eu3+标记的纳米荧光微球与丁香酚单克隆抗体偶联的效果更好，能显著提升层析试纸条的性能，提高丁香酚的检测灵敏度，其原因可能是稀土元素eu3+标记的纳米荧光微球，具有更好的空间位置结构，能更好地与丁香酚单克隆抗体偶联，制备的eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的发光特性更好，以及与丁香酚单克隆抗体(eugenol-mab)的结合能力更强。因此为了提高免疫荧光层析试纸条对丁香酚的检测灵敏度，后续实施例都选择eu3+标记荧光微球。[0091]实施例3eu3+标记荧光微球的粒径对丁香酚检测结果的影响[0092]本实施例按照实施例1提供的方法制备层析试纸条，其中纳米荧光微球选择以下三种不同粒径的以eu3+标记荧光微球(详见表2)为研究对象，进行试纸条的优化。各取上述三种荧光微球100μl于2ml离心管中，并编号为1号、2号、3号，按照上文微球活化方法进行活化并与抗体偶联，标记完成的eu-eugenol-mab，使用喷金划膜仪，喷涂于结合垫，喷量为2.0μl/cm，再分别于样品垫、nc膜、吸水垫组装成试纸条，检测同一浓度的加标样本，每组试纸条重复检测5次，并通过荧光免疫层析试纸条读数仪(fic-s2011-b20，helmen公司)，读取t、c线的荧光强度综合比较，选择较优荧光微球。向制备完成的不同荧光微球的试纸条加样孔内，分别加入80μl的阴性样本，层析反应15min后，记录试纸条t线和c线荧光信号强度，结果如表3所示。[0093]表2、荧光微球信息表[0094]table1theinformationoffluorescentmicrosphere[0095][0096]表3、不同荧光微球的荧光信号强度[0097]table2fluorescencesignalintensityofdifferentfluorescentmicrospheres[0098][0099]因此由表3的分析数据结果可得，选择合适的eu3+标记荧光微球对于试纸条的整体性能有重要影响，2#的eu3+标记荧光微球t线和c线的荧光信号强度均最高，表明其荧光条带最亮，并且在相同加样条件下，t/c比值最小，表明相对于1#和3#的eu3+标记荧光微球试纸条，2#荧光微球试纸条灵敏度最好。其原因可能是，eu3+标记的荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，可与蛋白或抗体上共价偶联，但是不同粒径的eu3+标记荧光微球的发光特性以及与抗体结合能力不同，进而导致实验结果的差异。[0100]因此eu3+标记荧光微球的粒径应选择200nm，此时检测丁香酚的灵敏度最高，后续实施例都选择2#的粒径为200nm的eu3+标记荧光微球进行研究。[0101]实施例4不同nc膜对丁香酚检测结果的影响[0102]nc膜在胶体金试纸中用做t/c线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。一般有2个分类标准，首先是根据膜孔径μm，但由于膜生产过程中的非绝对均一，膜的孔径也是非绝对均一的，于是就有了以水层析每4cm膜的时间s为第二个标准。[0103]本实施例在实施例1的基础上，选择2#的粒径为200nm的eu3+标记荧光微球进行研究，选择sartorius公司的三种不同孔径和爬速的硝酸纤维素膜(nc膜)，三种nc膜的规格见表4，粘贴于pvc底板上，将稀释至合适浓度的抗原(eugenol-bsa)和羊抗鼠二抗分别倒吸入对应划膜仪管中，设置喷金划膜仪参数为划膜量1μl/cm，划膜长度为300mm，将完成t线和c线划膜的放置于37℃恒温烘箱中过夜，第二日分别于不同nc膜制成的试纸条上滴加80μl的阴性样本0μg/ml和阳性样本0.2μg/ml进行荧光强度和灵敏度等性能测试，每组样本重复5次，选择最适膜，检测结果如表5所示。[0104]表4、硝酸纤维素膜性能表[0105]table3theinformationofnitrocellulosefiltermembrane[0106][0107]表5、不同硝酸纤维素膜的荧光信号强度[0108]table4fluorescencesignalintensityofdifferentnitrocellulosefiltermembrane[0109][0110]由表5的结果可见，不同规格的nc膜对抗体的吸附能力存在不同差异，且试纸条进行免疫层析的速度亦不同，影响抗原抗体特异性结合的时间，进而对灵敏度起到影响，cn95层析反应速度最快，cn140的荧光信号强度最好，cn150的灵敏度最好，其原因可能是，膜孔径越小灵敏度越高，但是同时跑板速度也越慢，增加了非特异性结合的机会，假阳性概率越高，因此要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点至关重要。根据实际试纸条使用情况，综合考虑选择荧光信号强度好，反应时间相对更快，灵敏度也相对较好的cn140膜。[0111]实施例5eu3+标记的荧光微球活化时间对丁香酚检测结果的影响[0112]本实施例按照实施例1提供的方法制备试纸条，在使用edc/nhs两步法活化eu3+标记的荧光微球过程中，结束微球清洗步骤后，进行羧基活化步骤时分别设置避光室温孵育活化时间为10、20、30和40min，其他步骤均不变。将不同活化时间的eu3+标记的荧光微球与等量抗体进行偶联，制备试纸条，分别添加阴性样本和阳性样本(0.2μg/ml)于不同微球活化时间的试纸条中，每组试纸条重复平行5次，记录荧光免疫层析试纸条读数仪显示的t、c线荧光信号强度，并计算抑制率，比较对试纸条t线和c线信号强度和灵敏度等的影响，确定最佳活化时间。结果详见表6。[0113]表6、活化时间对荧光信号值的影响[0114]table5effectofactivationtimeonfluorescencesignalvalue[0115][0116]抑制率＝(b0-b)/b0，其中b是阳性样本的t/c比值，b0是阴性样本的t/c比值。[0117]分析表6的数据可知，微球活化时间是影响荧光微球性能的一个重要条件，10或20min活化时间并不充分，管壁可见聚沉现象，且t、c线荧光信号强度过低，误差较大，其原因可能是eu3+标记的荧光微球活化不充分，与抗体偶联率过低，从而影响试纸条灵敏度；活化40min的eu3+标记的荧光微球，其t、c线的信号值均略高于活化30min的eu3+标记的荧光微球，但抑制率不如活化30min，其原因可能是活化时间过长，影响实验或生产效率，而且会导致偶联复合物的不稳定，影响试纸条性能；且活化30min和活化40min两者皆无聚沉现象存在，溶液稳定，因此选择微球活化时间为30min。[0118]实施例6荧光标记缓冲液ph对丁香酚检测结果的影响[0119]本实施例按照实施例1提供的方法制备试纸条，其中，eu3+标记的荧光微球经羧基活化30min后，分别加入不同ph(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的mes缓冲液重悬沉淀，超声均匀，其他步骤不变，用等量的eu3+标记的荧光微球与丁香酚单克隆抗体偶联，综合比较不同ph条件下制成的试纸条性能，确定最佳荧光标记缓冲液ph。用等量样本进行点样测试，每组重复5次，记录荧光免疫层析试纸条读数仪显示的t、c线荧光信号强度，检测结果如图4所示。[0120]根据图4可以看出，试纸条t线和c线荧光信号值，以及两者t/c比值，分析可得偏酸性环境更适合活化eu3+标记的荧光微球与丁香酚单克隆抗体的偶联，标记缓冲液ph为6时，试纸条两线荧光信号值最大且灵敏度最佳。[0121]根据已有文献，荧光微球表面羧基处于偏酸性环境下的活化效果较好，而当偶联抗体时，偏碱性环境可确保抗体更易接近荧光微球表面的活性基团，从而提高抗体偶联率。但是本实施例中，偏酸性的环境下更有利于eu3+标记的荧光微球与丁香酚单克隆抗体偶联，且能提高丁香酚的检测灵敏度。其原因可能是eu3+标记的荧光微球具有疏水性质，在偏碱性环境易因颗粒浓度、表面电荷基团作用和电解质浓度等原因导致团聚，因此更适宜偏酸性的环境才能提高eu3+标记的荧光微球与丁香酚单克隆抗体的偶联率。[0122]实施例7荧光微球中的抗体标记量对丁香酚检测结果的影响[0123]本实施例按照实施例1提供的方法制备试纸条，其中，分别将100μl活化好的eu3+标记的荧光微球加入标有编号1-7的2ml离心管中，然后从编号1至7分别向离心管中加入等体积的浓度分别为0、20、40、60、80、100和120μg/ml的丁香酚单克隆抗体进行偶联，用相同体积的不同抗体标记量的荧光探针检测阴性样本，读取t/c线荧光强度比较分析的同时，并用微量紫外定量检测仪测定离心管离心之后上清液中抗体浓度，从而得上清中抗体含量，计算出抗体偶联率，偶联率(％)＝(总抗体含量-上清抗体含量)/总抗体含量×100％，确定最适抗体标记量，结果如图5所示。[0124]根据图5可见，随着抗体浓度的增加，抗体偶联率先小幅度变动，当抗体浓度为20至80μg/ml时，抗体偶联率基本稳定在97％左右，然后当抗体浓度超过80μg/ml时，偶联率明显下降，说明此时溶液中抗体已过量。因为由于eu3+标记的荧光微球和抗体通过各自表面所带的活性基团羧基和氨基形成酰胺键进行共价偶联，羧基和氨基的数量会对eu3+荧光探针形成数量造成影响，当荧光微球数量一定时，添加的抗体量过少，则会导致偶联率过低，影响标记效率；抗体量过多时，则会因为空间位阻等效应降低标记效果。因此最佳抗体标记量为80μg/ml，在实际中为保证尽可能多的抗体被偶联，选择抗体标记量为100μg/ml。[0125]实施例8t、c线包被量对丁香酚检测结果的影响[0126]在免疫层析反应中，t线上固定的eugenol-bsa完全抗原会与待测丁香酚抗原结合完之后所剩余的荧光标记抗体结合，形成包被抗原-荧光微球偶联丁香酚抗体复合物；而c线上固定的羊抗鼠二抗则会捕捉与待测丁香酚抗原结合的荧光标记抗体，形成包被二抗-荧光微球偶联丁香酚抗体-待测丁香酚抗原复合物。[0127]本实施例按照实施例1提供的方法制备试纸条，其中，设置喷金划膜仪参数为划膜量1μl/cm，于粘贴好有硝酸纤维素膜(nc膜)的pvc底板上，包被不同浓度组合的检测线t线和质控线c线，通过比较t和c线各自荧光强度以及t/c比值，综合考虑，确定最优组合。[0128]t线为检测线，包被量不能过高，不然会降低试纸条灵敏度，c线为质控线，其荧光信号值不能太低，否则不易区别无效检测，亦不能太高，过高的c线荧光信号值情况下，即使t线有明显变动，根据t/c比值绘制的试纸条标曲显示结果不明显，因此，需要选择兼顾t、c线荧光强度和灵敏度的包被量。根据前期实验选择如表7所示的6组t、c线包被量组合进行阴性样本点样测试，结果见表7。[0129]表7、不同t线和c线包被量对荧光信号值的影响[0130]table6effectsofdifferentcoatingamountsoft-lineandc-lineonthefluorescencesignalvalue[0131][0132]由表7可见，当两线包被量较低时，t/c比值最低，此时理论上灵敏度最好，但荧光信号强度过低，在紫外光照射下，荧光条带较浅，难以用肉眼清晰辨别，且t线更容易产生较大误差；提高包被量时，t/c线比值明显增大，灵敏度显著降低。其原因主要是，t线和c线的包被浓度过低，则会影响荧光强度过低，更容易造成试纸条读数误差，不利于试纸条的稳定性；包被浓度过高，对微量检测不敏感，会降低试纸条的灵敏度。因此，需要综合考虑选择合适比例的t和c线包被浓度，结合实际情况，选择c线包被量为0.6mg/ml，t线包被量为0.4mg/ml。[0133]实施例9结合垫上偶联微球量对丁香酚检测结果的影响[0134]本实施例按照实施例1提供的方法制备试纸条，分别设置eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的添加量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％和8％，以2.0μl/cm的喷量喷涂于结合垫，组装成试纸条，根据荧光读数仪上t/c荧光信号强度，选择在相同反应时间内，试纸条的结合垫中，荧光强度和灵敏度均较好且未出现假阳性的最适eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的添加量，检测结果如表8和图6所示，其中图6为紫外光下不同eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体添加量对试纸条的影响结果图。[0135]表8不同eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体添加量检测结果[0136]table7detectionresultsofdifferentfluorescentlylabeledantibodiesadded[0137][0138]由表8可见，结合垫中eu3+标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的添加量也会影响荧光信号的高低。在相同喷量2μl/cm条件下，相同反应时间内，带有荧光标记抗体的添加量较低时，t、c线荧光条带颜色浅，难以用肉眼清楚辨别，随着添加量的增加，t、c线荧光信号强度随之增强，t/c比值亦随之增大，影响试纸条灵敏度。根据图6，在紫外灯照射下的实际情况，选择添加量为4％时，此时t、c线颜色接近，且明亮清晰可见，灵敏度较好。[0139]实施例10免疫时间的选择[0140]本实施例按照实施例1提供的方法制备试纸条，分别添加阴性样本和阳性样本进行点样测试，记录开始免疫反应之后的5、10、15、20、25和30min内的检测试纸条的t、c线荧光强度以及t/c线比值，并根据反应时间每隔5min，使用荧光免疫层析试纸条读数仪对t线及c线进行荧光信号强度的记录，以试纸条免疫层析反应时间为横坐标，t、c线荧光信号强度以及t/c比值为纵坐标绘制试纸条动力学曲线如图7和8所示，其中图7为阴性样本的试纸条动力学曲线，图8为阳性样本的试纸条动力学曲线。[0141]有图7和8可知，随着免疫层析反应时间的进行，越来越多抗体以及抗原抗体复合物流向t、c线，被线上包被的固定化抗原和羊抗鼠igg捕获，荧光信号强度逐渐增强，当免疫时间超过20min时，变化趋势减缓，趋于稳定，故最佳检测时间是反应开始后20min。[0142]实施例11试纸条灵敏度的验证[0143]本实施例根据上述实施例优化条件制备丁香酚免疫层析试纸条，分别向阴性样本中加入分别添加不同浓度的丁香酚标样(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0μg/ml)，制备不同浓度的丁香酚标准品溶液，滴加在试纸条上，每个浓度重复检测5次，以试纸条t/c比值为纵坐标，丁香酚标准品浓度的指数值为横坐标，绘制标准曲线(见图9)，图10为标准曲线试纸条紫外下检测结果。[0144]由图9可知，0.05μg/ml到0.4μg/ml之间，丁香酚标样浓度的对数值与t/c值主要呈线性关系，线性方程为y＝-2.415lnx+2.5894，r2＝0.994，由仪器读数结果可得，当丁香酚标样浓度大于0.1μg/ml，t/c比值≤0.94，根据判断标准，为阳性结果。由图9和图10可知，当丁香酚标样添加浓度为0.3μg/ml时，裸眼可在紫外灯照射下明显看出与阴性样本的区别，当丁香酚标样添加浓度为1.0μg/ml时，t线消失。[0145]综上所述，丁香酚免疫荧光层析试纸条消线浓度为1.0μg/ml，裸眼检出限为0.3μg/ml，仪器检出限为0.1μg/ml。[0146]实施例12试纸条精密度与准确性的验证[0147]本实施例建立丁香酚浓度的hplc标曲，分别使用实施例1提供的荧光免疫层析试纸条和hplc仪器共同检测加标浓度为0.1、0.15、0.2、0.3和0.4μg/ml的阴性样本，计算试纸条检测丁香酚的回收率，验证试纸条检测丁香酚的准确性。对试纸条进行加标回收验证，同精确度高的仪器检测结果进行比较，要求回收率一般正负偏差在15％之内，即测定值与真实值的差异不超过15％。[0148]用试纸条的批内和批间变异系数来表示批内和批间误差，从而来体现试纸条的精密性。批内变异系数是对同一批次的荧光免疫层析试纸条分别定量检测0.1、0.15、0.2、0.3和0.4μg/ml5个浓度加标样品的t线和c线信号值，以及t/c比值，并对这些数据进行离散程度分析，每组浓度重复测定5次；批间变异系数是对不同批次的荧光免疫层析试纸条分别定量检测0.1、0.15、0.2、0.3和0.4μg/ml5个浓度加标样品的t线和c线信号值，以及t/c比值，并对这些数据进行离散程度分析，每组浓度重复测定5次。[0149]检测结果见表9。由表9可以看出，试纸条回收率基本稳定在94％-109％之间，且批内和批间变异系数均小于8％，呈现出良好的精密度。在相同加标浓度下以试纸条的检测结果作为横坐标，hplc的检测结果作为纵坐标，建立坐标轴，并进行线性拟合，得到方程为y＝-1390.1x+1767.9，r2＝0.995，详见图11。由此判断，试纸条与hplc检测结果具有良好的一致性。[0150]表9荧光免疫层析试纸条与hplc方法对比[0151]table8comparisonoffluorescentimmunochromatographicteststripsandhplcmethods[0152][0153]实施例13试纸条稳定性验证[0154]本实施例制备的丁香酚免疫荧光试纸条主要包含2个主要部分，分别是试纸条和荧光探针，试纸条可常温保存，荧光探针需保存于4-8℃，为验证试纸条的保存期限和稳定性，将同一批次试纸条分成2袋，密封保存，其中一袋放置于50℃烘箱中一个月，相当于常温一年的效果，进行加速破坏稳定性实验，每7天取出测定其t/c比值，另一袋置于37℃烘箱中一个月进行对照。分别使用中低高三中浓度加标阴性样本进行测试，记录不同时间段内的t/c值，结果如表10所示。[0155]表10免疫层析试纸条的稳定性测试[0156]table9stabilitytestofimmunochromatographicteststrips[0157][0158]根据表10中的结果，分析得在37℃和50℃温度下，保存7d、14d以及28d的试纸条t/c值基本无大幅度变化，比较稳定，可以满足常温1年条件下的正常使用。[0159]本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里的所谓的“一个”仅仅表示“一”的意思，而不排除仅仅只是包括一个，也可以表示包括2个以上。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种快速检测丁香酚的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括结合垫、检测线和质控线；所述结合垫上含有eu
3+
标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体；检测线包被有偶联丁香酚的载体蛋白；质控线包被有羊抗鼠lgg抗体。2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述eu
3+
标记的纳米荧光微球的粒径为200 nm。3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述eu
3+
标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体中，每100μl的eu
3+
标记的纳米荧光微球偶联有100μg的丁香酚单克隆抗体。4.如权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述结合垫中，eu
3+
标记的纳米荧光微球-丁香酚单克隆抗体的添加量为4%。5.如权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述检测线和质控线都位于硝酸纤维素膜上，所述硝酸纤维素膜为cn140膜，孔径为10μm，爬速为140sec/4cm。6.如权利要求5所述的试纸条，其特征在于，检测线包被量为0.4 mg/ml，质控线包被量为0.6 mg/ml。7.一种用于快速检测丁香酚的纳米荧光微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备eu
3+
标记的纳米荧光微球；采用mes缓冲液清洗eu
3+
标记的纳米荧光微球；羧基活化：步骤（2）获得的eu
3+
标记的纳米荧光微球溶液中加入nhs溶液和edc溶液，孵育，加入mes缓冲液重悬沉淀；蛋白偶联：步骤（3）获得的eu
3+
标记的纳米荧光微球溶液中加入丁香酚单克隆抗体，混匀，超声，室温避光旋转反应1~3 h；微球封闭。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2）或（3）所述mes缓冲液ph为6；步骤（2）所述孵育时间为30min。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述蛋白偶联：取步骤（3）获得的eu
3+
标记的纳米荧光微球溶液100 μl，加入100 μg的丁香酚单克隆抗体，混匀，超声，室温避光旋转反应1~3 h。10.一种快速检测丁香酚的方法，其特征在于，采用如权利要求1~6任一项所述的试纸条进行样品检测，根据检测线与质控线的荧光强度比值来判定丁香酚的含量，检测时间为20 min。

技术总结
本发明提供了一种丁香酚时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，通过将Eu


技术研发人员：金仁耀 翟璐 杨加成
受保护的技术使用者：浙江工商大学
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/7