HMO和双歧杆菌的混合物的制作方法

hmo和双歧杆菌的混合物
技术领域
1.本发明涉及用于婴儿或幼儿的组合物，其包含至少一种益生菌菌株以及人乳低聚糖(hmo)的益生元混合物，所述益生菌菌株属于双歧杆菌，所述hmo的益生元混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、二岩藻糖基乳糖(dfl)、3'-唾液酸乳糖(3sl)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和乳-n-四糖(lnt)以及任选的3-岩藻糖基乳糖(3fl)组成，并且涉及这些混合物在人类健康中的应用。


背景技术：

2.近年来，由于hmo(人乳低聚糖)在人类生物体内发生的多种生物过程中的作用，hmo已备受关注。哺乳动物乳包含这些复合低聚糖中的至少130种(urashim等人,乳低聚糖,《新星生物医学书》,纽约,2011,isbn:978-1-61122-831-1(urashima et al,milk oligosaccharides,nova biomedical books,new york,2011,isbn:978-1-61122-831-1))。
3.事实表明，在人体消化道中的共生微生物群落(称为微生物群)在健康和疾病方面扮演着重要的作用。当肠道微生物群的组成失去平衡时，人类宿主可能承担后果。最近的研究表明肠道微生物群失衡是导致如癌症、肥胖、炎性肠病、牛皮癣、哮喘，并且可能甚至是自闭症等各种各样的个体疾病的原因。据信独特的非消化性纤维(包括hmo)正向调节微生物群，并且它们由于治疗此类疾病中的一种或多种而越来越受到关注。
4.生命的婴儿期，尤其是前几个星期、前3个月、前6个月或前12个月，对于建立平衡的肠道微生物群是至关重要的时期。
5.已知婴儿期肠道微生物群的调节对于身体的未来健康状况可预期具有重大影响。例如，肠道微生物组可对日后的强健的免疫系统的发育、以及正常的生长产生影响，并且甚至对日后的肥胖的发展产生影响。
6.然而，在婴儿的发育过程中，肠道微生物组及其进化是许多肠道细菌种群的存在和繁衍(数量)之间的精密平衡。关于肠道细菌对婴儿总体健康的效应，一些肠道细菌被分类为“通常阳性”，而其他肠道细菌为“通常阴性”(或致病性)。相比于母乳喂养的婴儿，某些种类的“总体正面的”细菌(诸如双歧杆菌)，在喂食常规婴儿配方食品的婴儿中可能不足。类似地，一些细菌种群被认为是致病性的，并且在肠道微生物群中应保持低繁衍。
7.长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)已被证明在母乳喂养的婴儿的肠道微生物群中占优势，并且通过加速免疫应答的成熟、平衡免疫系统以抑制炎症、改善肠屏障功能和增加短链脂肪酸生产而有益于宿主。婴儿中双歧杆菌菌种的丰度降低与慢性疾病相关，包括哮喘和肥胖，以及降低疫苗应答。研究人员假定在发达国家的人群中婴儿肠道中双歧杆菌菌种的损失与变应性和自身免疫性疾病的发病率增加有关。
8.通过外源施用增加肠道微生物生态系统中的双歧杆菌菌种或特别是长双歧杆菌婴儿亚种的丰度可能难以实现，特别是在婴儿配方食品喂养的婴儿中。
9.由长双歧杆菌婴儿亚种产生的关键代谢物是乳酸和乙酸。乳酸和乙酸有助于降低
粪便ph并提供对婴儿中病原体的定殖抗性(duar rm,kyle d和casaburi g，婴儿肠道的定植抗性：婴儿双歧杆菌在降低ph和防止病原体生长中的作用；《高通量》,2020(duar rm,kyle d and casaburi g,colonization resistance in the infant gut:the role of b.infantis in reducing ph and preventing pathogen growth；high-throughput,2020))。两种酸都可以作为产生其它短链脂肪酸(scfa)的微生物群的其它成员的底物。结肠中膳食纤维的微生物发酵尤其产生scfa。已知这些结肠发酵在能量供应、作为营养因子和免疫调节中发挥作用，并且日益增多的证据表明scfa还对若干器官(包括脑)发挥重要的生理效应。经表明，高丰度的产scfa(尤其是丁酸盐)的细菌与婴儿较温和的特应性湿疹相关(nylund l等人，特应性疾病的严重程度与肠道菌群多样性和产丁酸盐的细菌呈逆相关，《变态反应》”(nylund l et al，“severity of atopic disease inversely correlates with intestinal microbiota diversity and butyrate-producing bacteria,allergy,2015))。
10.由于婴儿肠道中双歧杆菌菌种的损失和低的母乳喂养率，需要为婴儿提供hmo和利用hmo的细菌(诸如长双歧杆菌婴儿亚种)两者以支持为了长期健康的健康微生物组。


技术实现要素：

11.本发明的第一方面涉及用于婴儿或幼儿的组合物，该组合物包含至少一种益生菌菌株以及人乳低聚糖的益生元混合物，所述益生菌菌株是双歧杆菌，所述人乳低聚糖的益生元混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、3'-唾液酸乳糖(3sl)、二岩藻糖基乳糖(dfl)、6'-唾液酸乳糖(6sl)、乳-n-四糖(lnt)和任选的3-岩藻糖基乳糖(3fl)组成。
12.本发明人已经令人惊讶地发现，当该hmo混合物与以下物质组合使用时，获得了协同效应：双歧杆菌，尤其是与益生菌的组合，例如长双歧杆菌婴儿亚种与hmo混合物协同地促进更健康的肠道环境，这是由于有益的发酵代谢物诸如短链脂肪酸的增强和健康共生肠道细菌诸如双歧杆菌的生长刺激。
13.在一个方面，本发明涉及一种组合物，其中双歧杆菌是动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)并且益生元低聚糖混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-四糖(lnt)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和3'-唾液酸乳糖(3sl)组成。
14.在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其中双歧杆菌是动物双歧杆菌乳酸亚种和长双歧杆菌婴儿亚种的组合，并且益生元低聚糖混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-四糖(lnt)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和3'-唾液酸乳糖(3sl)组成。
15.在一个方面，本发明涉及用于婴儿或幼儿的组合物，该组合物包含至少一种益生菌菌株和益生元低聚糖混合物，所述益生菌菌株是双歧杆菌，所述益生元低聚糖混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-四糖(lnt)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和3'-唾液酸乳糖(3sl)以及任选的3-岩藻糖基乳糖(3fl)组成；
16.其中双歧杆菌包含长双歧杆菌婴儿亚种或者动物双歧杆菌乳酸亚种和长双歧杆菌婴儿亚种的组合；
17.其中双歧杆菌中的至少一种是长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588或与该菌株具有至
少99.9％的平均核苷酸同一性(ani)的菌株。
18.在一个方面，本发明涉及选自由以下项组成的列表的营养组合物：婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或2段婴儿配方食品、婴孩食物、婴儿谷物组合物、成长乳、强化剂诸如人乳强化剂、或补充剂。
19.在一个方面，本发明涉及如上定义的营养组合物，其用于：i)预防和/或治疗婴儿或幼儿的细菌感染；ii)调节婴儿或幼儿的微生物群；和/或iii)预防和/或治疗婴儿或幼儿的变态反应。
20.在一个方面，本发明涉及如上定义的组合物，其用于调节婴儿或幼儿的微生物群，并且施用所述组合物导致双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)和/或长双歧杆菌婴儿亚种的丰度增加。
21.在一个方面，本发明涉及如上定义的组合物，其用于调节婴儿或幼儿的微生物群；和/或通过增加婴儿或幼儿中肠短链脂肪酸(scfa)的产生来预防和/或治疗此类婴儿或幼儿的变态反应。
22.在一个方面，本发明涉及调节婴儿或幼儿的微生物群以增加双歧杆菌(bifidobacteriacea)和/或长双歧杆菌婴儿亚种的丰度的方法，所述方法包括：
[0023]-向婴儿或幼儿施用所定义的组合物。
附图说明
[0024]
图1：24小时后8个粪便供体的平均总短链脂肪酸浓度。在补充单一hmo(2fl)后平均浓度增加。当补充hmo混合物而不是单一hmo时，发生更大的增加。当补充婴儿双歧杆菌b时获得进一步递增的增加。婴儿双歧杆菌b是长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588。
[0025]
图2：在24小时后8个粪便供体的双歧杆菌科操作分类单位的平均繁衍率。在补充单一hmo(2fl)后平均繁衍率增加。当补充hmo混合物而不是单一hmo时，发生更大的增加。当补充婴儿双歧杆菌b时获得进一步递增的增加。婴儿双歧杆菌b是长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588。
[0026]
图3：48小时后完全酸化(三次重复的平均值)。在补充hmo混合物后平均浓度增加。当在hmo混合物的存在下分别补充婴儿双歧杆菌a和婴儿双歧杆菌c时，获得连续的增加。婴儿双歧杆菌a是长双歧杆菌婴儿亚种atcc 15697。婴儿双歧杆菌c是与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588具有超过99.9％的ani的菌株。
[0027]
图4：48小时后的总短链脂肪酸浓度(三次重复的平均值)。在补充hmo混合物后平均浓度增加。当在hmo混合物的存在下分别补充婴儿双歧杆菌a和婴儿双歧杆菌c时，获得连续的增加。婴儿双歧杆菌a是长双歧杆菌婴儿亚种atcc 15697。婴儿双歧杆菌c是与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588具有超过99.9％的ani的菌株。
[0028]
图5：48小时后婴儿双歧杆菌相关操作分类单位的繁衍率(三次重复的平均值)。当在hmo混合物存在下补充婴儿双歧杆菌c时获得最大的增加。婴儿双歧杆菌a是长双歧杆菌婴儿亚种atcc 15697。婴儿双歧杆菌c是与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588具有超过99.9％的ani的菌株。
[0029]
图6：24小时后处于婴儿年龄(3个月大)和学步儿童年龄(12个月大)的6个粪便供体的平均总短链脂肪酸浓度。当补充不含hmo的婴儿双歧杆菌b或不含hmo的乳酸双歧杆菌
时，与空白相比，平均总短链脂肪酸浓度没有显著增加。当单独补充hmo混合物时平均浓度增加。当补充婴儿双歧杆菌b与hmo混合物，以及婴儿双歧杆菌b和乳酸双歧杆菌与hmo混合物的组合时，获得进一步的增加。添加水平虚线来表示婴儿和学步儿童的总短链脂肪酸浓度的空白含量。婴儿双歧杆菌b是长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588。乳酸双歧杆菌是动物双歧杆菌乳酸亚种cncm i-3446。
具体实施方式
[0030]
如本文所用，下列术语具有下列含义。
[0031]
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童。
[0032]
表述“幼儿”是指年龄介于一岁和三岁之间的儿童，也称为学步儿童。
[0033]
表述“用于婴儿或幼儿的组合物”和“待施用给婴儿或幼儿的组合物”可互换使用。
[0034]
在一些实施方案中，包含根据本发明的hmo混合物的组合物是营养组合物。表述“营养组合物”是指供给个体养分的组合物。这种营养组合物通常为口服或静脉内施用，并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。在具体实施方案中，营养组合物是合成营养组合物。
[0035]
如本文所用，表述“婴儿配方食品”是指旨在专用于供给在生命的头几个月期间的婴儿营养，而且本身满足这类人的多种营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/eec 2006/141/ec号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如在食品法典委员会(法典stan 72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述“婴儿配方食品”既涵盖“一段婴儿配方食品(starter infant formula)”，也涵盖“二段婴儿配方食品(follow-up formula)”或“较大婴儿配方食品(follow-on formula)”。
[0036]“二段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
[0037]
表述“婴孩食物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
[0038]
表述“婴儿谷物组合物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
[0039]
术语“强化剂”是指适于与母乳或婴儿配方食品混合的液体或固体营养组合物。在一个实施方案中，根据本发明的含水组合物是乳强化剂。在此类实施方案中，本发明的含水组合物可以单剂量包装。
[0040]
术语“补充剂”是指含有特定营养物质和/或益生菌的食料，其旨在补充饮食。
[0041]
在一个实施方案中，本发明是粉末或油形式的补充剂。在这样的实施方案中，本发明的组合物作为单独的组合物施用，或与其它成分诸如麦芽糖糊精组合施用。
[0042]
术语“成长乳”(或gum)是指通常添加有维生素和矿物质的乳基饮料，其旨在用于幼儿或儿童。
[0043]
hmo(人乳低聚糖)是人乳中天然存在的低聚糖结构。添加到食料中的hmo通常通过化学合成或通过生物技术生产方法从牛乳获得。
[0044]
术语“scfa”意指短链脂肪酸。
[0045]
表述“增加scfa产生”是指相比于喂予标准组合物，喂予根据本发明的营养组合物的个体中系统和/或结肠scfa的量较高。可通过技术人员已知的技术诸如通过气液色谱法来测量scfa产量。
[0046]“平均核苷酸同一性(ani)”是两个基因组的编码区之间核苷酸水平基因组相似性的量度。平均核苷酸同一性可如此处所述评估：yoon sh，ha sm，lim j，kwon s，计算平均核苷酸同一性的算法的大规模评估，列文虎克，2017年10月；110(10):1281-1286(yoon sh,ha sm,lim j,kwon s,chun j.a large-scale evaluation of algorithms to calculate average nucleotide identity.antonie van leeuwenhoek.2017oct；110(10):1281-1286)。在本发明实施方案中，菌株长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588(也称为atcc 17930)代表与微生物基因组进行比较的参照基因组。与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588具有至少99.9％ani的微生物基因组的示例可见于patric(https://www.patricbrc.org)，基因组id 1678.111(菌株c)。在本发明的一个实施方案中，长双歧杆菌婴儿亚种菌株不具有潜在可转移的抗生素抗性。
[0047]
本发明的hmo和双歧杆菌混合物可以：
[0048]
i)增加双歧杆菌的固有肠丰度，以及
[0049]
ii)增加肠scfa产生并延长粪便ph降低，以及
[0050]
iii)支持长双歧杆菌婴儿亚种的生长。
[0051]
hmo和双歧杆菌混合物对双歧杆菌和scfa的效应大于从单独的双歧杆菌或hmo混合物的效应所预期的。因此，本发明的hmo和双歧杆菌混合物具有令人惊奇的协同效应。
[0052]
这些效应可使肠道环境不易于受到侵入和有害细菌在婴儿肠道中过度生长。hmo和双歧杆菌混合物的这些效应可以预防和/或治疗病症，诸如变态反应、细菌感染、炎性肠病、肠易激综合征、肥胖和与炎症和屏障功能受损相关的其它病症。
[0053]
在一个实施方案中，双歧杆菌是长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588或与该菌株具有至少99.9％的平均核苷酸同一性(ani)的菌株。
[0054]
在一个实施方案中，双歧杆菌是动物双歧杆菌乳酸亚种cncm i-3446。
[0055]
在一个实施方案中，本发明的hmo混合物基本上由以下物质组成：
[0056]
i.34重量％至85重量％，优选42重量％至71重量％的2fl；
[0057]
ii.10重量％至40重量％，优选14重量％至26重量％的lnt；
[0058]
iii.4重量％至14重量％，优选5重量％至10重量％的dfl；以及
[0059]
iv.9重量％至31重量％，优选10重量％至28重量％的组合的6sl和3sl。
[0060]
在另一个实施方案中，本发明的hmo混合物基本上由以下物质组成：
[0061]
i.26重量％至65重量％，优选32重量％至54重量％的2fl；
[0062]
ii.8重量％至30重量％，优选11重量％至20重量％的lnt；
[0063]
iii.3重量％至11重量％，优选4重量％至8重量％的dfl；
[0064]
iv.7重量％至23重量％，优选8重量％至22重量％的组合的6sl和3sl；以及
[0065]
v.12重量％至38重量％，优选17重量％至31重量％的3fl。
[0066]
在一个实施方案中，本发明的hmo混合物基本上由以下物质组成：
[0067]
i.40重量％至80重量％，优选50重量％至70重量％的2fl；
[0068]
ii.10重量％至40重量％，优选14重量％至26重量％的lnt；
[0069]
iii.4重量％至14重量％，优选5重量％至10重量％的dfl；以及
[0070]
iv.9重量％至31重量％，优选10重量％至28重量％的组合的6sl和3sl。
[0071]
在另一个实施方案中，本发明的hmo混合物基本上由以下物质组成：
[0072]
i.20重量％至60重量％，优选25重量％至55重量％的2fl；
[0073]
ii.8重量％至30重量％，优选11重量％至20重量％的lnt；
[0074]
iii.2重量％至12重量％，优选4重量％至8重量％的dfl；
[0075]
iv.7重量％至23重量％，优选8重量％至22重量％的组合的6sl和3sl；以及
[0076]
v.10重量％至40重量％，优选11重量％至37重量％的3fl。
[0077]
hmo和双歧杆菌混合物可以任何合适的形式诸如例如单位剂型(例如片剂、胶囊、粉末小袋等)的营养组合物施用给人。
[0078]
也可将本发明的hmo和双歧杆菌混合物添加到营养组合物。例如，它可添加到婴儿配方食品、食物组合物、再水合溶液、或用于婴儿或幼儿的膳食维持剂或补充剂中。营养组合物可为例如婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或2段婴儿配方食品、婴孩食物、婴儿谷物组合物、强化剂诸如人乳强化剂或补充剂。在一些具体实施方案中，本发明的组合物为旨在针对前4月龄或6月龄的婴儿配方食品、强化剂或补充剂。在一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物是婴儿配方食品。在一些其他实施方案中，本发明的营养组合物是强化剂。强化剂可为母乳强化剂(例如，人乳强化剂)或配方食品强化剂(诸如婴儿配方食品强化剂或较大婴儿配方食品/二段婴儿配方食品强化剂)。
[0079]
常量营养素诸如可食用脂肪、碳水化合物和蛋白质也可包含在此类营养组合物中。可食用的脂肪包括例如椰子油、大豆油以及单甘油酯和二甘油酯。碳水化合物包括例如葡萄糖、可食用乳糖和水解的玉米淀粉。蛋白质包括例如大豆蛋白、乳清和脱脂奶。维生素和矿物质(例如钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和维生素a、e、d、c和b复合物)也可包含在此类营养组合物中。
[0080]
该营养组合物可以任何合适的方式制备。现将以举例的方式描述组合物。
[0081]
例如，可通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适当的比例共混在一起来制备配方食品诸如婴儿配方食品。如果使用，则乳化剂可在此时加入。可在此时添加维生素和矿物质，但其通常在稍后添加以避免热降解。在共混之前，可先将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶解于脂肪源中。然后可混入水(优选经受反渗透的水)，以形成液体混合物。水温适宜地在约50℃至约80℃的范围内以有助于分散成分。可使用可商购获得的液化剂来形成液体混合物。
[0082]
尤其如果最终产物是液体形式，可在此阶段添加本发明的hmo混合物。如果最终产物为粉末，可根据需要同样在此阶段添加这些成分。
[0083]
然后，例如以两个阶段对液体混合物进行均质化。
[0084]
然后，可对液体混合物进行热处理以减少细菌载量，例如通过将液体混合物快速加热至约80℃至约150℃的范围内的温度持续介于约5秒和约5分钟之间的持续时间。这可通过蒸汽注入、高压灭菌器或热交换器(例如，板式热交换器)来进行。
[0085]
然后，例如通过急速冷却将液体混合物冷却至介于约60℃至约85℃之间。然后再次例如分两个阶段对液体混合物进行均质化，其中第一阶段的压力为介于约10mpa至约30mpa，并且第二阶段的压力为介于约2mpa至约10mpa之间。然后可将均质化的混合物进一
步冷却以添加任何热敏组分，诸如维生素和矿物质。此时便利地调节均质化的混合物的ph和固体含量。
[0086]
如果最终产物将为粉末，则将该均质化的混合物转移至合适的干燥装置，诸如喷雾干燥器或冷冻干燥器且将其转化为粉末。该粉末的水分含量应小于约5重量％。本发明的hmo混合物还可以或可替代地在该阶段通过与粉末形式的益生菌菌株一起干混来添加。
[0087]
现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。
[0088]
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.，1989年，《分子克隆：实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版，冷泉港实验室出版社；ausubel,f.m.等人，(1995年和定期补充)，，《分子生物学的最新进展(current protocols in molecular biology)》，第9、13和16章，约翰
·
威利父子出版公司；roe,b.、crabtree,j.和kahn,a.，1996年，《dna分离和测序：基本技术(dna isolation and sequencing:essential techniques)》，约翰
·
威利父子出版公司；polak,j.m.和mcgee,j.o’d.，1990年，，《原位杂交：原理与实践(in situ hybridization:principles and practice)》，牛津大学出版社；gait,m.j.，1984年，《寡核苷酸合成：一种实用的方法(oligonucleotide synthesis:a practical approach)》；以及lilley,d.m.and dahlberg,j.e.，1992年，《酶学方法：dna结构a部分dna的合成和物理分析(methods in enzymology:dna structures part a:synthesis and physical analysis of dna)》，学术出版社。这些一般性文本均以引用的方式并入本文。
[0089]
实施例
[0090]
实施例1-研究长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588与2fl或5hmo混合物的组合的合生素效应
[0091]
材料和方法
[0092]
从比利时的10个大约3个月大的供体收集粪便。4名供体经剖腹产诞下，并且6名供体经顺产诞下。一个供体是母乳喂养的，另外9个供体是取样前一周婴儿配方食品喂养的。制备粪便悬浮液，与冷冻保护剂混合，等分，快速冷冻，然后保存在-80℃。就在实验前，将粪便样品解冻并立即用于实验。
[0093]
粪便材料用于进行模拟婴儿结肠的短期分批发酵实验。这些实验代表人类微生物生态系统的连续仿真器的简化模拟。在短期结肠温育开始时，将测试成分添加到含有结肠基础营养物质的糖耗尽的营养培养基中。因为这种糖耗尽的营养培养基的营养物质也将被结肠微生物群发酵，因此对于每个供体包括仅含有糖耗尽的营养培养基(不含产物)的空白。最后，添加婴儿供体的粪便接种物。每个供体测试五个处理和一个空白，得到60个独立实验。处理如下：
[0094]
1.空白(对照)
[0095]
2.单一hmo(1.3g/l)
[0096]
3. 5hmo混合物(2.5g/l)
[0097]
4.长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588(1x107cfu/ml)
[0098]
5.单一hmo(1.3g/l)+长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588(1
×
107cfu/ml)
[0099]
6. 5hmo混合物(2.5g/l)+长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588(1
×
107cfu/ml)
[0100]
单一hmo是2'-岩藻糖基乳糖(2fl)。hmo混合物由5种hmo组成，干混合物中的比例如下：23％lnt、9％6sl、2％3sl、52％2fl和14％dfl。因此，2fl的添加速率在单一hmo和hmo混合处理中是相同的。
[0101]
将反应器在37℃、振荡和厌氧条件下温育48小时。温育在具有足够高体积的完全独立的反应器中进行，以便不仅确保强健的微生物发酵，而且允许随时间收集多个样品。样品收集能够评估代谢物产生，因此理解正在发生的复杂微生物相互作用。
[0102]
在温育开始时以及6小时、24小时和48小时后对短链脂肪酸(scfa)的产生进行评估等等。scfa产生的模式是微生物碳水化合物代谢的评估。
[0103]
在温育开始时以及温育24小时和48小时后分析微生物组成的变化。用16s靶向的illumina测序和流式细胞术的组合分析样品以确定存在的每个细菌群落的细菌细胞的数目，因此允许将用illumina获得的比例值转化为绝对细胞计数。
[0104]
由于测序结果表明技术或分析问题，因此从结果评估中排除两个供体(经顺产诞下的供体和婴儿配方食品喂养的供体)。
[0105]
结果
[0106]
图1示出了对8个粪便供体进行平均的结肠发酵中获得的短链脂肪酸(scfa)浓度。当仅添加长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588时，与对照(无hmo，无婴儿双歧杆菌)相比，scfa没有增加。使用单一hmo 2fl，可观察到相对于对照的增加；在使用hmo混合物的情况下，这种增加甚至更大。然而，当将长双歧杆菌婴儿亚种添加到单一hmo或hmo混合物的顶部上时，与不添加长双歧杆菌婴儿亚种相比，实现了scfa浓度的额外增加。单一hmo或hmo混合物与长双歧杆菌婴儿亚种的组合相对于对照的效应大于单个成分相对于对照的效应相加的总和，因此显示出明显的协同(合生素)效应。用hmo混合物和长双歧杆菌婴儿亚种的组合可以获得scfa的最大增加。
[0107]
图2示出了对8个粪便供体进行平均的结肠发酵中获得的双歧杆菌科的细胞计数。长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588以1x107cfu/ml的水平添加到添加它的变体中。当仅添加长双歧杆菌婴儿亚种时，与对照(无hmo，无婴儿双歧杆菌)相比，观察到双歧杆菌科的少量增加。使用单一hmo 2fl，相对于对照可观察到双歧杆菌科的增加；在使用hmo混合物的情况下，这种增加甚至更大。然而，当将长双歧杆菌婴儿亚种添加到单一hmo或hmo混合物的顶部上时，与不添加长双歧杆菌婴儿亚种相比，实现了双歧杆菌科的额外增加。对于hmo混合物和长双歧杆菌婴儿亚种的组合，双歧杆菌科相对于对照的增加大于任一成分相对于对照的单独效应，因此显示出明显的协同(合生素)效应。因此长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588已经生长和/或其添加已经刺激双歧杆菌科的其它成员的生长。因此，hmo混合物和长双歧杆菌婴儿亚种的组合最有效地增加双歧杆菌科的数量。总体结果与以上所示的scfa数据相关。
[0108]
实施例2-研究2种不同菌株的长双歧杆菌婴儿亚种与5hmo混合物的组合的合生素效应
[0109]
材料和方法
[0110]
从比利时的3月龄婴儿供体收集粪便。该供体不同于实施例1中的10个供体。该实验类似于实施例1，但是所有的结肠发酵一式三份进行并且测试成分不同。测试五个处理和一个空白，得到总共18个实验。处理如下：
[0111]
1.空白(对照)
[0112]
2. 5hmo混合物(2.5g/l)
[0113]
3.长双歧杆菌婴儿亚种a(1e+07cfu/ml)
[0114]
4.长双歧杆菌婴儿亚种c(1e+07cfu/ml)
[0115]
5.长双歧杆菌婴儿亚种a(1e+07cfu/ml)+5hmo混合物(2.5g/l)
[0116]
6.长双歧杆菌婴儿亚种c(1e+07cfu/ml)+5hmo混合物(2.5g/l)
[0117]
长双歧杆菌婴儿亚种a是菌株atcc 15697，其是亚种的典型菌株并且与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588共有少于99.9％的ani(98.2％)。菌株长双歧杆菌婴儿亚种c与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588具有超过99.9％的ani，因此与lmg 11588菌株密切相关。
[0118]
hmo混合物由5种hmo组成，干混合物中的比例如下：23％lnt、9％6sl、2％3sl、52％2fl和14％dfl。
[0119]
在温育开始时以及6小时、24小时和48小时后对ph和短链脂肪酸(scfa)产生进行评估等等。
[0120]
在温育开始时以及温育24小时和48小时后分析微生物组成的变化。用16s靶向的illumina测序和流式细胞术的组合分析样品以确定存在的每个细菌群落的细菌细胞的数目，因此允许将用illumina获得的比例值转化为绝对细胞计数。
[0121]
结果
[0122]
图3和图4示出单独添加任一长双歧杆菌婴儿亚种菌株对该供体中的酸化或scfa产生没有影响。单独添加hmo混合物导致scfa的显著增加。使用hmo混合物与任一长双歧杆菌婴儿亚种菌株的组合可进一步增加scfa的产生。用hmo混合物与长双歧杆菌婴儿亚种c(与长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588具有超过99.9％ani的菌株)的组合实现了最佳效应。hmo混合物和长双歧杆菌婴儿亚种的组合相对于对照(无hmo，无婴儿双歧杆菌)的效应大于单一成分相对于对照的效应总和，因此显示出明显的合生素效应。相比于使用长双歧杆菌婴儿亚种a，这种合生素效应在使用长双歧杆菌婴儿亚种c时更为显著。
[0123]
测序数据显示出，婴儿供体没有可检测到的长双歧杆菌婴儿亚种相关操作分类单位存在于接种物中，但其可在添加两种菌株后检测到。48小时结肠模拟(图5)后，当不添加hmo时，对于两种菌株，长双歧杆菌婴儿亚种保持低水平。然而，对于长双歧杆菌婴儿亚种c与hmo混合物的组合，检测到长双歧杆菌婴儿亚种相关操作分类单位的大的增加，表明该菌种的强成长刺激。这再次示出了用hmo混合物和长双歧杆菌婴儿亚种的组合可以获得的协同效应。
[0124]
实施例3-在婴儿和学步儿童结肠模型中研究长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588与6hmo混合物的组合在有和没有乳酸双歧杆菌的情况下的合生素效应
[0125]
材料和方法
[0126]
从比利时的约3个月大的6名供体(婴儿)和从约12个月大的相同供体(学步儿童)收集粪便。3名供体经剖腹产诞下，并且3名供体经顺产诞下。一个供体是母乳喂养的，另外5个供体是在第一次取样前一周婴儿配方食品喂养的。该实验类似于实施例1。对处于两个年龄的每个供体测试五个处理和一个空白，得到72个独立实验。处理如下：
[0127]
1.空白(对照)
[0128]
2.长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588(1x108cfu/ml)
[0129]
3.动物双歧杆菌乳酸亚种cncm i-3446(1x108cfu/ml)
[0130]
4.6hmo混合物(2.5g/l)
[0131]
5.6hmo混合物(2.5g/l)+长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588
[0132]
(1
×
108cfu/ml)
[0133]
6.6hmo混合物(2.5g/l)+长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588
[0134]
(1
×
108cfu/ml)+动物双歧杆菌乳酸亚种cncm i-3446
[0135]
(1
×
108cfu/ml)
[0136]
hmo混合物由6种hmo组成，在干混合物中的比例如下：对于婴儿研究，16％lnt、8％6sl、6％3sl、49％2fl、7％dfl和14％3fl；对于学步儿童研究，10％lnt、5％6sl、14％3sl、29％2fl、4％dfl和37％3fl。
[0137]
在温育开始时以及6小时、24小时和48小时后对短链脂肪酸(scfa)的产生进行评估等等。
[0138]
结果
[0139]
图6示出了在24小时对处于两个不同年龄的6个粪便供体进行平均的结肠发酵中获得的短链脂肪酸(scfa)浓度。与空白对照相比，对于两个模型，即婴儿和学步儿童，当仅添加长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588或动物双歧杆菌乳酸亚种cncm i-3446时，没有发生scfa的有意义的增加。使用6hmo混合物，可以观察到scfa浓度相对于空白对照的增加；效应在学步儿童模型中比在婴儿模型中强。然而，当将长双歧杆菌婴儿亚种另外添加到6hmo混合物时，与不添加长双歧杆菌婴儿亚种相比，实现了scfa浓度的额外增加。长双歧杆菌婴儿亚种的附加效应在婴儿模型中比在学步儿童模型中强。在两个模型中，hmo混合物与长双歧杆菌婴儿亚种的组合相对于对照的效应大于单个成分相对于空白对照的效应相加的总和，因此显示出明显的协同(合生素)效应。在另外添加动物双歧杆菌乳酸亚种时，hmo混合物与长双歧杆菌婴儿亚种的合生素效应得到保持；添加动物双歧杆菌乳酸亚种导致scfa浓度的轻微进一步增加。用6hmo混合物与下列菌种的组合可在婴儿和学步儿童模型两者中获得scfa的最大增加：与长双歧杆菌婴儿亚种的组合以及与动物双歧杆菌乳酸亚种的组合。

技术特征：
1.用于婴儿或幼儿的组合物，所述组合物包含至少一种益生菌菌株和益生元低聚糖混合物，所述益生菌菌株是双歧杆菌，所述益生元低聚糖混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-四糖(lnt)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和3'-唾液酸乳糖(3sl)以及任选的3-岩藻糖基乳糖(3fl)组成；其中所述双歧杆菌包含长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongum subsp.infantis)或者动物双歧杆菌乳酸亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)和长双歧杆菌婴儿亚种的组合；其中所述双歧杆菌中的至少一种是长双歧杆菌婴儿亚种lmg 11588或与该菌株具有至少99.9％的平均核苷酸同一性(ani)的菌株。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述双歧杆菌是动物双歧杆菌乳酸亚种并且所述益生元低聚糖混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-四糖(lnt)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和3'-唾液酸乳糖(3sl)组成。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述双歧杆菌是动物双歧杆菌乳酸亚种和长双歧杆菌婴儿亚种的组合，并且所述益生元低聚糖混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2fl)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-四糖(lnt)、6'-唾液酸乳糖(6sl)和3'-唾液酸乳糖(3sl)组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述双歧杆菌中的至少一种是动物双歧杆菌乳酸亚种cncm i-3446。5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述hmo的混合物基本上由以下物质组成：i.34重量％至85重量％，优选42重量％至71重量％的2fl；ii.10重量％至40重量％，优选14重量％至26重量％的lnt；iii.4重量％至14重量％，优选5重量％至10重量％的dfl；以及iv.9重量％至31重量％，优选10重量％至28重量％的组合的6sl和3sl。6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述hmo的混合物基本上由以下物质组成：i.26重量％至65重量％，优选32重量％至54重量％的2fl；ii.8重量％至30重量％，优选11重量％至20重量％的lnt；iii.3重量％至11重量％，优选4重量％至8重量％的dfl；iv.7重量％至23重量％，优选8重量％至22重量％的组合的6sl和3sl；以及v.12重量％至38重量％，优选17重量％至31重量％的3fl。7.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述hmo的混合物基本上由以下物质组成：i.40重量％至80重量％，优选50重量％至70重量％的2fl；ii.10重量％至40重量％，优选14重量％至26重量％的lnt；iii.4重量％至14重量％，优选5重量％至10重量％的dfl；以及iv.9重量％至31重量％，优选10重量％至28重量％的组合的6sl和3sl。8.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述hmo的混合物基本上由以下物质组成：
i.20重量％至60重量％，优选25重量％至55重量％的2fl；ii.8重量％至30重量％，优选11重量％至20重量％的lnt；iii.2重量％至12重量％，优选4重量％至8重量％的dfl；iv.7重量％至23重量％，优选8重量％至22重量％的组合的6sl和3sl；以及v.10重量％至40重量％，优选11重量％至37重量％的3fl。9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物为选自由以下项组成的列表的营养组合物：婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或2段婴儿配方食品、婴孩食物、婴儿谷物组合物、成长乳、强化剂诸如人乳强化剂、或补充剂。10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于：i)预防和/或治疗婴儿或幼儿的细菌感染；ii)调节婴儿或幼儿的微生物群；和/或iii)预防和/或治疗婴儿或幼儿的变态反应。11.根据权利要求10用于所述用途的组合物，其中所述用途是用于调节婴儿或幼儿的微生物群，并且施用所述组合物导致双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)和/或长双歧杆菌婴儿亚种的丰度增加。12.根据权利要求10用于所述用途的组合物，其中所述用途是用于调节婴儿或幼儿的微生物群；和/或通过增加婴儿或幼儿中肠短链脂肪酸(scfa)的产生来预防和/或治疗此类婴儿或幼儿的变态反应。13.调节婴儿或幼儿的微生物群以增加双歧杆菌(bifidobacteriacea)和/或长双歧杆菌婴儿亚种的丰度的方法，所述方法包括：-向所述婴儿或幼儿施用根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。

技术总结
本发明涉及用于婴儿或幼儿的组合物，该组合物包含至少一种益生菌菌株以及人乳低聚糖的益生元混合物，所述益生菌菌株是双歧杆菌，所述人乳低聚糖的益生元混合物由2'-岩藻糖基乳糖(2FL)、乳二岩藻糖基四糖/二岩藻糖基乳糖(DFL)、乳-N-四糖(LNT)、6'-唾液酸乳糖(6SL)、3'-唾液酸乳糖(3SL)和任选的3-岩藻糖基乳糖(3FL)组成，该组合物可用于(i)预防和/或治疗婴儿或幼儿的细菌感染；(ii)调节婴儿或幼儿的微生物群；和/或iii)预防和/或治疗婴儿或幼儿的变态反应。的变态反应。


技术研发人员：F
受保护的技术使用者：雀巢产品有限公司
技术研发日：2022.01.21
技术公布日：2023/10/7