一种哺乳动物基因组编辑方法及其应用

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种哺乳动物基因组编辑方法及其应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化是一种进行性的炎症性疾病，其早起特征是动脉血管壁中脂质的积累。疾病进展导致动脉粥样硬化斑块的形成和动脉管腔变窄。由动脉粥样硬化引起的冠心病和缺血性中风是世界范围内疾病和死亡的主要原因。
3.小动物模型已经为研究早期动脉粥样硬化的基本机制提供了支持，但越来越清楚的是，需要新的方法和研究工具来将这些发现转化为人症状性动脉粥样硬化的预防和治疗的改善。目前，因为猪在生理、病理、免疫和心血管系统方面与人有许多相似之处，在生物医学研究中被广泛用作大型动物模型。广西巴马小型猪遗传性稳定，表型特征一致性好，性情比较温和，体型不大，各个器官系统与人体极为相似，适于医学、生物学实验应用。
4.现有的猪动脉粥样硬化模型包括apoe基因敲除模型和apoe和ldlr基因双敲除模型，其模拟人动脉粥样硬化疾病在血脂和血管斑块方面的部分表型。
5.然而，人动脉粥样硬化疾病的遗传因素较为复杂，这两种模型并不能模拟全部人动脉粥样硬化疾病的表型。
6.所以，亟需在与人生理结构相近的大型动物中构建该疾病的模型，从而为该疾病的病理研究、治疗效果评价等研究提供支持。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种哺乳动物基因组编辑方法。本发明还提供了用于在哺乳动物基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因的构建体、由所述构建体转染受体细胞获得的重组细胞及其制备方法、以及制备动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法。本发明的哺乳动物基因组编辑方法可在哺乳动物基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因，具有该插入基因的哺乳动物可以作为人动脉粥样硬化的动物模型，从而为针对该疾病的病理研究、治疗效果评价等研究提供支持。
8.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
9.一方面，本发明提供了一种哺乳动物基因组编辑方法，包括在哺乳动物基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因；
10.优选地，所述apoe基因位点在3号外显子上；
11.优选地，所述人源pcsk9基因携带c.1120g》t突变，并且所述人源pcsk9基因的序列如seq id no:1所示；
12.seq id no:1：
13.atgggcaccgtcagctccaggcggtcctggtggccgctgccactgctgctgctgctgctgctgctcctgggtcccgcgggcgcccgtgcgcaggaggacgaggacggcgactacgaggagctggtgctagccttgcgttccgaggaggacggcctggccgaagcacccgagcacggaaccacagccaccttccaccgctgcgccaaggatccgtggaggttgc
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14.优选地，所述人源pcsk9基因由haat启动子启动；
15.优选地，所述哺乳动物为非人哺乳动物，例如，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，进一步优选为巴马小型猪。
16.另一方面，本发明提供了一种用于在哺乳动物基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因的构建体，所述构建体包含cas9-grna表达载体和质粒供体，所述质粒供体包含人源pcsk9基因；
17.优选地，所述grna的序列如seq id no:2所示；
18.seq id no:2：
19.gtaatcccagaagcggccca
20.优选地，所述质粒供体长度为7539bp，包含同源臂、haat启动子、人源pcsk9基因和质粒骨架；更优选地，所述质粒供体的序列如seq id no:3所示。
21.seq id no:3：
22.tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaac
tatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcctagtatccatgaggaagagggttcaatccctggcttcgctcagcgggttaaggatccggcgttgccatgagctgcggcataagtcgcagatgcagctcgaatcgggtgttgctgtggctgtggtgcaggctggcagctatcgcttccatcggacccctcgcctgggaacttccacgtatgccactggtgcagccctaaaagacaaacaaacaaaaacgaaagaaagagaaaagaaaggaaagggggcttctgtttctaatgcgttgttgcctggcagggcgtgagcattagatacgtgtcagctgtgactagcgtgcacggagcacacaatccatgcttgtccagtaattagacaggctgggtgtccttccacccctccctgcccaccagtgctctagagaagcccacccaccggggctgggggagcacctgctctgtaccaggtaccgtgtgctgggagggggcagaggacctgatggctgtgaactggctcggtgcaggatgccggacagaggacgagccggggccgccgccggaggtgcacgtgtggtgggaggagcccaagtggcagggcagccagccctgggagcaggccctggctgcaggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagagggtccgggttcaaaaccacttgctgggtggggagtcgtcagtaagtggctatgccccgaccccgaagcctgtttccccatctgtacaatggaaatgataaagacgcccatctgatagggtttttgtggcaaataaacatttggtttttttgttttgttttgttttgttttttgagatggaggtttgctctgtcgcccaggctggagtgcagtgacacaatctcatctcaccacaaccttcccctgcctcagcctcccaagtagctgggattacaagcatgtgccaccacacctggctaattttctatttttagtagagacgggtttctccatgttggtcagcctcagcctcccaagtaactgggattacaggcctgtgccaccacacccggctaattttttctatttttgacagggacggggtttcaccatgttggtcaggctcctctagaggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatatccccctgatctgcggcctcgacggtatcgataaggaattctagtcgtcgaccactttcacaatctgcggcaccggtgcgccaccatgggcaccgtcagctccaggcggtcctggtggccgctgccactgctgctgctgctgctgctgctcctgggtcccgcgggcgcccgtgcgcaggaggacgaggacggcgactacgaggagctggtgctagccttgcgttccgaggaggacggcctggccgaagcacccgagcacggaaccacagccaccttccaccgctgcgccaaggatccgtggaggttgcctggcacctacgtggtggtgctgaaggaggagacccacctctcgcagtcagagcgcactgcccgccgcctgcaggcccaggctgcccgccggggatacctcaccaagatcctgcatgtcttccatggccttcttcctggcttcctggtgaagatgagtggcgacctgctggagctggccttgaagttgccccatgtcgactacatcgaggaggactcctctgtctttgcccagagcatcccgtggaacctggagcggattacccctccacggtaccgggcggatgaataccagccccccgacggaggcagcctggtggaggtgtatctcctagacaccagcatacagagtgaccaccgggaaatcgagggcagggtcatggtcaccgacttcgagaatgtgcccgaggaggacgggacccgcttccacagacaggccagcaagtgtgacagtcatggcacccacctggcaggggtggtcagcggccgggatgccggcgtggccaagggtgccagcatgcgcagcctgcgcgtgctcaactgccaagggaagggcacggttagcggcaccctcataggcctggagtttattcggaaaagccagctggtccagcctgtggggccact
ggtggtgctgctgcccctggcgggtgggtacagccgcgtcctcaacgccgcctgccagcgcctggcgagggctggggtcgtgctggtcaccgctgccggcaacttccgggacgatgcctgcctctactccccagcctcagctcccgaggtcatcacagttggggccaccaatgcccaagaccagccggtgaccctggggactttggggaccaactttggccgctgtgtggacctctttgccccaggggaggacatcattggtgcctccagctactgcagcacctgctttgtgtcacagagtgggacatcacaggctgctgcccacgtggctggcattgcagccatgatgctgtctgccgagccggagctcaccctggccgagttgaggcagagactgatccacttctctgccaaagatgtcatcaatgaggcctggttccctgaggaccagcgggtactgacccccaacctggtggccgccctgccccccagcacccatggggcaggttggcagctgttttgcaggactgtgtggtcagcacactcggggcctacacggatggccacagccatcgcccgctgcgccccagatgaggagctgctgagctgctccagtttctccaggagtgggaagcggcggggcgagcgcatggaggcccaagggggcaagctggtctgccgggcccacaacgcttttgggggtgagggtgtctacgccattgccaggtgctgcctgctaccccaggccaactgcagcgtccacacagctccaccagctgaggccagcatggggacccgtgtccactgccaccaacagggccacgtcctcacaggctgcagctcccactgggaggtggaggaccttggcacccacaagccgcctgtgctgaggccacgaggtcagcccaaccagtgcgtgggccacagggaggccagcatccacgcttcctgctgccatgccccaggtctggaatgcaaagtcaaggagcatggaatcccggcccctcaggagcaggtgaccgtggcctgcgaggagggctggaccctgactggctgcagtgccctccctgggacctcccacgtcctgggggcctacgccgtagacaacacgtgtgtagtcaggagccgggacgtcagcactacaggcagcaccagcgaagaggccgtgacagccgttgccatctgctgccggagccggcacctggcgcaggcctcccaggagctccagggatcctacccatacgatgttccagattacgcttacccatacgatgttccagattacgcttacccatacgatgttccagattacgcttgaggccggcctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatttgccgcttctgggattacctgcgctgggtgcagtccctgtctgaccaagtgcaggaggagctgctcagcaccaaggtcacccaggaactgacgtaagtgcccacccgactcccgccgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcctgaccctcctggcgaaccgtgtgttctggaccctcaggctccacccgtccgggtttccttctgtccttgtcgccaactcttgggggtctgggtctctgtttcttttttttccttcttccttttttggggggagtttactttttcttttttctttcatttgacttcatgtcttgctttctttccatcttgagctcctgccttcgcctgtctctgggtcagtcttgccgtccttgctgtctctgaatctctggcacgtcctggccatcgccagctcaggagccctccttctccccctccccgcccccgccctctctgcgcccagggagctgatagaggagagcatgaaggaggtgaaggcctaccgcgaggagctggaggcgcagctgggccccgtgacccaggagacgcaggcgcgcctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcccgcgtgggcgccgaaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctac
actagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc
23.另一方面，本发明提供了一种重组细胞，其由本发明所述的构建体转染受体细胞获得；
24.优选地，所述受体细胞为哺乳动物细胞，例如猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠的细胞，更优选地为巴马小型猪细胞；进一步优选地，所述受体细胞为哺乳动物成纤维细胞，例如猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠的胎儿成纤维细胞，更优选地为巴马小型猪胎儿成纤维细胞。
25.另一方面，本发明提供了本发明所述的重组细胞的制备方法，包括以下步骤：
26.1)使用本发明所述的构建体转染受体细胞，并使用流式细胞仪分选单克隆细胞，对单克隆细胞进行传代培养；
27.2)提取单克隆细胞的核酸dna；
28.3)测定所述核酸dna中哺乳动物基因组的apoe基因位点上的人源pcsk9基因，以筛选所需的重组细胞；
29.优选地，在本发明所述的重组细胞的制备方法的步骤3)中，所述测定包括如下步骤：
30.以dna为模板，采用5’和/或3’插入接头位置的特异性引物，进行pcr，得到扩增产物并对扩增产物进行测序；
31.优选地，所述5’插入接头位置的正向引物如seq id no:4所示，反向引物如seq id no:5所示；所述3’插入接头位置的正向引物如seq id no:6所示，反向引物如seq id no:7所示。
32.seq id no:4：
33.agggttctgtgggttgcttt
34.seq id no:5：
35.aggatgggaactgaggggtt
36.seq id no:6：
37.tctagttgccagccatctgtt
38.seq id no:7：
39.gcggtagagcaccaagcg
40.具体的实施方案例如本发明实施例1中所描述。
41.另一方面，本发明提供了一种制备动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法，包括：
42.将本发明所述的重组细胞作为核供体，注入哺乳动物的去核卵母细胞，形成重构卵，并使用所述重构卵制备动脉粥样硬化哺乳动物模型。
43.优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，更优选为巴马小型猪。
44.具体的实施方案例如本发明实施例2中所描述。
45.另一方面，本发明提供了一种筛选动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法，包括以下步骤：
46.1)提取待测生物样品的核酸dna；
47.2)确定所述核酸dna的序列；
48.3)测定所述核酸dna中人源pcsk9基因作为脉粥样硬化哺乳动物模型的指示；
49.所述生物样品选自血液、皮肤、毛发或肌肉中的至少一种；
50.优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，更优选为巴马小型猪。
51.优选地，在本发明所述的筛选动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法的步骤2)中，确定所述核酸dna的序列包括如下步骤：
52.以dna为模板，采用5’和/或3’插入接头位置的特异性引物进行pcr，得到扩增产物并对扩增产物进行测序；
53.优选地，所述5’插入接头位置的正向引物如seq id no:4所示，反向引物如seq id no:5所示；所述3’插入接头位置的正向引物如seq id no:6所示，反向引物如seq id no:7所示。
54.具体的实施方案例如本发明实施例3中所描述。
55.另一方面，本发明提供了一种筛选动脉粥样硬化哺乳动物模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测在猪apoe基因上插入人源pcsk9基因的5’和/或3’插入接头位置的特异性引物。
56.优选地，所述5’插入接头位置的正向引物如seq id no:4所示，反向引物如seq id no:5所示；所述3’插入接头位置的正向引物如seq id no:6所示，反向引物如seq id no:7所示。
57.优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，更优选为巴马小型猪。
58.本发明利用基因工程技术，在猪基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因，获
得人动脉粥样硬化猪模型。本发明还可以利用本发明的基因组编辑方法改变除猪以外的其它动物的基因组序列，从而获得所需的大型或小型人动脉粥样硬化动物模型，例如人动脉粥样硬化猴模型，人动脉粥样硬化大鼠模型，等等。apoe基因在人、猴、猪、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠、大鼠等哺乳动物中十分保守，因此，利用本发明提供的基因组编辑方法制备大型或小型人动脉粥样硬化哺乳动物模型，研究人动脉粥样硬化的发病机理，对于临床预防、诊断和治疗人类该疾病具有重大的指导意义。
附图说明
59.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
60.图1是实施例1中得到的pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳检测的电泳图。
具体实施方式
61.下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
62.实施例1筛选在猪基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因的重组细胞
63.1.用cas9-grna表达载体和质粒供体转染猪胎儿成纤维细胞；
64.其中，所述grna的序列如seq id no:2所示；所述质粒供体的序列如seq id no:3所示。
65.2.使用流式细胞分选仪分选绿色荧光阳性的单细胞到96孔板中，当96孔板中的单克隆细胞汇合度到50％以上时，进行传代培养。
66.3.筛选单克隆细胞系。
67.4.单克隆细胞系的dna提取和质量检测。
68.①
取适量耳组织装入1.5ml离心管，用小剪刀剪碎，加入500μl的snet溶液和10μl蛋白酶k，在摇床中55℃，200rmp震荡过夜消化；
69.②
待组织消化完全，12000rmp离心1min使毛发沉淀，将上清转移到新的1.5ml ep管；
70.③
加入500μl苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，在常温下震荡30min；
71.④
将溶液在12000rmp下离心15min，小心吸取200μl上清转移至新的离心管，避免中间蛋白层荡起；
72.⑤
在上清中加入200μl的异丙醇，轻轻上下颠倒约1min，12000rmp离心15min；
73.⑥
在离心管底部可见少量白色沉淀，倒掉溶液，注意不要倒掉沉淀，加入1ml 70％乙醇轻弹离心管底部使沉淀浮起；
74.⑦
12000rmp离心5min，保留dna沉淀，将乙醇吸出，室温晾干dna；
75.⑧
加入100μl te，静置10min，用枪轻轻吹打溶液使dna溶解；
76.⑨
使用nano drop对dna溶液进行浓度和质量检测，dna浓度应＞100ng/μl，a260/280在1.8-2.0之间，a260/230＞2；
77.⑩
将dna溶液稀释至100ng/μl，吸取2μl dna溶液混合1μl 10
×
加样缓冲液，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，120v，20min。质量合格的dna样品应为主带清晰无断裂，无蛋白和rna污染。
78.5.设计对插入接头位置的序列进行扩增的pcr引物。
79.针对ncbi数据库中人源pcsk9基因的序列(如seq id no:1所示)，利用primer5软件进行引物设计，设计好的引物序列(表1)送至invitrogen进行引物合成。
80.表1引物序列
81.引物序列编码引物序列5’上游引物seq id no:4agggttctgtgggttgcttt5’下游引物seq id no:5aggatgggaactgaggggtt3’上游引物seq id no:6tctagttgccagccatctgtt3’下游引物seq id no:7gcggtagagcaccaagcg
82.6.pcr扩增
83.使用天根2
×
taq pcr mix进行pcr，25μl体系
[0084][0085]
使用如下pcr扩增程序：
[0086]
在94℃下，预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃温育10min。
[0087]
得到的pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳检测产物(电泳图见图1)，并用pcr产物纯化试剂盒去除引物二聚体，进行下步测序。
[0088]
图1中，5’插入接头位置的特异性引物扩增结果显示，#2、#8、#9、#15、#17、#24号细胞存在目的条带。3’插入接头位置的特异性引物扩增结果显示，#2、#7、#9、#15号细胞存在目的条带。如图1所示，在5’和3’接头位置都检测到目标序列的细胞系。
[0089]
7.测序
[0090]
将pcr产物用sanger法进行测序。测序结果显示pcr产物的序列与插入序列一致，进一步证明细胞系基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因。
[0091]
实施例2体细胞核移植和胚胎移植
[0092]
1.在体外培养猪卵母细胞，42h后对猪卵母细胞进行脱卵丘操作，将脱卵丘的卵母细胞移入操作液滴洗涤5遍。
[0093]
2.在体视镜下挑选排出第一极体的卵母细胞，置于操作液滴中备用。
[0094]
3.采用盲吸法为受体卵母细胞去核。
[0095]
4.用去核针吸取基因编辑的猪胎儿成纤维细胞，注射到卵母细胞的透明带下，得到重构胚。
[0096]
5.重构胚在38.5℃培养箱中恢复30min后，用融合仪进行电激活。
[0097]
6.激活后的重构胚放入pzm3培养液中培养24h，移植到受体母猪体内。
[0098]
实施例3检测在猪基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因的人动脉粥样硬化猪模型
[0099]
1.dna提取和质量检测
[0100]
2.引物设计
[0101]
针对ncbi数据库中人源pcsk9基因的序列，利用primer5软件进行引物设计，设计好的引物序列(表2)送至invitrogen进行引物合成。
[0102]
表2引物序列
[0103]
引物序列编码引物序列5’上游引物seq id no:4agggttctgtgggttgcttt5’下游引物seq id no:5aggatgggaactgaggggtt3’上游引物seq id no:6tctagttgccagccatctgtt3’下游引物seq id no:7gcggtagagcaccaagcg
[0104]
3.pcr扩增
[0105]
使用天根2
×
taq pcr mix进行pcr，25μl体系
[0106][0107]
使用如下pcr扩增程序：
[0108]
在94℃下，预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃温育10min。
[0109]
得到的pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳检测产物，并用pcr产物纯化试剂盒去除引物二聚体，进行下步测序。
[0110]
4.测序
[0111]
将pcr产物用sanger法进行测序。
[0112]
5.结果
[0113]
在基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因的模型猪中可以检测到目标序列。

技术特征：
1.一种哺乳动物基因组编辑方法，包括在哺乳动物基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因；优选地，所述apoe基因位点在3号外显子上；优选地，所述人源pcsk9基因携带c.1120g>t突变，并且所述人源pcsk9基因的序列如seq id no:1所示；优选地，所述人源pcsk9基因由haat启动子启动；优选地，所述哺乳动物为非人哺乳动物，更优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，进一步优选为巴马小型猪。2.一种构建体，其用于在哺乳动物基因组的apoe基因位点上插入人源pcsk9基因；优选地，所述构建体包含cas9-grna表达载体和质粒供体，所述质粒供体包含人源pcsk9基因；优选地，所述grna的序列如seq id no:2所示；优选地，所述质粒供体长度为7539bp，包含同源臂、haat启动子、人源pcsk9基因和质粒骨架；更优选地，所述质粒供体的序列如seq id no:3所示。3.一种重组细胞，其由如权利要求2所述的构建体转染受体细胞获得；优选地，所述受体细胞为哺乳动物细胞，例如猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠的细胞，更优选地为巴马小型猪细胞；进一步优选地，所述受体细胞为哺乳动物成纤维细胞，例如猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠的胎儿成纤维细胞，更优选地为巴马小型猪胎儿成纤维细胞。4.如权利要求3所述的重组细胞的制备方法，包括以下步骤：1)使用如权利要求3所述的构建体转染受体细胞，并使用流式细胞仪分选单克隆细胞，对单克隆细胞进行传代培养；2)提取单克隆细胞的核酸dna；3)测定所述核酸dna中哺乳动物基因组的apoe基因位点上的人源pcsk9基因，以筛选所需的重组细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述测定包括如下步骤：以dna为模板，采用5’和/或3’插入接头位置的特异性引物，进行pcr，得到扩增产物并对扩增产物进行测序；优选地，所述5’插入接头位置的正向引物如seq id no:4所示，反向引物如seq id no:5所示；所述3’插入接头位置的正向引物如seq id no:6所示，反向引物如seq id no:7所示。6.一种制备动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法，包括：将权利要求3所述的重组细胞作为核供体，注入哺乳动物的去核卵母细胞，形成重构卵，并使用所述重构卵制备动脉粥样硬化哺乳动物模型；优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，更优选为巴马小型猪。7.一种筛选动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法，包括以下步骤：1)提取待测生物样品的核酸dna；2)确定所述核酸dna的序列；
3)测定所述核酸dna中人源pcsk9基因作为脉粥样硬化哺乳动物模型的指示；所述生物样品选自血液、皮肤、毛发或肌肉中的至少一种；优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，更优选为巴马小型猪。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，确定所述核酸dna的序列包括如下步骤：以dna为模板，采用5’和/或3’插入接头位置的特异性引物进行pcr，得到扩增产物并对扩增产物进行测序；优选地，所述5’插入接头位置的正向引物如seq id no:4所示，反向引物如seq id no:5所示；所述3’插入接头位置的正向引物如seq id no:6所示，反向引物如seq id no:7所示。9.一种筛选动脉粥样硬化哺乳动物模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测在猪apoe基因上插入人源pcsk9基因的5’和/或3’插入接头位置的特异性引物；优选地，所述5’插入接头位置的正向引物如seq id no:4所示，反向引物如seq id no:5所示；所述3’插入接头位置的正向引物如seq id no:6所示，反向引物如seq id no:7所示。优选地，所述哺乳动物为猪、猴、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠或大鼠，更优选为巴马小型猪。

技术总结
本发明提供一种哺乳动物基因组编辑方法，包括在哺乳动物基因组的ApoE基因位点上插入人源PCSK9基因。本发明还提供了用于在哺乳动物基因组的ApoE基因位点上插入人源PCSK9基因的构建体、由所述构建体转染受体细胞获得的重组细胞及其制备方法、以及制备动脉粥样硬化哺乳动物模型的方法。利用本发明提供的方法制备人动脉粥样硬化的哺乳动物模型，研究人动脉粥样硬化疾病的发病机理，对于临床预防、诊断和治疗人动脉粥样硬化疾病具有重大的指导意义。治疗人动脉粥样硬化疾病具有重大的指导意义。治疗人动脉粥样硬化疾病具有重大的指导意义。


技术研发人员：赵建国 王霄 李华 闫星慧 孙泽文 张颖 秦国嵩
受保护的技术使用者：中国科学院动物研究所
技术研发日：2022.03.23
技术公布日：2023/10/7