检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒及其检测方法与流程

1.本技术涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.免疫球蛋白轻链由可变区(v区)、连接区(j区)和恒定区(c区)组成，重链由可变区(v区)、铰链区(d区)、连接区(j区)和恒定区(c区)组成，分别由v、d、j和c基因片段编码。在生物体内，v、d和j基因片段均有多个拷贝，在b淋巴细胞发育过程中，不同v、d和j基因片段随机组合形成具有功能的免疫球蛋白的过程即为基因重排，因此，成熟b淋巴细胞中携带特异的重排序列。在正常生理条件下，b淋巴细胞中携带的免疫球蛋白重排序列是相对均一的，不同序列占比相差不大，表现为“多克隆性重排”；在淋巴瘤发生过程中淋巴细胞失去正常功能而恶性增殖，该过程伴随其携带的特异的重排序列所占比例极大的增加，表现为“克隆性重排”。因此，通过对免疫球蛋白基因重排进行检测，判断其为“多克隆性重排”或“克隆性重排”，即可以判断患者为正常的淋巴结肿大还是淋巴瘤。
3.传统淋巴瘤诊断方法主要包括组织病理学、免疫学等，但是检出率低，容易误判。免疫球蛋白基因重排检测能够辅助淋巴瘤诊断，提高诊断准确率。目前，b细胞淋巴瘤基因重排检测igh和igk基因，常用的检测方法包括pcr-凝胶电泳法、pcr-毛细管电泳法、pcr-高通量测序法，但上述方法均存在不同程度的问题：pcr-凝胶电泳法主要依赖于重排基因长度进行判断，分辨率低；pcr-毛细管电泳法分辨率高于pcr-凝胶电泳法，具有单碱基分辨率，但是对于长度一致的重排基因无法区分；pcr-高通量测序法分辨率高，能够确定每个克隆的具体序列，检测准确率高，但是该方法依赖于多重pcr进行文库构建，而多重pcr导致的扩增偏倚对检测结果存在极大干扰，部分样本会诊断错误。因此，开发新的基因重排检测方法具有非常重要的意义。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒，以有效降低多重pcr的扩增偏倚，提高测序的均一度和检测准确度。具体技术方案如下：
5.本技术第一方面提供了一种检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒，其中，所述试剂盒包含正向引物、反向引物和接头引物，所述反向引物中依次包含能与免疫球蛋白重链基因特异性结合的核苷酸序列、随机标签和高通量测序平台适用的测序接头的核苷酸序列。
6.在本技术一些实施方式中，所述反向引物中的所述随机标签的碱基数目为6-8个。
7.在本技术一些实施方式中，所述反向引物为核苷酸序列如seq id no:1所示的单链dna分子，或seq id no:1经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:1具有相同功能的单链dna分子。
8.在本技术一些实施方式中，所述正向引物为核苷酸序列如seq id no:2-20所示的单链dna分子，或seq id no:2-20各自独立地经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或
插入且与seq id no:2-20具有相同功能的单链dna分子。
9.在本技术一些实施方式中，所述接头引物为核苷酸序列如seq id no:21所示的单链dna分子，或seq id no:21经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:21具有相同功能的单链dna分子。
10.在本技术一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps和水。
11.本技术第二方面提供了本技术第一方面所提供的试剂盒在检测免疫球蛋白基因重排中的用途。
12.本技术第三方面提供了一种检测免疫球蛋白基因重排的方法，其中，所述方法包括步骤：采用本技术第一方面提供的试剂盒对待测样本进行三轮多重pcr扩增，纯化后得到测序文库；
13.将所述测序文库进行高通量测序，分析测序结果，判断是否存在克隆性基因重排；其中，判定存在所述克隆性基因重排满足以下条件的至少一者：(1)占最高比例的克隆与第二比例的克隆的比值＞2；(2)占第二比例的克隆与第三比例的克隆的比值＞2。
14.在本技术一些实施方式中，第一轮pcr扩增体系包括：0.2-0.6μmol/l反向引物、1-2ng/μl待测样本dna、0.02-0.03u/μl dna聚合酶、50-200μmol/l dntps；第二轮pcr扩增体系包括：0.2-0.4μmol/l正向引物、0.2-0.4μmol/l接头引物、0.02-0.03u/μl dna聚合酶、50-200μmol/l dntps、每μl第二轮pcr扩增体系中包含0.2-0.3μl纯化的第一轮pcr扩增产物；第三轮pcr扩增体系包括：50-200μmol/l dntps、每μl第三轮pcr扩增体系中包含0.3-0.5μl纯化的第二轮pcr扩增产物、每μl第三轮pcr扩增体系中包含0.05-0.15μl hieffstubby udi primer kit for或tianseq单索引接头。
15.在本技术一些实施方式中，第一轮pcr扩增条件包括：预变性：93-95℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；一次退火：65-67℃，1.8-2.2min；二次退火：63-64℃，3.5-4.5min；三次退火：61-62℃，1.8-2.2min；延伸：67-69℃，0.8-1.2min；1个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min；第二轮pcr扩增条件包括：预变性：93-95℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；一次退火：63-64℃，28-32s；二次退火：61-62℃，28-32s；延伸：67-69℃，12-18s；17-19个循环；完成循环后继续67-69℃延伸9-11min；第三轮pcr扩增条件包括：预变性：94-96℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；退火：59-61℃，28-32s；延伸：67-69℃，28-32s；15-25个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。
16.本技术提供的检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒，在靶向igh连接区(j区)的反向引物中连接随机标签，采用该反向引物进行pcr扩增，扩增产物经过测序可以获得目的片段及随机标签序列，其能够有效消除pcr扩增导致的偏倚，能够显著提高测序的均一度和检测准确度；可以用于非诊断或治疗目的的免疫球蛋白基因重排检测。
17.当然，实施本技术的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
18.为了更清楚地说明本技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
19.图1为本技术提供的检测免疫球蛋白基因重排的方法中测序文库的构建示意图。
具体实施方式
20.下面将结合本技术中的附图，对本技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员基于本技术所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
21.本技术第一方面提供了一种检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒，其中，所述试剂盒包含正向引物、反向引物和接头引物，所述反向引物中依次包含能与免疫球蛋白重链基因特异性结合的核苷酸序列、随机标签和高通量测序平台适用的测序接头的核苷酸序列。
22.本技术所述的随机标签，是指碱基任意地选自a、c、t或g的一段核苷酸序列。
23.本技术所述的免疫球蛋白(immunoglobulins，ig)，是指具有抗体活性或化学结构的球蛋白，由两条相同的轻链(igk或igl)和两条相同的重链(igh)通过二硫键连接组合而成的四聚体。
24.本技术在靶向igh连接区(j区)的反向引物中连接随机标签，采用该反向引物进行pcr扩增，扩增产物经过测序可以获得目的片段及随机标签序列，其能够有效消除pcr扩增导致的偏倚，能够提高测序的均一度和检测准确度；特异性好。
25.在本技术的一些实施方式中，所述随机标签的碱基数目为6-8个，优选为8个。
26.在本技术的一些实施方式中，所述反向引物为核苷酸序列如seq id no:1所示的单链dna分子，或seq id no:1经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:1具有相同功能的单链dna分子。本技术提供的反向引物特异性好。
27.本技术所述的反向引物，为靶向igh连接区(j区)的反向引物，其可以具有如seq id no:1所示的核苷酸序列；也可以具有seq id no:1经过1个或多个核苷酸突变后的核苷酸序列，且具有与seq id no:1所示的核苷酸序列相同的功能；其中，多个可以为2个以上、2-10个、2-5个、2个或3个；核苷酸突变的方式包括替换、缺失或插入。
28.优选地，本技术的靶向igh连接区(j区)的反向引物的核苷酸序列为：5
’‑
gactggagttcagacgtgtgctcttccgatcnnnnnnnncttacctgaggagacggtgacc-3’(seq id no:1)，其中的“n”各自独立地选自a、c、t或g。
29.在本技术的一些实施方式中，所述正向引物为核苷酸序列如seq id no:2-20所示的单链dna分子，或seq id no:2-20各自独立地经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:2-20具有相同功能的单链dna分子。
30.本技术所述的正向引物，为靶向igh可变区(v区)fr1、fr2和fr3区域的正向引物，其可以分别具有如seq id no:2-20所示的核苷酸序列；也可以分别具有seq id no:2-20经过1个或多个核苷酸突变后的核苷酸序列，且具有与seq id no:2-20所示的核苷酸序列相同的功能；其中，多个可以为2个以上、2-10个、2-5个、2个或3个；核苷酸突变的方式包括替换、缺失或插入。
31.本技术提供的正向引物特异性好，且包含靶向igh可变区fr1、fr2和fr3区域的正向引物，能够有效覆盖所有igh基因重排，能够有效确定每个igh基因重排的克隆，提高淋巴瘤检出率。
32.本技术所述的正向引物可以分开包装或者混合后以混合物形式包装，本技术在此不做限定。
33.优选地，本技术的靶向igh可变区(v区)的fr1区域的正向引物的核苷酸序列(如seq id no:2-7所示；本技术的靶向igh可变区(v区)的fr2区域的正向引物的核苷酸序列如seq id no:8-13所示；本技术的靶向igh可变区(v区)的fr3区域的正向引物的核苷酸序列如seq id no:9-20所示；具体地，
34.seq id no:2：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcggcctcagtgaaggtctcctgcaag-3’；
35.seq id no:3：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcgtctggtcctacgctggtgaaaccc-3’；
36.seq id no:4：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcctggggggtccctgagactctcctg-3’；
37.seq id no:5：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatccttcggagaccctgtccctcacctg-3’；
38.seq id no:6：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatccggggagtctctgaagatctcctgt-3’；
39.seq id no:7：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatctcgcagaccctctcactcacctgtg-3’；
40.seq id no:8：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatctggatccgtcagcccccagggaagg-3’；
41.seq id no:9：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcggtccgccaggctccagggaa-3’；
42.seq id no:10：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatctggatccgccagcccccagggaagg-3’；
43.seq id no:11：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcgggtgcgccagatgcccgggaaagg-3’；
44.seq id no:12：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatctggatcaggcagtccccatcgagag-3’；
45.seq id no:13：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgggtgcgacaggcccctggacaa-3’；
46.seq id no:14：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatctggagctgagcagcctgagatctga-3’；
47.seq id no:15：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatccaatgaccaacatggaccctgtgga-3’；
48.seq id no:16：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatctctgcaaatgaacagcctgagagcc-3’；
49.seq id no:17：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcgagctctgtgaccgccgcggacacg-3’；
50.seq id no:18：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatccagcaccgcctacctgcagt
ggagc-3’；
51.seq id no:19：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatcgttctccctgcagctgaactctgtg-3’；
52.seq id no:20：5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatccagcacggcatatctgcagatcag-3’。
53.在本技术的一些实施方式中，所述接头引物为核苷酸序列如seq id no:21所示的单链dna分子，或seq id no:21经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:21具有相同功能的单链dna分子。
54.本技术所述的接头引物，为illumina-r接头引物，其可以具有如seq id no:21所示的核苷酸序列；也可以具有seq id no:21经过1个或多个核苷酸突变后的核苷酸序列，且具有与seq id no:21所示的核苷酸序列相同的功能；其中，多个可以为2个以上、2-10个、2-5个、2个或3个；核苷酸突变的方式包括替换、缺失或插入。
55.优选地，本技术的illumina-r接头引物的核苷酸序列为：5
’‑
gactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-3’(seq id no:21)。
56.在本技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps和水。
57.本技术所述的试剂盒中，水可以为ddh2o(双蒸水)或dnase-free&rnase-free water(又称为depc水，指用depc(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水)，dntps包括datp(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dctp(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)、dgtp(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)和dttp(三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)。本技术所述的试剂盒还可以包括其他在pcr扩增时需要采用的试剂，如illumina高通量测序平台文库构建专用试剂(hieffstubby udi primer kit for)等，本技术在此不做限定。
58.本技术第二方面提供了本技术第一方面所述的试剂盒在检测免疫球蛋白基因重排中的用途。
59.本技术所述的试剂盒，能够用于多重pcr扩增，对扩增产物进行测序，即可以判断其为多克隆性重排或克隆性重排，灵敏度高，能够有效提高淋巴瘤检出率；其可以用于非诊断或治疗目的的免疫球蛋白基因重排检测。
60.本技术第三方面提供了一种检测免疫球蛋白基因重排的方法，其中，所述方法包括步骤：利用本技术第一方面所述的试剂盒对待测样本进行三轮多重pcr扩增，纯化后得到测序文库(测序文库的构建示意图如图1所示)；将所述测序文库进行高通量测序，分析测序结果，判断是否存在克隆性基因重排；
61.其中，判定存在所述克隆性基因重排满足以下条件的至少一者：
62.(1)占最高比例的克隆与第二比例的克隆的比值＞2；
63.(2)占第二比例的克隆与第三比例的克隆的比值＞2。
64.否则，不存在克隆性基因重排，即为多克隆性基因重排。
65.本技术对待测样品的形式不做限定，例如可以是包含有淋巴细胞的骨髓、血液或组织样本等。本技术对待测样品的dna的提取方法不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以采用市售的dna提取试剂盒。
66.本技术所述的三轮多重pcr扩增，其中，第一轮pcr扩增的引物包括反向引物，第二
轮pcr扩增的引物包括多种正向引物和接头引物；第三轮pcr扩增的引物包括高通量测序平台文库构建试剂盒如hieff stubby udi primer kit for中的引物。
67.本技术所述的纯化，是指对每轮pcr扩增产物进行纯化。本技术对pcr扩增产物进行纯化的方法不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以采用磁珠法进行纯化，此为本领域常规操作，本技术在此不做限定。
68.本技术所述的高通量测序(high-throughput sequencing)，又称“下一代”测序技术(“next-generation”sequencing technology)，其以能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定和一般读长较短等为标志；高通量测序是本领域公知的测序方法，本技术在此不做限定。高通量测序平台可以是本领域技术人员已知的任何平台，例如illumina novaseq 6000测序系统。
69.本技术所述的克隆，是指淋巴细胞中由v、d、j和c基因片段重组形成的每个igh基因重排。
70.本技术所述的占最高比例的克隆，是指所有的克隆中数量最多的克隆；本技术所述的第二比例的克隆，是指所有的克隆中数量排名第二(从大到小排列)的克隆；本技术所述的第三比例的克隆，是指所有的克隆中数量排名第三(从大到小排列)的克隆。
71.本技术所述的占最高比例的克隆与第二比例的克隆的比值＞2，是指占最高比例的克隆所对应的克隆数量与第二比例的克隆所对应的克隆数量的比值＞2；占第二比例的克隆与第三比例的克隆的比值＞2，是指占第二比例的克隆所对应的克隆数量与第三比例的克隆所对应的克隆数量的比值＞2。
72.本技术提供的检测免疫球蛋白基因重排的方法，采用随机标签-高通量测序技术，能够有效降低多重pcr的扩增偏倚，均一度和检测准确度高；且能够有效覆盖所有igh基因重排，能够有效确定每个igh基因重排的克隆，有效提高淋巴瘤检出率。
73.在一些实施方式中，第一轮pcr扩增体系包括：0.2-0.6μmol/l反向引物、1-2ng/μl待测样本dna、0.02-0.03u/μl dna聚合酶、50-200μmol/l dntps；
74.第二轮pcr扩增体系包括：0.2-0.4μmol/l正向引物、0.2-0.4μmol/l接头引物、0.02-0.03u/μl dna聚合酶、50-200μmol/l dntps、每μl第二轮pcr扩增体系中包含0.2-0.3μl纯化的第一轮pcr扩增产物；
75.第三轮pcr扩增体系包括：50-200μmol/l dntps、每μl第三轮pcr扩增体系中包含0.3-0.5μl纯化的第二轮pcr扩增产物、每μl第三轮pcr扩增体系中包含0.05-0.15μl hieffstubby udi primer kit for 或tianseq单索引接头。
76.本技术所述的hieff stubby udi primer kit for 是illumina高通量测序平台文库构建专用试剂盒，包含二代测序建库中使用的pe adapter以及12/96/192/384种udi primer。该试剂盒提供的udi primer为i5、i7 primer预混液，配合dna library prep kit for使用，可构建多达384种双端唯一index标记的文库。
77.本技术所述的tianseq单索引接头(tianseq single-indexed adapter)，是专门针对于illimina高通量测序平台的dna接头，可用于illimina高通量测序平台下dna和rna文库的构建。试剂盒分为12种接头和24种接头两种形式，每种接头均含有唯一的6碱基index序列(barcode)，以便于在多样品混合测序时进行不同样品的区分。该试剂盒提供的接头浓度为30μm，操作时的用法随着建库所用试剂盒、初始dna处理量和dna片段大小的不
同而不同，具体信息参考使用方法即可。
78.本技术的pcr扩增可采用常规的pcr扩增体系，例如25μl扩增体系或50μl扩增体系等，本技术在此不做限定。
79.dntps以及dna聚合酶均为pcr体系的常规通用试剂，均可市售获得。dna聚合酶可以选择pcr扩增用的常规dna聚合酶，本技术在此不做限定，例如gflex dna聚合酶。
80.当然，所述pcr扩增体系中还包括pcr缓冲液和水，所述pcr缓冲液根据所用的dna聚合酶的种类确定，可市售获得。通常pcr缓冲液与dna聚合酶需要配合使用，市售dna聚合酶均配有与之配合使用的pcr缓冲液，此为本领域常规操作，本技术在此不做限定。
81.本领域中，pcr缓冲液通常为浓缩的pcr缓冲液，例如可以是2
×
pcr缓冲液、10
×
pcr缓冲液等，本技术对此不做限定，例如，对于50μl扩增体系而言，如果采用2
×
pcr缓冲液，其用量通常为25μl，如果采用10
×
pcr缓冲液，其用量通常为5.0μl；此为pcr扩增的常规用法，本技术在此不做限定。pcr扩增体系中，除pcr缓冲液、引物、dna模板、dntp及dna聚合酶，剩余体积可以用ddh2o或dnase-free&rnase-free water补足，此为本领域常规操作，本技术在此不做限定。
82.本技术中，对于50μl第一轮pcr扩增体系，待测样本dna的优选加入总量为80-120ng，体积不超过20μl。
83.本技术通过采用优化的三轮pcr扩增体系，能够提高pcr扩增效率。
84.在一些实施方式中，第一轮pcr扩增条件包括：预变性：93-95℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；一次退火：65-67℃，1.8-2.2min；二次退火：63-64℃，3.5-4.5min；三次退火：61-62℃，1.8-2.2min；延伸：67-69℃，0.8-1.2min；1个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min；
85.第二轮pcr扩增条件包括：预变性：93-95℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；一次退火：63-64℃，28-32s；二次退火：61-62℃，28-32s；延伸：67-69℃，12-18s；17-19个循环；完成循环后继续67-69℃延伸9-11min；
86.第三轮pcr扩增条件包括：预变性：94-96℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；退火：59-61℃，28-32s；延伸：67-69℃，28-32s；15-25个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。
87.其中，“1-2个循环”、“17-19个循环”、“15-25个循环”是指变性、退火(可以多次)、延伸三个过程的循环，此为本领域常规操作，本技术在此不做赘述。
88.本技术通过采用优化的三轮pcr扩增条件，能够提高pcr扩增效率。
89.以下结合具体实施例对本技术进行详细说明。
90.下述实施例中，2
×
pcr缓冲液和dna聚合酶为购自toyobo公司的货号为kme-101的kod
–
multi&试剂盒中的2
×
pcr缓冲液和dna聚合酶；磁珠法纯化采用的试剂盒为购自beckman(贝克曼)的货号为a63881的ampure xp，具体纯化方法按照说明书进行，ampure xp磁珠和样本的体积比如下：纯化第一轮pcr产物时磁珠和样本的体积比为1:1，纯化第二轮pcr产物时磁珠和样本的体积比为1.8:1，纯化第三轮pcr产物时磁珠和样本的体积比为0.8:1。
91.实施例1
92.1、配制引物
93.所有引物采用dnase-free&rnase-free water配置成100μm，使用前均稀释至10μm。pcr反应引物名称及序列编号如下表1所示。
94.表1 pcr反应引物名称及序列编号
[0095][0096][0097]
2、第一轮pcr扩增
[0098]
根据表2所示的组分及用量配制第一轮pcr扩增体系，轻微振荡混合均匀。其中，reh细胞系来源于中国科学院细胞库，目录号为tchu131，raji细胞系来源于中国科学院细胞库，目录号为tchu44。reh细胞系样本dna提取和raji细胞系样本dna提取采用的试剂盒均为广州美基生物科技有限公司的货号为ar412的magpure universal dna mini r8kit，具体提取方法按照试剂盒说明书进行。
[0099]
表2第一轮pcr扩增体系(50μl)
[0100][0101]
打开pcr仪，按表3设置第一轮pcr扩增反应条件程序，将pcr反应管并列放入pcr仪中，运行反应程序。
[0102]
表3第一轮pcr扩增反应条件
[0103][0104][0105]
第一轮pcr扩增反应完成后，采用磁珠法纯化第一轮pcr扩增产物，得到纯化后第一轮pcr扩增产物。
[0106]
3、第二轮pcr扩增
[0107]
分别根据表4、表5和表6所示的组分及用量配制第二轮pcr扩增体系，轻微振荡混合均匀。
[0108]
表4第二轮pcr扩增体系(50μl)
[0109][0110]
表5第二轮pcr扩增体系(50μl)
[0111][0112]
表6第二轮pcr扩增体系(50μl)
[0113][0114][0115]
打开pcr仪，按表7设置第二轮pcr扩增反应条件程序，将pcr反应管并列放入pcr仪中，运行反应程序。
[0116]
表7第二轮pcr扩增反应条件
[0117][0118]
第二轮pcr扩增反应完成后，采用磁珠法纯化第二轮pcr扩增产物，得到纯化后第二轮pcr扩增产物。
[0119]
4、第三轮pcr扩增
[0120]
根据表8所示的组分及用量配制第三轮pcr扩增体系，轻微振荡混合均匀。
[0121]
表8第三轮pcr扩增体系(50μl)
[0122][0123]
打开pcr仪，按表9设置第三轮pcr扩增反应条件程序，将pcr反应管并列放入pcr仪中，运行反应程序。
[0124]
表9第三轮pcr扩增反应条件
[0125][0126]
第三轮pcr扩增反应完成后，采用磁珠法纯化第三轮pcr扩增产物，得到测序文库。
[0127]
5、高通量测序及测序结果分析
[0128]
将测序文库上机进行高通量测序，仪器为illumina novaseq 6000测序系统，测序长度为pe250。
[0129]
测序结果判断的标准包括：判定存在所述克隆性基因重排满足以下条件的至少一者：
[0130]
(1)占最高比例的克隆与第二比例的克隆的比值＞2；
[0131]
(2)占第二比例的克隆与第三比例的克隆的比值＞2；
[0132]
否则不存在克隆性基因重排，即为多克隆性基因重排。
[0133]
测序结果如下表10所示。
[0134]
表10克隆性重排检测结果
[0135]
样本名称reh细胞系dnaraji细胞系dna测序标签编号udi primer 0001udi primer 0002总reads数200175230562目的reads数199895221654有效reads比例99.8％96.1％带有特异随机标签reads数2539430189
[0136]
如表10结果所示，reh细胞系的带有特异随机标签reads数为25394，raji细胞系的带有特异随机标签reads数为30189，生信数据分析表明带有特异随机标签reads均为reh或raji细胞系特异性、单一的基因重排，即目的克隆占比100％，其它克隆占比0％，判断为克隆性重排。
[0137]
上述结果表明，本技术提供的检测免疫球蛋白基因重排的方法能够有效构建随机标签测序文库，并通过高通量测序鉴定reh细胞系和raji细胞系存在克隆性igh基因重排。
[0138]
实施例2
[0139]
1、配制引物
[0140]
所有引物采用dnase-free&rnase-free water配置成100μm，使用前均稀释至10μm。pcr反应引物名称及序列编号如下表11所示。
[0141]
表11 pcr反应引物名称及序列编号
[0142][0143]
2、第一轮pcr扩增
[0144]
根据表12所示的组分及用量配制第一轮pcr扩增体系，轻微振荡混合均匀。其中，取20种不同的质粒(质粒的核苷酸序列分别如seq id no:22-41所示，生工生物工程(上海)股份有限公司合成)等摩尔混匀，将混合物与hela细胞dna混合，混合比例为每3.4pg基因组dna加入1拷贝质粒，作为均一度标准品。其中，hela细胞系来源于中国科学院细胞库，目录号为tchu187。hela细胞系样本dna提取采用的试剂盒为广州美基生物科技有限公司的货号为ar412的magpure universal dna mini r8 kit，具体提取方法按照试剂盒说明书进行。
[0145]
表12第一轮pcr扩增体系(50μl)
[0146][0147][0148]
打开pcr仪，按表13设置第一轮pcr扩增反应条件程序，将pcr反应管并列放入pcr仪中，运行反应程序。
[0149]
表13第一轮pcr扩增反应条件
[0150][0151]
第一轮pcr扩增反应完成后，采用磁珠法纯化第一轮pcr扩增产物，得到纯化后第一轮pcr扩增产物。
[0152]
3、第二轮pcr扩增
[0153]
分别根据表14、表15和表16所示的组分及用量配制第二轮pcr扩增体系，轻微振荡混合均匀。
[0154]
表14第二轮pcr扩增体系(50μl)
[0155][0156][0157]
表15第二轮pcr扩增体系(50μl)
[0158][0159]
表16第二轮pcr扩增体系(50μl)
[0160][0161]
打开pcr仪，按表17设置第二轮pcr扩增反应条件程序，将pcr反应管并列放入pcr仪中，运行反应程序。
[0162]
表17第二轮pcr扩增反应条件
[0163][0164][0165]
第二轮pcr扩增反应完成后，采用磁珠法纯化第二轮pcr扩增产物，得到纯化后第二轮pcr扩增产物。
[0166]
4、第三轮pcr扩增
[0167]
根据表18所示的组分及用量配制第三轮pcr扩增体系，轻微振荡混合均匀。
[0168]
表18第三轮pcr扩增体系(50μl)
[0169][0170]
打开pcr仪，按表19设置第三轮pcr扩增反应条件程序，将pcr反应管并列放入pcr仪中，运行反应程序。
[0171]
表19第三轮pcr扩增反应条件
[0172][0173]
第三轮pcr扩增反应完成后，采用磁珠法纯化第三轮pcr扩增产物，得到测序文库。
[0174]
5、高通量测序及测序结果分析
[0175]
将测序文库上机进行高通量测序，仪器为illumina novaseq 6000测序系统，测序长度为pe250。
[0176]
克隆性重排检测均一度定义为“平均有效reads数一倍以内的reads所占的比例”，本实施例投入重排种类共计20种，平均有效reads数为20193，reads偏倚一倍以内为10096-40386reads。
[0177]
测序结果如下表20所示。
[0178]
表20均一度标准品克隆性重排检测结果
[0179]
编号测序标签编号带有特异随机标签有效reads数1udi primer 0001205322udi primer 0002185833udi primer 0003153894udi primer 0004189255udi primer 0005259756udi primer 0006214947udi primer 0007196788udi primer 0008169829udi primer 00092105610udi primer 00102305211udi primer 00112701312udi primer 00121942313udi primer 00131936814udi primer 00142103515udi primer 00152492516udi primer 00161896217udi primer 00171309118udi primer 00181689219udi primer 00192196320udi primer 002019852
[0180]
如表20所示，20种重排有效reads总数均处于10096-40386reads数以内，上述结果
表明该方法检测克隆性基因重排具有良好的均一度。
[0181]
从上述实施例可以看出，本技术提供的检测免疫球蛋白基因重排的方法，采用随机标签-高通量测序技术，能够有效降低多重pcr的扩增偏倚，均一度和检测准确度高；且能够有效覆盖所有igh基因重排，能够有效确定每个igh基因重排的克隆，有效提高淋巴瘤检出率；可以用于非诊断或治疗目的的免疫球蛋白基因重排检测。
[0182]
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
[0183]
以上所述仅为本技术的较佳实施例，并非用于限定本技术的保护范围。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的保护范围内。

技术特征：
1.一种检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒，其中，所述试剂盒包含正向引物、反向引物和接头引物，所述反向引物中依次包含能与免疫球蛋白重链基因特异性结合的核苷酸序列、随机标签和高通量测序平台适用的测序接头的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述随机标签的碱基数目为6-8个。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述反向引物为核苷酸序列如seq id no:1所示的单链dna分子，或seq id no:1经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:1具有相同功能的单链dna分子。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述正向引物为核苷酸序列如seq id no:2-20所示的单链dna分子，或seq id no:2-20各自独立地经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:2-20具有相同功能的单链dna分子。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述接头引物为核苷酸序列如seq id no:21所示的单链dna分子，或seq id no:21经过1、2或3个核苷酸的替换和/或缺失和/或插入且与seq id no:21具有相同功能的单链dna分子。6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps和水。7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在检测免疫球蛋白基因重排中的用途。8.一种检测免疫球蛋白基因重排的方法，其中，包括步骤：采用权利要求1-6任一项所述的试剂盒对待测样本进行三轮多重pcr扩增，纯化后得到测序文库；将所述测序文库进行高通量测序，分析测序结果，判断是否存在克隆性基因重排；其中，判定存在所述克隆性基因重排满足以下条件的至少一者：(1)占最高比例的克隆与第二比例的克隆的比值＞2；(2)占第二比例的克隆与第三比例的克隆的比值＞2。9.根据权利要求8所述的方法，其中，第一轮pcr扩增体系包括：0.2-0.6μmol/l反向引物、1-2ng/μl待测样本dna、0.02-0.03u/μl dna聚合酶、50-200μmol/l dntps；第二轮pcr扩增体系包括：0.2-0.4μmol/l正向引物、0.2-0.4μmol/l接头引物、0.02-0.03u/μl dna聚合酶、50-200μmol/l dntps、每μl第二轮pcr扩增体系中包含0.2-0.3μl纯化的第一轮pcr扩增产物；第三轮pcr扩增体系包括：50-200μmol/l dntps、每μl第二轮pcr扩增体系中包含0.3-0.5μl纯化的第二轮pcr扩增产物、每μl第三轮pcr扩增体系中包含0.05-0.15μl hieffstubby udi primer kit for或tianseq单索引接头。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，第一轮pcr扩增条件包括：预变性：93-95℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；一次退火：65-67℃，1.8-2.2min；二次退火：63-64℃，3.5-4.5min；三次退火：61-62℃，1.8-2.2min；延伸：67-69℃，0.8-1.2min；1个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min；第二轮pcr扩增条件包括：预变性：93-95℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；一次退火：63-64℃，28-32s；二次退火：61-62℃，28-32s；延伸：67-69℃，12-18s；17-19个循环；完成循环后继续67-69℃延伸9-11min；
第三轮pcr扩增条件包括：预变性：94-96℃，2.5-3.5min；变性：97-98℃，28-32s；退火：59-61℃，28-32s；延伸：67-69℃，28-32s；15-25个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

技术总结
本申请涉及基因检测技术领域，提供了一种检测免疫球蛋白基因重排的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包含正向引物、反向引物和接头引物，所述反向引物中依次包含能与免疫球蛋白重链基因特异性结合的核苷酸序列、随机标签和高通量测序平台适用的测序接头的核苷酸序列。本申请在靶向IgH连接区(J区)的反向引物中连接随机标签，采用该反向引物进行PCR扩增，扩增产物经过测序可以获得目的片段及随机标签序列，其能够有效消除PCR扩增导致的偏倚，能够显著提高测序的均一度和检测准确度。著提高测序的均一度和检测准确度。著提高测序的均一度和检测准确度。


技术研发人员：李世学
受保护的技术使用者：京东方科技集团股份有限公司
技术研发日：2022.03.23
技术公布日：2023/10/7