用于改善免疫应答和/或稳定性的共价修饰的抗原的制作方法

用于改善免疫应答和/或稳定性的共价修饰的抗原
1.本说明书涉及共价修饰的抗原以增强或改变它们的免疫原性和/或稳定性。更具体地，本说明书涉及与一个或多个类固醇酸部分共价缀合的多肽抗原，用于改善细胞免疫和/或改善热稳定性。


背景技术：

2.虽然基于多肽抗原的亚单位疫苗通常被认为是最安全的疫苗，但此类抗原可能不会引发足够强的免疫应答以提供保护性和持久的免疫。此外，虽然响应于covid-19大流行使用基于mrna的疫苗已经引起了很多关注，但是它们相对较差的稳定性和严格的冷藏要求是它们在全球范围内部署的障碍。因此，改善基于多肽抗原的疫苗的免疫原性、功效和稳定性的方法将是高度期望的。


技术实现要素：

3.在第一个方面，本文描述了一种改善多肽抗原免疫原性和/或稳定性的方法，该方法包括提供待修饰的多肽抗原，并将该多肽抗原与一个或多个类固醇酸部分共价缀合以产生修饰的多肽抗原。在一些实施方案中，该修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以在细胞内递送后相对于缺乏所述修饰的多肽抗原增加该修饰的多肽抗原的内体逃逸，其中与相应未修饰的多肽抗原相比，该修饰的多肽抗原在施用于受试者后触发对所述多肽抗原改善的适应性免疫应答。在一些实施方案中，该修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合，使得该修饰的多肽抗原表现出比缀合前该多肽抗原的稳定性更高的稳定性。
4.在另外的方面，本文描述了一种包含如本文所述的修饰的多肽抗原的细胞群(例如，体外或离体的)，或一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含：如本文所述的修饰的多肽抗原和/或细胞群；和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
5.在另一个方面，本文描述了一种用于在受试者中触发针对未修饰的目标多肽抗原的增强的适应性免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
6.在另一个方面，本文描述了一种用于治疗或预防可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
7.在另一个方面，本文描述了一种用于针对感染性疾病对受试者进行疫苗接种的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物，其中该多肽抗原包含引起该感染性疾病的病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的抗原性片段。
8.在另一个方面，本文描述了一种用于治疗或预防可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
9.在另一个方面，本文描述了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
10.在另一个方面，本文描述了如本文所述的修饰的多肽抗原，该修饰的多肽抗原用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的免疫原性组合物。
11.在另一个方面，本文描述了一种用于制备多肽抗原的方法，该方法包括将未修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以产生修饰的多肽抗原，该修饰的多肽抗原表现出比缀合前该多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)。
12.一般定义
13.标题和其他标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求而呈现的。说明书或权利要求中标题或其他标识符的使用不一定要求步骤或要素按字母或数字顺序或按它们所呈现的顺序来进行。
14.当在权利要求和/或说明书中连同术语“包含”使用时，词语“一”或“一种(个)”的使用可以意指“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
15.如本说明书和权利要求中所用，词语“包含”(以及任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(以及任何形式的具有，例如“具有”和“具有”诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(以及任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(以及任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。
16.如本文所用，表述“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially of)”是指给定实施方案所需的那些要素。该表述容许存在不会实质上影响本发明实施方案的基本和新颖特征或功能特征的另外的要素。在本文所述的修饰的多肽抗原的上下文中，表述“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially of)”是指与未修饰的抗原相比改善多肽抗原免疫原性(例如，通过改善专职抗原呈递细胞的抗原呈递)所需的要素。为了更加清楚，该表述不排除其他另外的非必需成分(例如，赋形剂、填充剂、稳定剂或惰性组分)的可能性，这些成分不会实质上改变类固醇酸-肽部分改善多肽抗原的免疫原性的功能或能力。
17.术语“约”用于指示值包括为了确定该值所采用的装置或方法的误差的标准偏差。一般而言，术语“约”意在表示高达10％的可能变化。因此，在术语“约”中包括值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的变化。除非另有说明，否则在范围之前使用术语“约”适用于该范围的两端。
18.本说明书的其他目的、优点和特征将在阅读以下对其具体实施方案的非限制性描述后变得更加明显，这些具体实施方案仅参考附图以举例的方式给出。
附图说明
19.在附图中：
20.图1示出了chacnls抗原配制物的生物化学表征。图1a是表示给定抗原与chacnls部分的共价结合的示意图。图1b示出了代表性的考马斯蓝染色，显示未修饰的ova(第1条线)，或以25x(第2条线)或50x(第3条线)的摩尔比与ova缀合的chacnls。图1c示出了鸡ova的氨基酸序列。预测可及用于chacnls缀合(》50％)的赖氨酸残基以黑色突出显示。预测为弱可及的三个赖氨酸残基加下划线。图1d示出了具有预测为高度(蓝色)、中度(绿色)或较差(黄色)可及赖氨酸残基的赖氨酸残基的ova蛋白的带状结构。图1e示出了代表性的蛋白质印迹(western blot)，显示未修饰的ova(第1条线)、25x比率的chacnls-ova(第2条线)和
50x比率的chacnls-ova(第3条线)。图1f示出了nova或各种chacnls:ova比率的chacnls-ova(cova)响应于热应激的固有色氨酸荧光(itf)分析。图1g和图1h示出了各种cova变体对dc的抗原呈递功效的影响。图1g示出了图1h中测试的不同变体的代表性示意图。图1h示出了使用与经不同变体处理的dc共培养的siinfekl特异性b3z细胞系的应答定量。对于该图，n＝5/组，当与nova组比较时，***p《0.001。
21.图2示出了抗原交叉呈递测定的结果。图2a示意性地示出了用于评估ova应答ot-i(cd8)和ot-ii(cd4)t细胞的抗原经典(mhc-ii)和交叉呈递(mhc-i)测定。图2b示出了由与dc和裸ova(nova)或chacnls-ova(cova)一起孵育的ot-i来源的cd8 t细胞产生的ifn-γ。图2b示出了由与dc和裸ova(nova)或chacnls-ova(cova)一起孵育的ot-ii来源的cd4 t细胞产生的il-2水平。图2d示出了图2c的实验的ifn-γ产生。图2e示出了研究在不同时间点用dc进行ova-dq
tm
(灰色峰)对比chacnls-ova-dq(红色峰)处理的代表性流式细胞术实验的结果。图2f示出了图2e所示的ova-dq/chacnls-ova-dq信号的平均荧光强度(mfi)的定量。对于该实验，n＝5/组，***p《0.001。图2g示出了用nova(上方象形图)与cova(下方象形图)处理的表达gal3-gfp的dc2.4细胞的代表性实验。白色箭头指向一些受损的内体。
22.图3示出了针对t细胞淋巴瘤的同基因预防性疫苗接种。图3a是用于使用ova蛋白进行预防性疫苗接种的时间线的示意图。图3b-图3c示出了在使用裸ova(nova；绿色)或chacnls-ova(cova；红色)脉冲处理的dc进行预防性疫苗接种之后，用eg.7肿瘤攻击的动物的肿瘤生长体积(图3b)和存活率(图3c)的评估。注射eg.7的非免疫小鼠示为“ctl”(黑色)。图3d示出了通过elisa定量的接种疫苗的动物的抗体滴度。图3e示出了源自于用来自本研究的接种疫苗的动物的经nova/cova脉冲处理的dc进行免疫的小鼠的中央记忆(t
cm
)和效应记忆(t
eff
)cd4 t细胞的定量。图3f示出了源自于用来自本研究的接种疫苗的动物的经nova/cova脉冲处理的dc进行免疫的小鼠的中央记忆(t
cm
)和效应记忆(t
eff
)cd8 t细胞的定量。图3g示出了对响应于从本研究的接种疫苗的动物分离的t细胞的体外再刺激的细胞因子/趋化因子产生的luminex
tm
分析。具有最高倍数变化的细胞因子/趋化因子加方框。对于图3b、图3c、图3d和图3e，n＝10/组，***p《0.001。
23.图4示出了直接注射ova蛋白后的免疫评估。图4a是用于使用含或不含疫苗佐剂的ova蛋白进行预防性疫苗接种的时间线的示意图。图4b示出了使用裸ova(绿色；nova)(1μg)、chacnls-ova(红色；cova)(1μg)、含addas03
tm
佐剂(蓝色)的cova(1μg)和含addavax
tm
佐剂(紫色)的cova(1μg)免疫的动物中的平均肿瘤测量值。注射eg.7的非免疫小鼠示为“ctl”(黑色)。图4c示出了图4a所示实验的存活率结果。图4d示出了来自图4a所示实验的抗体滴度的定量。对于该实验，n＝10/组，*p《0.05。
24.图5示出了针对t细胞淋巴瘤的治疗性疫苗接种。图5a是用于治疗性疫苗接种的时间线的示意图。图5b-图5c示出了在使用单独的抗pd-1(“αpd-1”)、含(“+αpd-1”)或不含抗pd-1的经裸ova(“nova”)或chacnls-ova(“cova”)脉冲处理的dc进行同基因治疗性疫苗接种后，用eg.7肿瘤攻击的动物的肿瘤生长体积(图5b)和存活率(图5c)。注射eg.7的非免疫小鼠示为“ctl”。图5d-图5e示出了在用抗pd-1(黑色虚线)、不同细胞数目的(3k，紫色；30k，蓝色；100k，绿色；300k，红色)含抗pd-1或不含抗pd-1(300k，橙色)的经chacnls-ova(“cova”)脉冲处理的dc进行同种异体治疗性疫苗接种后，用eg.7肿瘤攻击的动物的肿瘤生长体积(图5d)和存活率(图5e)的评估。对于所有图，n＝10/组。
25.图6示出了针对t细胞淋巴瘤的基于肿瘤裂解物的治疗性疫苗接种。图6a是用于同种异体治疗性疫苗接种的时间线的示意图。图6b-图6c示出了在用抗pd-1(黑色虚线；“αpd-1”)、经el4裂解物或el4-chacnls裂解物(“c裂解物”)脉冲处理的balb/c来源的同种异体dc，在有(el4裂解物，紫色；el4-chacnls裂解物，红色)或无(el4裂解物，绿色；el4-chacnls裂解物，蓝色)抗pd-1处理(n＝10/组)的情况下免疫后用el4肿瘤攻击的动物的肿瘤生长体积(图6b)和存活率(图6c)的评估。注射eg.7的非免疫小鼠示为“ctl”(黑色)。图6d示出了肿瘤浸润淋巴细胞(til)研究的实验设计的示意图。图6e示出了对源自图6b和图6c所示的所有组的肿瘤中各种免疫细胞的分析。图6f示出了图6b和图6c中描绘的肿瘤中cd8/treg比率的评估。对于图6b和图6c，n＝10/组。对于图6e-图6g，n＝5/组，772*p《0.05，**p《0.01且***p《0.001。
26.图7示出了用于chacnls-刺突-cov-2配制物的sars-cov-2刺突蛋白。图7a示出了具有预测为高度(蓝色)、中度(绿色)或较差(黄色)可及赖氨酸残基的赖氨酸残基的sars-cov-2刺突蛋白(具有d614g突变的武汉株系)的带状结构的示意图。图7b示出了sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸序列。预测可及用于chacnls缀合(》50％)的赖氨酸残基以黑色突出显示。预测为弱可及的赖氨酸残基加下划线。
27.图8示出了使用不同cov-2刺突蛋白结构域对chacnls-刺突-cov-2疫苗的免疫原性的评价。图8a示出了用全长“裸”刺突-cov-2(未缀合的；nspike-cov-2；黑色柱)或chacnls-刺突-cov-2(“cspike-cov-2”；灰色柱)在addas03或addavax佐剂的存在下进行疫苗接种的小鼠的抗体滴度。在17周时给予小鼠额外的加强注射。通过elisa测量igg抗体滴度。图8b示出了来自图8a的研究的不同同种型滴度。图8c示出了用cov-2刺突蛋白的s1-rbd部分、“裸”s1-rbd-cov-2(未缀合的；ns1-rbd-cov-2；黑色柱)或chacnls-s1-rbd-cov-2(“cs1-rbd-cov-2”；灰色柱)在addas03或addavax佐剂的存在下注射或单独注射进行疫苗接种的小鼠的抗体滴度。通过elisa测量igg抗体滴度。图8d示出了在第18周用cov-2刺突蛋白的s2部分、“裸”s2-cov-2(未缀合的；ns2-cov-2；黑色柱)或chacnls-s2-cov-2(“cs2-cov-2”；灰色柱)在addas03或addavax佐剂的存在下注射或单独注射进行疫苗接种的小鼠的抗体滴度。通过elisa测量igg抗体滴度。图8e示出了用于评估对所产生的抗体的中和能力的体外感染性中和测定的结果。如nt
50
滴度所示，与nspike-cov-2相比，从经过cspike-cov-2免疫的小鼠分离的抗体在抑制hek细胞的病毒感染方面更有效。对于该图，n＝5/组，*p《0.05，**p《0.01且***p《0.001。
28.图9示出了在体外t细胞再刺激后通过luminex
tm
进行的细胞因子谱分析。图9a示出了使用源自用含两种不同佐剂的nspike-cov-2进行疫苗接种的小鼠的t细胞进行的细胞因子谱分析。图9b示出了使用源自用含两种不同佐剂的cspike-cov-2进行疫苗接种的小鼠的t细胞进行的细胞因子谱分析。
29.图10示出了疫苗在兔中的免疫原性的评价。图10a示出了实验设计的示意图。在该实验中测试了三种剂量的cspike-cov-2。图10b示出了对每2周收集的血清评估的抗体滴度，n＝3/组，***p《0.001。
30.图11示出了cspike-cov-2在攻击模型中的治疗功效的评价。图11a示出了在仓鼠中进行疫苗功效研究的实验设计的示意图。图11b示出了响应于与fda批准的(gmp级)montanide
tm
isa 720vg佐剂或addas03混合的cspike-cov-2疫苗的抗体滴度。使用过量比率
的chacnls与刺突-cov-2蛋白(10x和50x)测试疫苗。
31.图12示出了对所产生的抗体针对各种sars-cov-2变体的交叉反应性的评价。图12a示出了本研究中使用的sars-cov-2刺突变体以及rbd结构域中的不同突变的示意图。图12b示出了使用含或不含佐剂的分离自cspike-cov-2疫苗接种的小鼠的血清针对不同rbd结构域的抗体滴度。图12c示出了基于图12b所示数据的与所有测试变体的交叉反应性的百分比。图12d示出了针对各种病毒变体获得的中和水平。该图所示的数据以n＝5/组及*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001进行。
32.图13示出了在eurocine
tm
佐剂的存在下使用印度(in)cov-2刺突蛋白变体(cspike-cov-2-in)，对cspike-cov-2疫苗的免疫原性的评价。图13a示出了用于cspike-cov-2-in疫苗接种的方案的示意图。图13b和图13c分别示出了与盐水对照相比，在cspike-cov-2-in疫苗接种的小鼠的血清中的igg和iga滴度。对于图13c，对在第5周收集的样品进行分析。图13d和图13e示出了在第6周对cspike-cov-2-in疫苗接种的小鼠的支气管肺泡灌洗液(balf)中的igg和iga滴度分析。对于该研究，*p《0.05且**p《0.01。对于图b应用双因素anova检验。对于图c、图d和图e进行单因素anova(bonferroni检验)。
33.图14示出了使用印度(in)cov-2刺突蛋白变体对cspike-cov-2-in疫苗的细胞因子/趋化因子分析。示出了使用重组刺突蛋白进行体外脾细胞再刺激三天后进行的细胞因子(图14a)和趋化因子(图14b)应答的luminex
tm
分析。通过灰色突出显示描绘的细胞因子或趋化因子与对照(ctl；盐水)动物相比具有显著波动。所示单位为pg/ml。
34.图15示出了来自于用使用印度(in)cov-2刺突蛋白变体的cspike-cov-2-in疫苗接种的小鼠的血清来源的igg与各种cov-2刺突蛋白变体的交叉反应性。原始武汉株系刺突蛋白用作与其余变体的比较。对于该测定，n＝5/组，针对原始sars-cov2株系*p《0.05。
35.图16a-图16d示出了使用10x或50x过量摩尔比的胆汁酸-nls反应物与ova抗原的不同胆汁酸-nls-ova缀合物制剂的代表性sds-page凝胶。
36.图17示出了与不同类型的胆汁酸-nls部分缀合的ova抗原(0.1mg/ml)对树突细胞的抗原呈递的影响。对于该实验，bmdc用作b3z报告系统中的抗原呈递细胞。所测试的对照包括无抗原(“pbs”)和单独的抗原(即，未缀合的)(“单独的ova”；5mg/ml)。od
570
水平表示ova呈递水平，虚线表示用与ova缀合的原始chacnls(“ca-sv40”)获得的信号。胆汁酸：胆酸(ca)；甘氨脱氧胆酸(gdca)；甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)：鹅脱氧胆酸(cdca)；熊脱氧胆酸(udca)；甘氨熊脱氧胆酸(gudca)；脱氧胆酸(dca)；甘氨胆酸(gca)；和石胆酸(lca)。
37.图18示出了与不同类型的胆汁酸-nls部分缀合的ova抗原(0.1mg/ml)对b细胞的抗原呈递的影响。对于该实验，分离的b细胞用作b3z报告系统中的抗原呈递细胞。所测试的对照包括无抗原(“pbs”)和单独的抗原(即，未缀合的)(“单独的ova”；5mg/ml)。od
570
水平表示ova呈递水平，虚线表示用与ova缀合的原始chacnls(“ca-sv40”)获得的信号。胆汁酸：胆酸(ca)；甘氨脱氧胆酸(gdca)；
38.甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)：鹅脱氧胆酸(cdca)；熊脱氧胆酸(udca)；
39.甘氨熊脱氧胆酸(gudca)；脱氧胆酸(dca)；甘氨胆酸(gca)；和石胆酸(lca)。
40.序列表
41.本技术含有2021年11月1日创建的计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
42.seq id no:描述1chacnls2鸡蛋白卵白蛋白(ova)3sars-cov-2刺突糖蛋白(武汉株系d614g)(ncbi ref：6xr8 a)4sars-cov刺突糖蛋白(uniprot p59594)5ova ot-i(cd8)肽6ova ot-ii(cd4)肽7来自sv-40大t抗原的nls8gwg-sv40nls9hnrnpa1 m9 nls10hnrnp d nls11hnrnp m nls12pqbp-1nls13nls2-rg结构域rps1714nls1 rps1715nls2 rps1716nls3 rps1717cmyc nls18hur nls19tus nls20核质蛋白nls
具体实施方式
43.本文描述了涉及改善或改变对多肽抗原的适应性免疫应答和/或改善多肽抗原的稳定性的组合物、细胞和方法。在一些方面，本发明源于本文证明将多肽抗原与类固醇酸部分缀合会触发针对该抗原的改善的细胞免疫，或改善的细胞和体液免疫。在一些方面，本发明源于本文证明将多肽抗原与类固醇酸部分缀合会改善该多肽抗原的稳定性(例如，针对热应力)。在一些实施方案中，本文所述的多肽抗原可经由官能化接头与类固醇酸部分或与类固醇酸-肽部分共价缀合。有利地，当多肽抗原与类固醇酸-肽部分缀合时，可以将肽设计成包含一个或多个结构域，这些结构域赋予修饰的多肽抗原期望的功能性(例如，蛋白质转导和/或亚细胞靶向)，这可以进一步增强免疫原性。
44.在第一个方面，本文描述了一种用于改善多肽抗原的免疫原性的方法。该方法通常包括选择/提供待修饰的合适多肽抗原，并将该多肽抗原与类固醇酸部分共价缀合以产生修饰的多肽抗原。在一些实施方案中，该修饰的多肽抗原与许多类固醇酸部分缀合，这些类固醇酸部分足以在施用于受试者后增加针对该多肽抗原的细胞和/或体液免疫应答(例如，与相应未修饰的多肽抗原相比)。在一些实施方案中，该修饰的多肽抗原与许多类固醇酸部分缀合，这些类固醇酸部分足以在细胞内递送后增加该修饰的多肽抗原的内吞作用和/或内体逃逸(例如，与相应未修饰的多肽抗原相比)。在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原相比，该修饰的多肽抗原在施用于受试者后触发针对该多肽抗原的改善的适应
性免疫应答(例如，改善的细胞和/或体液免疫应答)。
45.多肽抗原通常被抗原呈递细胞(例如，树突细胞)捕获，但最初被俘获在内体中。内体向溶酶体的成熟化导致ph降低和介导非特异性抗原降解的蛋白水解酶的活化。因此，产生的一些抗原性片段然后可以通过内体孔隙到达胞质溶胶，在胞质溶胶中在mhc i类呈递之前通过蛋白酶体机制发生进一步的抗原降解。尽管这个过程是自然发生的，但所产生的最终离开内体的抗原片段可能是小的和/或受损的，致使它们不适合蛋白酶体降解，从而阻碍它们的mhc i类呈递并因此阻碍基于呈递的细胞免疫。不受理论的束缚，本文所述的修饰的多肽抗原的增加的内体逃逸可使抗原(或较大的抗原片段)能够以更天然的构象到达胞质溶胶。因此，这些更天然的抗原的蛋白酶体降解可产生更多数目的在抗原呈递细胞表面经由mhc i类呈递的免疫原性肽和/或稳定肽，从而引发有效的t细胞激活。
46.如本文所用，“多肽抗原”是指任何长度但通常至少8、9、10、11或12个氨基酸长的免疫原性肽连接的氨基酸链。为了更加清楚，本文所指的多肽抗原不包括抗原结合抗体或其片段。如本文所用，“蛋白质抗原”是指长度为至少50个氨基酸残基的多肽抗原，而“肽抗原”是指长度小于50个氨基酸残基的多肽抗原。为了更加清楚，本文所述的多肽、蛋白质和肽可以包含或者可以不包含任何类型的修饰(例如，化学修饰或翻译后修饰，诸如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化、苏素化、异戊烯化、泛素化等)或掺入一种或多种合成氨基酸或非天然氨基酸，达到该修饰或合成氨基酸或非天然氨基酸不会破坏该多肽抗原的抗原性或该肽(或其中包含的结构域)的所需功能性的程度。
47.在一些实施方案中，本文所述的修饰的多肽抗原可以与足够数目的类固醇酸部分缀合，使得该修饰的多肽抗原表现出比缀合前该多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)(实施例2及图1g和图1h)。
48.在一些实施方案中，本文所述的多肽抗原可以是蛋白质抗原。在一些实施方案中，蛋白质抗原可有利地包含可与类固醇酸或类固醇酸-肽部分缀合的多个可用官能团。相反，肽抗原可以不包含足够数目的用于类固醇酸缀合的官能团。此外，类固醇酸-肽抗原缀合物可能不合需要地自组装成棒状纳米颗粒，如在azuar等人，2019中所报道的，其中来自不同的修饰的肽抗原的疏水性类固醇酸基团聚集并且隔绝在内部，从而防止它们与膜相互作用并且介导内体逃逸的能力。内体逃逸不足可能不会对mhc ii类呈递产生负面影响，因此可能有益于体液免疫，但不可能有益于细胞免疫(azuar等人，2019)。
49.在一些实施方案中，本文所述的蛋白质抗原可包含(或者可经工程改造为包含)1至50、2至50、5至50或10至50个可用于与本文所述的类固醇酸或类固醇-肽部分缀合的官能团(例如，赖氨酸和/或半胱氨酸残基；或任何其他基团)。在一些实施方案中，该多肽抗原可以是长度为至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个氨基酸的蛋白质抗原。在一些实施方案中，多肽抗原可以是具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150kda的分子量的蛋白质抗原。在一些实施方案中，本文所述的多肽抗原可包含一个或多个mhc i类表位和/或mhc ii类表位。
50.在一些实施方案中，本文所述的多肽抗原可以是或者可以包括肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的抗原；或它们的任何抗原性片段。在一些实施方案
中，本文所述的多肽抗原可以是或者可以包括来自sars-cov-2(seq id no:3)或sars-cov(seq id no:4)的刺突蛋白或其抗原性变体或抗原性片段。在一些实施方案中，taa、tsa和/或新抗原可以是单核苷酸变体抗原、突变移码抗原、剪接变体抗原、基因融合抗原、内源性逆转录元件抗原或另一类抗原，诸如人白细胞抗原(hla)-体细胞突变来源的抗原或翻译后tsa(smith等人，2019)。在一些实施方案中，tsa可以是病毒来源的癌抗原，诸如来自人乳头瘤病毒(hpv)、巨细胞病毒或eb病毒(ebv)。在一些实施方案中，taa可以是或者可以包括癌-睾丸抗原、her2、psa、trp-1、trp-2、epcam、gpc3、cea、muc1、mage-a1、ny-eso-1、ssx-2、间皮素(msln)或egfr(patel等人，2017；tagliamonte等人，2014)。在一些实施方案中，本文所述的多肽抗原可以是或者可以包括细胞裂解物或源自肿瘤的其他物质，诸如肿瘤来源的外来体。
51.在一些实施方案中，多肽抗原可以与增强内化货物的内吞作用和/或内体逃逸的类固醇酸部分缀合。不受理论的束缚，已经证实类固醇酸(例如，胆汁酸和胆汁酸类似物)被病毒利用/采用以促进它们对宿主细胞的感染，诸如通过增加它们的内吞摄取和/或内体逃逸以能够进入胞质溶胶(shivanna等人，2014；shivanna等人，2015；murakami等人，2020)。例如，已经证实胆汁酸会触发酶酸性鞘磷脂酶(asm)在内体的内小叶上将鞘磷脂裂解成神经酰胺。增加量的神经酰胺使膜去稳定并促进内体逃逸。在一些实施方案中，适合与本文所述的多肽抗原缀合的类固醇酸包括触发神经酰胺在内体的内小叶上积聚的那些类固醇酸，从而使内体膜去稳定并促进修饰的多肽抗原在细胞内递送后的内体逃逸。在一些实施方案中，适合与本文所述的多肽抗原缀合的类固醇酸包括触发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺的那些类固醇酸。
52.在一些实施方案中，适合与本文所述的多肽抗原缀合的类固醇酸包括胆汁酸(例如，初级胆汁酸或次级胆汁酸)或由胆汁酸组成。在一些实施方案中，该类固醇酸可以是或包括：胆酸(ca)、鹅脱氧胆酸(cdca)、脱氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)、甘氨脱氧胆酸(gdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨脱氧胆酸(cdca)、甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)、牛磺脱氧胆酸(tdca)、甘氨石胆酸(glca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺猪脱氧胆酸(thdca)、牛磺鹅脱氧胆酸(tcdca)、熊胆酸(uca)、牛磺熊脱氧胆酸(tudca)、熊脱氧胆酸(udca)或甘氨熊脱氧胆酸(gudca)，或它们的任何类似物，该类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；触发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺；并且/或者具有比胆酸的疏水性更高的疏水性。
53.经证实疏水性胆汁酸诸如gcdca、tca、gca和ca(但不是亲水性胆汁酸诸如udca)会通过经由asm介导的神经酰胺在顶膜上的积聚而增强内体摄取和内体逃逸来增加gii.3人诺如病毒感染和在宿主肠细胞中的复制(murakami等人，2020)。在一些实施方案中，适合与本文所述的多肽抗原缀合的类固醇酸包括比胆酸疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物或由该胆汁酸或胆汁酸类似物组成。在一些实施方案中，适合与本文所述的多肽抗原缀合的类固醇酸包括比胆酸疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物或由该胆汁酸或胆汁酸类似物组成(例如，cdca、dca、lca、tca、tdca、tcdca、gca、gdca或gcdca；hanafi等人，2018)。
54.在一些实施方案中，每个修饰的多肽抗原的类固醇酸部分的平均数可以改变，例如，基于所选择的类固醇酸的类型和/或所选择的多肽抗原的类型(例如，氨基酸长度、结构、可用官能团的数目)。在一些实施方案中，多肽可与摩尔过量的类固醇酸或类固醇酸-肽
部分反应，以使缀合的类固醇酸部分的数目最大化。在一些实施方案中，多肽可与限量的类固醇酸或类固醇酸-肽部分反应，以控制或限制缀合的类固醇酸部分的数目。在一些实施方案中，每个修饰的多肽抗原分子可以与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个类固醇酸部分缀合。在一些实施方案中，该修饰的多肽抗原分子可以在该多肽抗原的溶剂可及胺(例如，伯胺)和/或巯基处与类固醇酸(或类固醇酸-肽)部分缀合。在一些实施方案中，该修饰的多肽抗原分子可以在该多肽抗原上存在的或工程改造到该多肽抗原中的任何其他化学基团或官能团处与类固醇酸(或类固醇酸-肽)部分缀合。应当理解，本文所述的修饰的多肽抗原中包含的类固醇酸部分的最大数目小于或等于该多肽抗原(或官能化多肽抗原)上可用于缀合的可用官能团的数目。在一些实施方案中，该多肽抗原(和/或类固醇酸或类固醇酸-肽部分)可以在将该多肽抗原与该类固醇酸或类固醇酸-肽部分缀合的反应之前，例如用双官能、三官能或多官能接头基团预官能化。
55.在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可以包含在类固醇酸-肽部分中。在一些实施方案中，类固醇酸可与肽预缀合，例如在肽的游离n端氨基处或在肽内的一些其他官能团处。在一些实施方案中，然后可将该多肽抗原经由肽缀合至类固醇酸-肽部分，诸如在肽的n端或c端残基处。
56.在一些实施方案中，该肽可以是非免疫原性肽。在一些实施方案中，该肽可以是水溶性肽，其中与单独的类固醇酸部分相比，肽与类固醇酸缀合增加了类固醇酸-肽部分的水溶性。在一些实施方案中，该肽可以是阳离子肽(例如，其促进血浆和/或内体膜的相互作用)。
57.在一些实施方案中，该肽可包含一个或多个赋予该修饰的多肽抗原附加功能性的结构域。如本文所用，“结构域”通常是指蛋白质的具有特定功能性的一部分。一些结构域当与蛋白质的其余部分分开时，保留它们的功能，因此可以以模块方式使用。许多蛋白质结构域的模块特征可以在它们在本文所述的肽内的布置方面提供灵活性。然而，当在肽的某些位置(例如，n端或c端区域，或介于之间)进行工程改造时，一些结构域可能表现更好。该结构域在其内源性蛋白质内的位置可以是应当在该肽内对该结构域进行工程改造的位置的指示。
58.在一些实施方案中，该肽可包含以非细胞特异性方式刺激内吞作用、内体形成或细胞内递送的蛋白质转导结构域(ptd)。在一些实施方案中，该肽可包含促进该修饰的多肽抗原靶向特定亚细胞区室的亚细胞靶向信号。在一些实施方案中，该肽可包含将该修饰的多肽抗原靶向细胞核的核定位信号(nls)。有趣的是，虽然考虑到在胞质溶胶中发生蛋白体介导的mhc i类肽表位加工，可以预计靶向胞质区室是有利的，但本文所示的结果令人惊讶地证明包含核定位信号的修饰的多肽抗原触发抗原免疫原性的明显增加。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号可包含或者源自来自sv-40大t抗原的nls(例如，pkkkrkv；seq id no:7)或源自其他经典nls。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号可包含或源自非经典nls(例如，hnrnp a1蛋白中的酸性m9结构域；酵母转录阻遏因子matα2中的序列kipik；py-nls；核糖体nls；或u snrnp的复合信号)。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号包含seq id no:1或7-20中任一者的氨基酸序列或其任何部分或基本上由该氨基酸序列或其任何部分组成。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号包含是以下的核定位信号或基
本上由该核定位信号组成：sv40 nls(例如，包含在seq id no:1或7中)、gwg-sv40nls(例如，包含在seq id no:8中)、hnrnpa1 m9 nls(例如，包含在seq id no:9中)、hnrnp d nls(例如，包含在seq id no:10中)、hnrnp m nls(例如，包含在seq id no:11中)、pqbp-1nls(例如，包含在seq id no:12中)、nls2-rg结构域rps17(例如，包含在seq id no:13中)、nls1 rps17(例如，包含在seq id no:14中)、nls2 rps17(例如，包含在seq id no:15中)、nls3 rps17(例如，包含在seq id no:16中)、cmyc nls(例如，包含在seq id no:17中)、hur nls(例如，包含在seq id no:18中)、tus nls(例如，包含在seq id no:19中)或核质蛋白nls(例如，包含在seq id no:20中)。在一些情况下，以上所指的seq id no包含用于促进与多肽抗原缀合的n端半胱氨酸残基(例如，n端半胱氨酸残基的硫醇基团)。因此，在一些实施方案中，本文所指的nls序列可不包括在seq id no:1和7-20中的任一者中包含的n端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，还设想了添加或插入(例如，朝向本文所述的肽的n端至c端部分)以促进类固醇酸-肽与给定多肽抗原缀合的其他官能团(例如，羧基、合成氨基酸等)。
59.在一些实施方案中，本文所述的核定位信号可包含一般共有序列:(i)k(k/r)x(k/r)；(ii)(k/r)(k/r)x
10-12
(k/r)
3/5
，其中(k/r)
3/5
表示五个连续氨基酸中的三个赖氨酸或精氨酸残基；(iii)krx
10-12
krrk；(iv)krx
10-12
k(k/r)(k/r)；或(v)krx
10-12
k(k/r)x(k/r)，其中x是任何氨基酸(sun等人，2016)。
60.在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原相比，本文所述的修饰的多肽抗原可表现出增加的胞质递送。在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原相比，本文所述的修饰的多肽抗原可表现出修饰的多肽抗原的增加的总细胞递送。在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原相比，本文所述的修饰的多肽抗原可表现出针对该多肽抗原的增强的细胞免疫。在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原相比，本文所述的修饰的多肽抗原在暴露于所述多肽抗原后表现出cd8+t细胞的ifn-γ产生增加。在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原相比，本文所述的修饰的多肽抗原表现出针对所述多肽抗原的增强的体液免疫。在一些实施方案中，与相应未修饰的多肽抗原(例如，包括针对弱免疫原性表位的抗体)相比，本文所述的修饰的多肽抗原触发针对该多肽抗原的抗体物质的种类(或生物多样性)增加。
61.在一些方面，本文描述了一种包含本文所述的修饰的多肽抗原或用本文所述的修饰的多肽抗原处理的细胞群(例如，体外或离体的)。在一些实施方案中，本文所述的细胞群可包括免疫细胞(例如，t细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞)、表达mhc i类的细胞、表达mhc ii类的细胞或它们的任何组合。
62.在一些方面，本文描述了一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含：本文所述的或通过本文所述的方法产生的修饰的多肽抗原，或本文所述的细胞群，或它们的任何组合，以及药学上可接受的赋形剂和/或佐剂(例如，适合人或动物使用的疫苗佐剂)。在一些实施方案中，该佐剂可以是乳液佐剂，诸如水包油乳液佐剂(例如，基于角鲨烯的水包油乳液佐剂)。在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物可以是治疗性或预防性疫苗(例如，抗癌疫苗、抗病毒疫苗或抗细菌疫苗)。在一些实施方案中，与使用缺少类固醇酸缀合的相应未修饰的多肽抗原时的量相比，本文所述的修饰的多肽抗原可以使得产生免疫应答所需的配制在免疫原性组合物(例如，疫苗)中的抗原和/或抗原呈递细胞的量减少。
63.在一些方面，本文描述了一种用于在受试者中触发针对目标多肽抗原的增强的适
应性免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
64.在另一个方面，本文描述了一种用于治疗或预防可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
65.在一些方面，本文描述了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，该方法可以与免疫检查点抑制剂疗法或其他抗癌治疗组合。
66.在一些方面，本文描述了如本文定义的修饰的多肽抗原，该修饰的多肽抗原用于在受试者中产生免疫应答。在一些方面中，本文描述了如本文定义的修饰的多肽抗原，该修饰的多肽抗原用于制造用于在个体中产生免疫应答的免疫原性组合物(例如，疫苗或免疫疗法)。在一些方面，本文描述了如本文定义的修饰的多肽抗原、通过本文所述的方法产生的修饰的多肽抗原、本文所述的细胞群或本文所述的免疫原性组合物用于在受试者中产生免疫应答的用途。在一些方面，本文描述了如本文定义的修饰的多肽抗原、通过本文所述的方法产生的修饰的多肽抗原、本文所述的细胞群或本文所述的免疫原性组合物用于制造用于在受试者中产生免疫应答的药物(例如，疫苗或免疫治疗剂)的用途。在一些实施方案中，免疫应答包括与从相应未修饰的多肽抗原产生的相比，针对该多肽抗原的增强的细胞免疫、在暴露于该多肽抗原后cd8+t细胞的增加的ifn-γ产生、针对该多肽抗原的增强的体液免疫、或它们的任何组合。
67.在一些方面，本文描述了一种用于制备多肽抗原的方法，该方法包括将未修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以产生修饰的多肽抗原，该修饰的多肽抗原表现出比缀合前该多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)。在一些实施方案中，与该多肽抗原缀合的类固醇酸部分的数目足以相对于缺乏所述修饰的多肽抗原增加修饰的多肽抗原在细胞内递送后的内体逃逸。在实施方案中，修饰的多肽抗原是如本文所定义的修饰的多肽抗原。
68.条项
69.在各个方面中，本文描述了以下条项中的一个或多个：
70.1.一种改善多肽抗原的免疫原性的方法，所述方法包括提供待修饰的多肽抗原，并将所述多肽抗原与一个或多个类固醇酸部分共价缀合以产生修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以在细胞内递送后相对于缺乏所述修饰的多肽抗原增加所述修饰的多肽抗原的内体逃逸，其中与相应未修饰的多肽抗原相比，所述修饰的多肽抗原在施用于受试者后触发对所述多肽抗原改善的适应性免疫应答。
71.2.根据条项1所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合，使得所述修饰的多肽抗原表现出比缀合前所述多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)。
72.3.根据条项1或条项2所述的方法，其中所述多肽抗原是蛋白质抗原，并且/或者具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150kda的分子量。
73.4.根据条项1至3中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原包含一个或多个mhc i类表位和/或mhc ii类表位。
74.5.根据条项1至4中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括肿瘤相关抗原
(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的抗原；或它们的任何抗原性片段。
75.6.根据条项1至5中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括冠状病毒抗原(例如，sars-cov-2刺突蛋白(seq id no:3)或sars-cov刺突蛋白(seq id no:4)或其抗原性片段；或癌抗原，诸如单核苷酸变体抗原、突变移码抗原、剪接变体抗原、基因融合抗原、内源性逆转录元件抗原，或另一类抗原，诸如人白细胞抗原(hla)-体细胞突变来源的抗原或翻译后tsa、病毒来源的癌抗原(例如，来自人乳头瘤病毒(hpv)、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv))、癌-睾丸抗原、her2、psa、trp-1、trp-2、epcam、gpc3、cea、muc1、mage-a1、ny-eso-1、ssx-2、间皮素(msln)、egfr、细胞裂解物或源自肿瘤的其他物质(例如，肿瘤来源的外来体)。
76.7.根据条项1至6中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸触发神经酰胺在内体的内小叶上的积聚，从而使内体膜去稳定并促进所述多肽抗原在细胞内递送后的内体逃逸。
77.8.根据条项1至7中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸引发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺。
78.9.根据条项1至8中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸是胆汁酸。
79.10.根据条项1至9中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸是初级胆汁酸或次级胆汁酸。
80.11.根据条项1至10中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸是或包括：(a)胆汁酸，所述胆汁酸是：胆酸(ca)、鹅脱氧胆酸(cdca)、脱氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)、甘氨脱氧胆酸(gdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨脱氧胆酸(cdca)、甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)、牛磺脱氧胆酸(tdca)、甘氨石胆酸(glca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺猪脱氧胆酸(thdca)、牛磺鹅脱氧胆酸(tcdca)、熊胆酸(uca)、牛磺熊脱氧胆酸(tudca)、熊脱氧胆酸(udca)或甘氨熊脱氧胆酸(gudca)；(b)(a)的所述胆汁酸的类似物，所述类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；触发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺；并且/或者具有比胆酸的疏水性更高的疏水性；(c)比胆酸(例如cdca、dca、lca、tca、tdca、tcdca、gca、gdca或gcdca)疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物；或(d)(a)至(c)的任何组合。
81.12.根据条项1至11中任一项所述的方法，其中每个修饰的多肽抗原分子与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个类固醇酸部分缀合。
82.13.根据条项1至12中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原分子在所述多肽抗原的溶剂可及的胺(例如，伯胺)和/或巯基处与所述类固醇酸缀合。
83.14.根据条项1至13中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原分子经由接头(例如，双官能接头、三官能接头或多官能接头)与所述类固醇酸缀合。
84.15.根据条项1至14中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸被包含在类固醇酸-肽缀合物中并且所述多肽抗原与所述类固醇酸-肽缀合物缀合(例如，经由所述肽，诸如在n端或c端残基处)。
85.16.根据条项15所述的方法，其中所述肽：(i)包含刺激内吞作用和/或内体形成的
蛋白质转导结构域；(ii)包含亚细胞靶向信号；(iii)是阳离子肽(例如，非细胞穿透性阳离子肽)；(iv)是非免疫原性肽；或(v)(i)至(iv)的任何组合。
86.17.根据条项16所述的方法，其中所述亚细胞靶向信号是核定位信号，诸如经典nls(例如，来自sv-40大t抗原的nls(例如，pkkkrkv；seq id no:7)或其他经典nls)或非经典nls(例如hnrnp a1蛋白中的酸性m9结构域；酵母转录阻遏因子matα2中的序列kipik；py-nls；核糖体nls；以及u snrnp的复合信号)。
87.18.根据条项16或条项17所述的方法，其中所述核定位信号是：sv40 nls(例如，包含在seq id no:1或7中)、gwg-sv40nls(例如，包含在seq id no:8中)、hnrnpa1 m9 nls(例如，包含在seq id no:9中)、hnrnp d nls(例如，包含在seq id no:10中)、hnrnp m nls(例如，包含在seq id no:11中)、pqbp-1nls(例如，包含在seq id no:12中)、nls2-rg结构域rps17(例如，包含在seq id no:13中)、nls1 rps17(例如，包含在seq id no:14中)、nls2 rps17(例如，包含在seq id no:15中)、nls3 rps17(例如，包含在seq id no:16中)、cmyc nls(例如，包含在seq id no:17中)、hur nls(例如，包含在seq id no:18中)、tus nls(例如，包含在seq id no:19中)或核质蛋白nls(例如，包含在seq id no:20中)；或是具有核定位活性的nls的变体，所述nls包含seq id no:7至20中任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
88.19.根据条项1至18中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原触发：(i)所述修饰的多肽抗原与相应未修饰的多肽抗原相比增加的胞质递送；(ii)所述修饰的多肽抗原与相应未修饰的多肽抗原相比增加的总细胞递送；(iii)与相应未修饰的多肽抗原相比，针对所述多肽抗原增强的细胞免疫；(iv)与相应未修饰的多肽抗原相比，暴露于所述多肽抗原后，cd8+t细胞的ifn-γ产生增加；(v)与相应未修饰的多肽抗原相比，针对所述多肽抗原增强的体液免疫；(vi)与相应未修饰的多肽抗原相比，针对所述多肽抗原的抗体物质的种类增加；或(vii)(i)至(vi)的任何组合。
89.20.一种细胞群(例如，体内或离体的)，所述细胞群包含通过根据条项1至19中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原或根据条项1至19中任一项所述的修饰的多肽抗原。
90.21.根据条项20所述的细胞群，所述细胞群包括免疫细胞(例如，t细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞)、表达mhc i类的细胞、表达mhc ii类的细胞或它们的任何组合。
91.22.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：通过根据条项1至19中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原、根据条项1至19中任一项所述的修饰的多肽抗原、根据条项20或条项21所述的细胞群或它们的任何组合；和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂(例如，乳液佐剂、水包油乳液佐剂或基于角鲨烯的水包油乳液佐剂)。
92.23.根据条项22所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物是治疗性疫苗或预防性疫苗(例如，抗癌疫苗、抗病毒疫苗或抗细菌疫苗)。
93.24.一种用于在受试者中触发针对未修饰的目标多肽抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项22或条项23所述的免疫原性组合物。
94.25.一种用于针对感染性疾病对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项22或条项23所述的免疫原性组合物，其中所述多肽抗原包含引起所
述感染性疾病的病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的抗原性片段。
95.26.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项22或条项23所述的免疫原性组合物。
96.27.根据条项26所述的方法，其中所述方法与免疫检查点抑制剂疗法组合。
97.28.根据条项1至19中任一项所述的，或通过根据条项1至19中任一项所述的方法产生的修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的免疫原性组合物。
98.29.根据条项1至19中任一项所述的修饰的多肽抗原、通过根据条项1至19中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原、根据条项20或条项21所述的细胞群或根据条项22或条项23所述的免疫原性组合物用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的药物(例如，疫苗)的用途。
99.30.根据条项28所述使用的修饰的多肽抗原或根据条项29所述的用途，其中所述免疫应答包括与从相应未修饰的多肽抗原产生的相比，针对所述多肽抗原的增强的细胞免疫、在暴露于所述多肽抗原后cd8+t细胞的增加的ifn-γ产生、针对所述多肽抗原的增强的体液免疫、或它们的任何组合。
100.31.一种用于制备多肽抗原的方法，所述方法包括将未修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以产生修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原表现出比缀合前所述多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)。
101.32.根据条项31所述的方法，其中与所述多肽抗原缀合的类固醇酸部分的数目足以相对于缺乏所述修饰的多肽抗原增加所述修饰的多肽抗原在细胞内递送后的内体逃逸。
102.33.根据条项31或条项32所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原如条项3至19中任一项所定义。
103.34.一种改善多肽抗原的免疫原性的方法，所述方法包括提供待修饰的多肽抗原，并将所述多肽抗原与一个或多个胆汁酸-肽部分共价缀合以产生修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原与足够数目的胆汁酸-肽部分缀合以在施用于受试者后与相应未修饰的多肽抗原相比触发对所述多肽抗原的改善的适应性免疫应答，其中所述胆汁酸-肽部分中包含的所述肽包含核定位信号(nls)。
104.35.根据条项34所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原与足够数目的胆汁酸-肽部分缀合，以相对于相应未修饰的多肽抗原增加所述修饰的多肽抗原在细胞内递送后的抗原呈递。
105.36.根据条项34或条项35所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原与足够数目的胆汁酸-肽部分缀合，使得所述修饰的多肽抗原表现出相对于相应未修饰的多肽抗原更高的热稳定性。
106.37.根据条项34至36中任一项所述的方法，其中将所述多肽抗原与一个或多个胆汁酸-肽部分共价缀合是通过使所述多肽抗原与摩尔过量的所述胆汁酸-肽部分反应来进行的。
107.38.根据条项37所述的方法，其中所述多肽抗原与2倍至100倍摩尔过量的所述胆汁酸-肽部分反应。
108.39.根据条项37所述的方法，其中所述多肽抗原与2倍至50倍摩尔过量的所述胆汁
酸-肽部分反应。
109.40.根据条项37所述的方法，其中所述多肽抗原与5倍至25倍摩尔过量的所述胆汁酸-肽部分反应。
110.41.根据条项34至40中任一项所述的方法，其中每个修饰的多肽抗原所缀合的胆汁酸-肽部分的平均数目为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50；或介于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10和n之间，其中n是所述多肽抗原上可用于缀合的可及位点的总数。
111.42.根据条项34至41中任一项所述的方法，其中所述胆汁酸是：胆酸(ca)、鹅脱氧胆酸(cdca)、脱氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)、甘氨脱氧胆酸(gdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨脱氧胆酸(cdca)、甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)、牛磺脱氧胆酸(tdca)、甘氨石胆酸(glca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺猪脱氧胆酸(thdca)、牛磺鹅脱氧胆酸(tcdca)、熊胆酸(uca)、牛磺熊脱氧胆酸(tudca)、熊脱氧胆酸(udca)或甘氨熊脱氧胆酸(gudca)。
112.43.根据条项34至42中任一项所述的方法，其中所述胆汁酸是ca、cdca、dca、lca、gdca、gca、tca、cdca、gcdca、tdca、glca、tlca、thdca、tcdca、uca、tudca、udca或gudca的类似物，其中所述类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；或触发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺。
113.44.根据条项34至43中任一项所述的方法，其中所述核定位信号是：sv40 nls(seq id no:1或7)、gwg-sv40nls(seq id no:8)、hnrnpa1 m9 nls(seq id no:9)、hnrnp d nls(seq id no:10)、hnrnp m nls(seq id no:11)、pqbp-1nls(seq id no:12)、nls2-rg结构域rps17(seq id no:13)、nls1 rps17(seq id no:14)、nls2 rps17(seq id no:15)、nls3 rps17(seq id no:16)、cmyc nls(seq id no:17)、hur nls(seq id no:18)、tus nls(seq id no:19)或核质蛋白nls(seq id no:20)。
114.45.根据条项34至44中任一项所述的方法，其中所述核定位信号是具有核定位活性的nls的变体，所述nls包含seq id no:7至20中任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
115.46.根据条项34至45中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原经由接头与所述一个或多个胆汁酸-肽部分缀合。
116.47.根据条项46所述的方法，其中所述接头是双官能接头、三官能接头或多官能接头。
117.48.根据条项34至47中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原分子经由所述多肽抗原的溶剂可及的官能团与所述一个或多个胆汁酸-肽部分缀合。
118.49.根据条项34至48中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、源自肿瘤的细胞裂解物、肿瘤来源的外体、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的其他抗原。
119.50.根据条项34至49中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括sars-cov刺突蛋白或其抗原性片段。
120.51.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：通过根据条项34至50中任一
项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原或包含通过根据条项34至50中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原的细胞群，以及药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
121.52.根据条项51所述的免疫原性组合物，其中所述细胞群包括树突细胞、b细胞、t细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞、表达mhci类的细胞、表达mhc ii类的细胞或它们的任何组合。
122.53.一种用于在受试者中触发针对未修饰的目标多肽抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项52所述的免疫原性组合物。
123.实施例
124.实施例1：一般材料和方法
125.动物和伦理
126.六至八周龄的balb/c小鼠购自jackson laboratories(bar harbor,me,usa)，而相似年龄的c57bl/6小鼠购自charles river(montreal,qc,canada)。将同窝出生的小鼠在免疫学和癌症研究所(iric)的动物设施的无病原体环境中交配和饲养。动物实验方案经过蒙特利尔大学动物保护委员会批准。
127.细胞系和试剂
128.除非另有说明，否则所有细胞培养基和试剂均购自wisent bioproducts(st-bruno,qc,canada)。除非另有说明，否则所有流式细胞术抗体均购自bd biosciences(san jose,ca,usa)。来自鸡蛋白的白蛋白(卵白蛋白；ova)、lps和nunc maxisorp
tm
板购自sigma-aldrich(st-louis,mi,usa)。ova-dq
tm
购自thermofisher(waltham,ma,usa)。siinfekl肽由genscript(piscataway,nj,usa)合成。bradford试剂购自bio-rad(hercules,ca,usa)。除非另有说明，否则所有细胞因子elisa均购自r&d systems(minneapolis,mn,usa)。重组gm-csf购自peprotech(rocky hill,nj,usa)。cd8和cd4 t细胞分离试剂盒购自stemcell technologies(vancouver,bc,canada)。用于体内研究的pd-1抗体(克隆rmp1-14)购自bioxcell(west lebanon,nh,usa)。
129.骨髓来源的dc的产生
130.通过使用补充有10％胎牛血清(fbs)、50u/ml青霉素-链霉素、2mm l-谷氨酰胺、10mm hepes、1％ mem非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、0.5mm对巯基乙醇的rpmi
tm
1640冲洗来自小鼠股骨的整个骨髓来产生小鼠骨髓来源的dc(bmdc)。在红细胞裂解后，然后在补充有50ng/ml鼠重组gm-csf的培养基中培养细胞。在第2、4、6和8天更换培养基。在第9天，将培养基替换为包括重组鼠gm-csf和来自大肠杆菌o111的lps(1ng/ml)以刺激dc成熟。通过流式细胞术评估成熟dc的cd3、cd19、nk1.1、cd11c、cd80、cd86和i-ab的表面表达。
131.对蛋白质抗原中可及赖氨酸建模
132.使用rcsb pdb和swiss-model expasy
tm
免费访问软件对抗原3d结构进行建模。鉴定表示赖氨酸残基的可及氨基酸，并根据它们的可及率突出显示(蓝色：高；绿色：中等，及黄色：差)。
133.癌细胞裂解物制备
134.为了制备癌细胞裂解物，通过以1500rpm离心5分钟收集培养的el4细胞，接着用pbs进行两次洗涤步骤以去除痕量的fbs。然后将细胞分别在液氮/沸水中进行5轮冷冻和融化。为了去除大颗粒，使用g26针将裂解物切碎，使其通过70μm细胞滤网，然后通过0.45μm过
滤器过滤。然后使用bradford试剂对获得的裂解物进行定量，等分并储存于-80℃直至使用。
135.chacnls-抗原配制物的产生
136.除非另有说明，否则如先前在beaudolin等人，2016中所述那样合成chacnls。将ova、ova-dq或癌细胞裂解物以1-10mg/ml溶解在含有或不含其他配制组分但不含胺(nh3)或巯基(sh)基团的无菌pbs中。使用不同的摩尔过量比率(5
×
、10
×
、25
×
、50
×
)将sm(peg)4交联剂添加到反应中保持1小时。通过centricon
tm
过滤和sephadex
tm
柱弃去游离的sm(peg)4交联剂。以相同的摩尔过量比率添加chacnls并孵育1小时以获得每个抗原连接的不同量的chacnls部分。除非另有说明，否则在实施例中测试的cova缀合物是使用50
×
摩尔过量比率产生的。通过centricon过滤和sephadex柱去除游离的未连接的chacnls。将chacnls修饰的抗原在无菌pbs中浓缩，以获得通过uv吸光度测定的5-10mg/ml最终浓度。
137.为了评价chacnls负载，在还原条件下在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离10μg的ova或chacnls-ova缀合物，并用考马斯亮蓝r-250
tm
(bio-rad,mississauga,on,canada)染色。测量凝胶中相对于蓝色染料前沿(rf)的迁移距离，并将引入ova中的chacnls部分的数目分类为低、中和高chacnls载量，通过参考在相同条件下进行电泳的kaleidoscope预染色标准品(bio-rad)的分子量对比1/rf的对数图来进行估计。另外，进行针对ova的蛋白质印迹分析以确认考马斯结果。
138.chacnls-ova的生物化学表征
139.由charles river(wilmington,ma,usa)进行一系列测试包括：1)差示扫描量热法或动态光散射，2)圆二色性(cd)远紫外和近紫外光谱扫描及傅立叶变换红外光谱法(ftir)，3)尺寸排阻色谱法联合多角度激光散射，4)固有色氨酸荧光(itf)，5)肽作图(通过lc-ms/ms进行的参考标准表征)，和6)经由lc-ms测定完整和亚单位分子量以表征chacnls-ova修饰的抗原。
140.胆汁酸-nls部分的产生
141.除非另有说明，否则胆酸-nls部分的合成类似于胆酸-nls(chacnls)的合成，如先前在beaudolin等人，2016中所述。例如，对于ca-sv40nls，将胆酸与13-mer肽(cgygpkkkrkvgg；seq id no:1)的n端半胱氨酸残基的游离氨基缀合，该肽包含侧接接头氨基酸的来自sv40大t抗原的核定位信号(seq id no:7)。
142.固有色氨酸荧光(itf)的评估
143.使用applied photophysics(leatherhead,surrey,uk)的chirascan
tm
q100圆二色性(cd)光谱仪进行固有色氨酸荧光(itf)分析并且使用vwr数字加热块(radnor,pa)进行干体式温度孵育。对于所有所有4℃孵育都使用chirscan q100自动进样架冷却系统。使用matlab软件(natick,ma)分析数据。简言之，将样品从-20℃下的储存中取出并使其平衡至室温。然后将样品在pbs中从4至5mg/ml范围的储备浓度稀释至0.8mg/ml。然后在不暴露于热应力的情况下(天然)或通过干体式孵育进行10分钟热应力后，分析经过稀释的样品的itf。每种稀释样品的一个等分试样在4℃下孵育，第二等分试样在37℃下孵育，而第三等分试样在80℃下孵育。在上述每种热条件下，将稀释至0.8mg/ml的bsa与样品混合。所有样品在孵育后再平衡至室温。通过在280nm处激发进行itf分析，发射扫描范围为200-600nm，带宽为1.0nm，每点时间为1秒且步长为0.5，一式三份重复8次。将一式三份的光谱减去空白，
取平均值，并使用matlab软件将单位mdeg转化为相对荧光强度。在样品序列之前和之后测定经过稀释的bsa溶液作为对照。
144.dc2.4转染和通过显微镜检查评估损伤的内体
145.对于该测定，将15
×
103个dc2.4细胞接种在24孔板中的无菌盖玻片上。用egfp-hgal3哺乳动物表达载体转染dc2.4细胞后两天，向细胞中添加0.1mg/ml的nova或cova，然后在37℃处孵育3小时。然后将细胞洗涤两次以去除过量的蛋白质，然后固定在载玻片上。通过荧光显微镜(nikon，eclipse
tm
ti2-u)观察载玻片，并使用image j
tm
软件分析结果。
146.通过流式细胞术对产生的bmdc的表型评估
147.为了评估细胞表面标志物的表达，将bmdc与根据制造商的说明使用染色缓冲液(含有2％ fbs的pbs)稀释的各种抗体在4℃处在黑暗中孵育30分钟。在使用染色缓冲液广泛洗涤后，将细胞重悬于400μl染色缓冲液中。通过bd facsdiva
tm
在cantoii
tm
上获取样品，然后使用flowjo
tm
v10分析。
148.监测抗原加工
149.为了评价ova加工，将细胞与10μg/ml ova-dq(有或没有chacnls修饰)在37℃处孵育。30分钟后，洗涤细胞，并添加常规培养基。在指定的孵育时间结束时，收集细胞并用含有2％ fbs的冷pbs洗涤。通过流式细胞术分析细胞来监测荧光。
150.抗原呈递测定
151.为了评价抗原交叉呈递，将细胞以25
×
103个细胞/孔接种在24孔板中(corning；massachusetts,united states)，然后用不同浓度的抗原脉冲处理3小时。在脉冲期结束时，洗涤细胞以去除过量的抗原并使用t细胞分离试剂盒根据制造商的方案与分别从ot-ii或ot-i小鼠的脾脏纯化的106/ml cd4或cd8 t细胞共培养。72小时后，收集上清液并用于通过商业酶联免疫吸附测定(elisa)定量细胞因子的产生。
152.对于b3z测定，首先将5
×
104个dc用所选蛋白质或cova变体脉冲处理3小时，接着洗涤，之后添加5
×
104个b3z细胞。将细胞孵育17小时-19小时，之后进行裂解并且在37℃处用氯酚红-β-d-吡喃半乳糖苷(cprg)溶液再孵育4小时-6小时。使用synergyh1
tm
酶标仪(biotek,winooski,vt,united states)检测光密度信号。
153.通过elisa定量抗体滴度
154.在4℃处将nunc maxisorp
tm
板用1μg稀释于包被缓冲液中的ova包被过夜。第二天，将板洗涤，然后在室温处用3％脱脂乳封闭1小时。在该步骤之后，将板洗涤，之后添加稀释的血清(制备两倍稀释液)。孵育2小时后，将板洗涤，之后添加1:1000稀释的hrp连接的抗小鼠igg二抗。两小时后，将板洗涤，然后在室温处用hrp孵育10分钟-20分钟。hrp淬灭后，使用synergy
tm
h1酶标仪(biotek；winooski,vt,united states)检测信号。
155.免疫和肿瘤攻击
156.对于预防性疫苗接种，雌性c57bl/6小鼠(n＝10/组)在第0天和第14天皮下(sc)注射ova/ova-chacnls(1μg/剂)、用ova配制物(0.1mg/ml)脉冲处理的10
4个
bmdc或肿瘤裂解物(0.1mg/ml)。第二次疫苗接种后两周，用5
×
105个eg.7或el4细胞对小鼠进行皮下(sc)攻击，并随时间评估肿瘤生长。为了评价抗原特异性cd8 t细胞活化，首先在体外用1μg/ml ova刺激从免疫小鼠分离的脾细胞，然后在三天后收集上清液以通过luminex
tm
评估细胞因子/趋化因子的产生。
157.对于治疗性疫苗接种，雌性c57bl/6小鼠(n＝10/组)在第0天接受5
×
105个el4或eg.7细胞的sc注射。五天后(出现～40-60mm3的可触诊的肿瘤)，小鼠sc注射3
×
104个经ova-/ova-chacnls或肿瘤裂解物-/chacnls裂解物脉冲处理的bmdc(注射两次；间隔1周)。对照动物仅接受5
×
105个肿瘤细胞。此后跟踪经治疗的动物的肿瘤生长。对于与免疫检查点抑制剂(例如αpd-1)组合的治疗性疫苗接种，小鼠每2天接受200μg/剂的抗体或其同种型的sc注射，在两周内共6剂。在balb/c小鼠中进行类似方法进行同种异体给药疫苗接种。
158.肿瘤浸润免疫细胞的分析
159.切除肿瘤块后，首先对肿瘤块进行称重，然后用手术剪刀在4-5ml主混合物(master mix)中将肿瘤块切成小块，该主混合物含有混合在补充有5％fbs的dmem中的2mg/ml胶原酶d、2mg/ml胶原酶iv和100μg/ml dna酶iv型。然后在细胞培养箱中在37℃处搅拌该混合物。孵育30分钟后，添加10ml dmem以中和酶促反应。使用70μm细胞滤网过滤经过消化的溶液，并且用柱塞将滤网顶部所有保留的片段捣碎，接着添加1-2dmem以洗涤滤网。然后将收集的细胞以1200rpm(4℃)离心5分钟，用红细胞裂解缓冲液处理1分钟，然后重悬于3-4ml补充有5％ fbs的dmem中。细胞洗涤后，将沉淀重悬于补充有5％ fbs的dmem中，之后开始细胞染色进行流式细胞术分析。
160.使用b3z报告系统的抗原呈递测定
161.使用b3z报告系统筛选各种胆汁酸-nls缀合物。b3z细胞系是对h2-kb-siinfekl复合物具有特异性的t-细胞杂交瘤。一旦经由其tcr活化，lacz报告基因(在nfat启动子控制下)就表达。简言之，将1.5
×
105个bmdc或分离的b细胞与用卵白蛋白(ova)-胆汁酸-nls缀合物处理的5
×
104个b3z细胞在37℃和5％ co2处共培养过夜。第二天，用pbs(ph 7.4)洗涤所有细胞两次，并通过添加100μl在pbs中含有0.15mm氯酚红-β-d-吡喃半乳糖苷(cprg)底物(calbiochem,la jolla,ca)、0.125％ np40(emd sciences,la jolla,ca)、9mm mgcl2(aldrich,usa)和100mm 2-巯基乙醇的裂解缓冲液来裂解细胞沉淀。在37℃处孵育5小时或24小时后，获得570nm处的吸光度，以636nm作为参考波长。对于这些实验，将胆汁酸-nls-ova缀合物以0.1mg/ml重悬于pbs(ph 7.3)中(用10
×
摩尔比的胆汁酸-nls部分:ova制备)，并将单独的ova以5mg/ml重悬。
162.统计分析
163.使用单因素方差分析(anova)计算p值。结果用s.d.误差棒表示为平均值，统计学显著性用星号表示：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
164.实施例2：chacnls抗原配制物的生物化学表征
165.如实施例1所述合成类固醇酸-肽缀合物chacnls。简言之，将胆酸与13-mer肽的n端半胱氨酸残基的游离氨基缀合。该肽(cgygpkkkrkvgg；seq id no:1)包含侧接接头氨基酸的来自sv40大t抗原的核定位信号(加有下划线)。然后将多个chacnls部分与原型多肽抗原ova的可及赖氨酸残基的ε-氨基缀合(seq id no:2；图1c)。图1a中示出了表示给定抗原与chacnls部分的共价结合的示意图。然后如实施例1所述对chacnls-ova进行生物化学表征，并通过考马斯蓝染色(图1b)和蛋白质印迹(图1e)确认结合。生物化学表征揭示，以25
×
比率缀合的chacnls-ova(图1b，第2条线)每个ova平均缀合约四个chacnls部分，对应于分子量(mw)增加约8.6kda。以50
×
比率缀合的chacnls-ova(图1b，第3条线)每个ova平均缀合约八个chacnls部分，对应于mw为约19.2kda。图1d中示出了具有预测为高度(蓝色)、中度
(绿色)或较差(黄色)可及赖氨酸残基的赖氨酸残基的ova蛋白的带状结构。
166.此外，为了评估chacnls-ova(cova)的总体稳定，进行itf分析以测量其在热应力后的解折叠。在该测定中，峰位移或强度的变化指示解折叠，因为多肽残基可能变得暴露于溶剂并经历取向的变化(图1f)。当在天然或热可变条件下测定不同的cova比率时，nova在80℃处经历完全变性，同时对于50
×
cova观察到峰强度的部分降低(图1f)。对于其他cova样品没有观察到itf光谱测量的变化，表明与chacnls部分缀合大大增加抗原稳定性。
167.然后进行使用siinfekl特异性b3z细胞系的抗原呈递测定以比较不同的ova缀合物。如图1g中示意性所示，测试的不同缀合物包括：胆酸-nls部分(“chacnls”)；没有nls肽的与胆酸部分缀合的ova(“chac-ova”)；经由peg4双官能接头与胆酸-nls部分缀合的ova(“chacnls-peg
4-ova”或“cova”)；和经由peg6双官能接头与胆酸-nls部分缀合的ova(“chacnls-peg
6-ova”)。如图1h中所示，在没有nls肽的情况下将ova与单独的胆酸部分缀合(“chac-ova”)与单独的裸ova(“nova”)相比没有产生改善的抗原呈递。引人注目地，经由peg4双官能接头与50
×
摩尔过量的chacnls部分缀合的ova(“cova(50
×
)”)表现出与siinfekl阳性对照肽(“siinfekl”)相同水平的抗原呈递。有趣的是，通过将摩尔过量的chacnls部分减少到5
×
、10
×
和25
×
[“cova(chacnls-peg
4-ova)”]，获得同等水平的抗原呈递，但是这种升高的抗原呈递在2
×
摩尔过量的chacnls部分时丧失。对于经由peg6双官能接头与2
×
至25
×
摩尔过量的chacnls部分缀合的ova(“chacnls-peg
6-ova”)，也观察到与siinfekl阳性对照相当的抗原呈递水平。最后，使用经由长得多的peg
24
双官能接头与5
×
和10
×
摩尔过量的chacnls部分缀合的ova(“chacnls-peg
24-ova”)观察到高于nova但低于siinfekl阳性对照肽的抗原呈递水平，但是相比于nova的抗原呈递增加在2
×
和25
×
摩尔过量时丧失(数据未示出)。
[0168]
实施例3：chacnls-ova的体外交叉呈递
[0169]
为了产生bmdc，冲洗雌性c57bl/6或balb/c小鼠的股骨和胫骨以收集总的有核细胞。然后将细胞用重组gm-csf(10ng/ml)平板接种8天并且每2天更换一次。在第9天添加lps以触发dc成熟，之后进行抗原脉冲处理。通过流式细胞术确认bmdc的成熟。在第9天没有检测到t细胞、b细胞或nk细胞，并且超过80％的bmdc表达cd11c+、cd80+、cd86+和i-ab+。然后将bmdc与不同浓度的裸ova(nova)或chacnls-ova(cova)一起孵育，并添加来自ot-ii转基因小鼠的cd4+t细胞或来自ot-i转基因小鼠的cd8+t细胞。
[0170]
图2a是示出了用于评估ova应答性ot-i(cd8)和otii(cd4)t细胞活化的ova肽(即，siinfekl[用于cd8+t细胞的ot-i肽；seq idno:5]或isqavhaahaeineagr[用于cd4+t细胞的ot-ii肽；seq id no:6])的抗原交叉呈递的设置的示意图。
[0171]
图2b示出了使用ot-i来源的cd8 t细胞产生的ifn-γ的量，该量是交叉呈递活性的量度。引人注目地，与bmdc和cova一起孵育的cd8+t细胞比与裸抗原(nova)一起孵育时产生显著更多的ifn-γ。图2c和图2d分别示出了使用ot-ii来源的cd4 t细胞产生的il-2和ifn-γ的量，该量是经典mhc ii类交叉呈递活性的量度。引人注目地，与bmdc和cova一起孵育的cd4+t细胞比与裸抗原(nova)一起孵育时产生显著更多的ifn-γ。根据这些观察结果，然后监测捕获的ova的细胞内加工。为此，在对离体产生的原代骨髓来源的dc进行脉冲处理之前，将chacnls交联到ova-dq上。尽管可以描绘在dc脉冲处理后3小时两种抗原条件的差异增加，但是与nova相比在脉冲处理后6小时，用chacnls连接的ova-dq处理的dc中的信号
密度显著更高(图2e和图2f)。有趣的是，在3小时或6小时的nova脉冲处理间没有检测到信号强度的差异，表明信号饱和(图2e)。然而，这些观察结果与使用与ot-i(cd8)(图2b)或ot-ii(cd4)t细胞(图2c和图2d)共培养的原代dc的抗原呈递测定相关。
[0172]
为了确定cova是否增强内体到胞质溶胶的逃逸，使用半乳糖凝集素-3(gal3)表达系统作为受损内膜的标志物。更具体地，gal3对通常存在于细胞表面、高尔基体和内吞区室的腔中的p-半乳糖苷缀合物表现出高亲和性。因此，当在正常条件下表达时，gal3均匀分布在整个细胞质中。相反，诱导内体膜破裂使gal3接近并结合腔糖蛋白。因此我们用以与增强绿色荧光蛋白(egfp-gal3)的融合体形式表达gal3的构建体瞬时转染dc2.4细胞系，以评价其分布模式。如所预期的，在用nova处理表达egfp-gal3的dc2.4细胞后，gfp信号广泛分布在整个胞质溶胶中(图2g-上图)。相反，用cova脉冲处理dc2.4诱导几个点的出现，清楚地指示信号重新定位到受损内体(图2g-下图)。
[0173]
实施例4：体内抗癌活性
[0174]
为了确定chacnls修饰的ova作为预防性疫苗的有效性，用cova作为基于细胞的疫苗或单独的疫苗为小鼠接种。对于基于细胞的疫苗，将用nova或cova脉冲处理的bmdc皮下注射到小鼠体内，之后植入eg.7淋巴瘤细胞，接着再攻击。在图3a中描绘了免疫方案。
[0175]
引人注目地，用经过cova脉冲处理的bmdc接种的小鼠没有显示出任何肿瘤生长并且具有100％的存活率，而对照(未接种疫苗)和用经过nova脉冲处理的bmdc接种的小鼠发展出大肿瘤并且更容易死亡(图3b和图3c)。此外，用经过cova脉冲处理的bmdc接种的小鼠发展出更高的抗体滴度(图3d)。另外，在cova-dc组中，cd4效应(cd44hicd62llo)和cd8中央(cd44hicd62lhi)和效应记忆t细胞的水平显著更高(图3e和图3f)。最后，对源自经过体外再刺激的t细胞的细胞因子/趋化因子的luminex
tm
分析显示，与注射nova的小鼠相比，在cova组中ifn-γ水平升高(图3g)。对于巨噬细胞炎性蛋白(mip)-1β和mip-2(单核细胞/巨噬细胞、nk细胞和嗜中性粒细胞的两种强趋化蛋白)以及白介素(il)-6和il-10(已知会支持b细胞分化和抗体产生的两种细胞因子)，也观察到类似的数据(图3g)。总之，在用经过cova脉冲处理的dc接种的动物中观察到的改善的免疫应答与它们获得的对多次eg.7再攻击的抗性和持久的存活益处一致。
[0176]
在类似的免疫方案中，在植入eg.7淋巴瘤细胞之前用cova或单独的nova(非bmdc脉冲的)对小鼠进行接种(图4a)。如图4b所示，与用nova接种的小鼠或未接种疫苗的对照小鼠相比，用cova接种的小鼠发展较小的肿瘤，具有显著增加的存活率(图4c)和抗体应答(图4d)。使用两种基于角鲨烯的油包水型乳液佐剂(addas03
tm
或addavax
tm
)进行疫苗接种均改善了免疫应答效力，addavax在接种cova的小鼠中触发优良效果。
[0177]
实施例5：针对t细胞淋巴瘤的体内治疗性疫苗接种
[0178]
为了确定胆汁酸缀合的多肽抗原作为治疗性疫苗的有效性，首先为小鼠植入eg.7淋巴瘤细胞，然后在存在或不存在免疫检查点抑制剂/抗癌剂抗pd-1抗体的情况下，用经过nova或cova脉冲处理的bmdc免疫。免疫方案示于图5a。
[0179]
与用单独的抗pd-1抗体或经过nova脉冲处理的bmdc免疫的小鼠相比，用经过cova脉冲处理的bmdc免疫的小鼠具有显著更小的肿瘤(图5b)和增加的存活率(图5c)。引人注目地，在治疗小鼠中的t细胞淋巴瘤时用抗pd-1ab和经过cova脉冲处理的bmdc的组合疗法治疗的小鼠显示出协同作用，如肿瘤体积的减小和存活率的增加所示。这种协同作用与小鼠
中免疫接种的经过cova脉冲处理的bmdc的数目直接相关(图5d和5e)。
[0180]
最后，将chacnls与el4 t细胞淋巴瘤裂解物共价连接以确定抗原特异性治疗疫苗的效果。在存在或不存在抗pd-1抗体的情况下，用经过单独的el4裂解物或chacnls-el4裂解物脉冲处理的bmdc免疫植入了el4 t细胞淋巴瘤细胞的小鼠(图6a)。与cova相似，与用单独的抗pd-1ab或用经过el4裂解物脉冲处理的bmdc免疫的小鼠相比，用经过chacnls-el4裂解物脉冲处理的bmdc免疫的小鼠具有显著更小的肿瘤和增加的存活率，而与抗pd-1ab的存在无关(图6b和图6c)。值得注意的是，看到将经过chacnls-el4裂解物脉冲处理的bmdc和抗-pd1 ab治疗组合的协同作用，因为小鼠中的肿瘤生长在36天左右达到稳定，并且在研究结束时(54天)小鼠具有70％的存活率。这些观察结果进一步得到肿瘤浸润性淋巴细胞(til)分析的支持(图6e)，该分析揭示了经过chacnls-el4裂解物(“clysate”)脉冲处理的dc/pd-1中cd8、nk和cd11c免疫效应细胞的募集增强(图6e)。与此形成鲜明对比，在同一组中调控性cd4 t细胞(treg)的水平大大降低(图6e)，支持了将经过clysate脉冲处理的dc与pd-1组合通过使平衡倾斜对比抑制性treg浸润而有利于cd8 t细胞而促进炎症的观点(图6f)。总之，这些发现指示，用chacnls-el4裂解物配制物处理的“现成的同种异体dc”可有效地用作触发有效抗肿瘤应答的通用疫苗。
[0181]
实施例6：针对sars-cov-2的体内治疗性疫苗接种
[0182]
为了确定胆汁酸缀合的多肽抗原作为微生物感染，特别是病毒感染诸如sars-cov-2感染的治疗性疫苗的有效性，构建由与sars-cov-2刺突蛋白共价连接的chacnls组成的疫苗，类似于实施例1、实施例2和实施例4中所述的cova疫苗的构建。
[0183]
图7a和图7b示出了用于chacnls-刺突-cov-2配制物的sars-cov-2刺突蛋白，以及具有预测为高度(蓝色)、中度(绿色)或较差(黄色)可及赖氨酸残基的赖氨酸残基的sars-cov-2刺突蛋白(武汉株系d614g)的带状结构的示意图，类似于ova。如通过sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸序列(seq id no:3；图7b)更好地描述的，预测超过50％的赖氨酸残基可及(以黑色突出显示)用于chacnls缀合。
[0184]
小鼠用全长“裸”刺突-cov-2(未缀合的；nspike-cov-2；黑色柱)或用chacnls-刺突-cov-2(“cspike-cov-2”；灰色柱)在addas03或addavax佐剂的存在下进行疫苗接种(图8a)。在任一种佐剂的存在下，与未缀合的nspike-cov-2相比，在用cspike-cov-2接种的小鼠中观察到针对刺突蛋白的升高的igg滴度。这些igg抗体大部分是igg1同种型，然而，观察到显著水平的igg2a和igg2b(图8b)。
[0185]
为了评价sars-cov-2刺突蛋白的不同结构域的免疫原性，还用未缀合的疫苗和含有s1-rbd或s2部分的缀合疫苗为小鼠接种。在addas03或addavax佐剂的存在下，来自用cov-2刺突蛋白的s1-rbd和s2部分接种的小鼠的滴度显著升高，如图8c和图8d所示。
[0186]
为了评价来自接种疫苗的小鼠的抗刺突igg抗体是否具有中和活性，使用刺突1-假型病毒样颗粒和hek细胞开发了体外感染性中和测定。如图8e所示，与nspike-cov-2相比，用cspike-cov-2接种的小鼠的血清在抑制hek细胞的病毒感染方面更有效，因此具有更强的中和活性，如nt50滴度所示。
[0187]
由与chacnls缀合的刺突蛋白组成的疫苗显示在产生强的体液应答方面是有效的。为了确定相同疫苗在产生细胞应答方面是否有效，在两种不同佐剂的存在下，评估用nspike-cov-2或cspike-cov-2接种的小鼠中体外t细胞再刺激后的细胞因子谱分析。结果
示于图9a和图9b中。在用cspike-cov-2接种的小鼠中，与用nspike-cov-2接种相比，用任一种佐剂都观察到强烈ifn-γ应答，这指示控制病毒感染所需的强烈且一致的th1应答。
[0188]
为了进一步评价sars-cov-2疫苗的免疫原性，在不同佐剂的存在下用不同剂量的cspike-cov-2为兔和仓鼠接种。图10示出了用cspike-cov-2对兔进行疫苗接种设计的示意图(图10a)和在不同时间点和剂量下的igg滴度(图10b)。图11示出了cspike-cov-2在攻击模型中的治疗功效的评价。图11示出了仓鼠中疫苗功效研究的实验设计的示意图(图11a)和响应于混有fda批准的(gmp级)montanide
tm
isa 720vg佐剂或addas03的cspike cov-2疫苗的igg抗体滴度(图11b)。这里，使用过量摩尔比率的chacnls与刺突-cov-2蛋白(10x和50x)测试疫苗。在第三剂之前，用sars-cov-2δ变体在鼻内攻击仓鼠。一般而言，所有剂量的疫苗均被兔子和仓鼠良好耐受，并产生强体液应答。
[0189]
最后，为了评价用cspike-cov-2接种对不同的sars-cov-2变体感染是否具有保护性，测试来自接种疫苗的小鼠的血清对来自加利福尼亚、巴西、南非、英国、印度和δ株系的刺突蛋白的交叉反应性，这些株系相对于“野生型”武汉株系在rbd中具有特定突变(图12a)。如图12b和图12c所示，来自用cspike-cov-2免疫的小鼠的血清与来自所测试的每种sars-cov-2变体的刺突蛋白具有显著交叉反应性。此外，来自接种疫苗的小鼠的血清的抗体具有保护性并且对英国、巴西、南非、δ和加利福尼亚sars-cov-2株系具有强中和活性，如体外中和测定所示(图12d)。
[0190]
总的来说，这些发现指示chacnls-cov-2-刺突蛋白配制物可有效地用作触发有效抗病毒应答的通用疫苗。
[0191]
实施例7：针对不同sars-cov-2变体的体内治疗性疫苗接种
[0192]
为了确定使用源自不同变体的刺突蛋白的sars-cov-2疫苗是否使用相同配制有效，使用来自印度变体的刺突蛋白产生cspike-cov-2-in疫苗。
[0193]
用不同剂量的cspike-cov-2-in疫苗或用盐水(对照)为小鼠接种，并且在不同时间点观察到血清和balf中升高的igg滴度(图13)。此外，通过检测来自用cspike-cov-2-in接种的小鼠的t细胞中的不同细胞因子和趋化因子水平，也观察到强细胞应答(图14)。
[0194]
最后，来自于用cspike-cov-2-in疫苗接种的小鼠的血清与来自测试的所有不同sars-cov-2变体的刺突蛋白具有交叉反应性(图15)。
[0195]
总的来说，这些发现指示chacnls可适应于来自不同sars-cov-2变体的刺突蛋白，以配制触发广泛、保护性和强效的抗病毒应答的有效疫苗。
[0196]
实施例8：与不同胆汁酸-nls缀合物缀合的抗原的抗原呈递增强
[0197]
产生与ova缀合的不同胆汁酸-nls缀合物，并在b3z报告基因测定中评价它们增强dc或b细胞ova抗原呈递的能力。如图16中的sds-page所示，以10
×
或50
×
摩尔过量比率的胆汁酸-nls与ova产生胆汁酸-nls-ova缀合物，但在图17(树突细胞)和图18(b细胞)的抗原呈递测定中仅示出了以10
×
摩尔过量比率产生的缀合物的结果。根据从sds-page结果(例如，图16)计算的相对迁移距离(rf)：10
×
摩尔过量的胆汁酸-nls反应物引起每个ova分子缀合约1-4个胆汁酸-nls部分；25
×
摩尔过量的胆汁酸-nls反应物引起每个ova分子缀合约5-9个胆汁酸-nls部分；并且50
×
摩尔过量的胆汁酸-nls反应物引起每个ova分子缀合约12-20个胆汁酸-nls部分。
[0198]
作为抗原呈递细胞的树突细胞
1710.
[0210]
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技术特征：
1.一种改善多肽抗原的免疫原性的方法，所述方法包括提供待修饰的多肽抗原，并将所述多肽抗原与一个或多个类固醇酸部分共价缀合以产生修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以在细胞内递送后相对于缺乏所述修饰的多肽抗原增加所述修饰的多肽抗原的内体逃逸，其中与相应未修饰的多肽抗原相比，所述修饰的多肽抗原在施用于受试者后触发对所述多肽抗原改善的适应性免疫应答。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合，使得所述修饰的多肽抗原表现出比缀合前所述多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽抗原是蛋白质抗原，并且/或者具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150kda的分子量。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原包含一个或多个mhc i类表位和/或mhc ii类表位。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的抗原；或它们的任何抗原性片段。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括冠状病毒抗原(例如，sars-cov-2刺突蛋白(seq id no:3)或sars-cov刺突蛋白(seq id no:4)或其抗原性片段；或癌抗原，诸如单核苷酸变体抗原、突变移码抗原、剪接变体抗原、基因融合抗原、内源性逆转录元件抗原，或另一类抗原，诸如人白细胞抗原(hla)-体细胞突变来源的抗原或翻译后tsa、病毒来源的癌抗原(例如，来自人乳头瘤病毒(hpv)、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv))、癌-睾丸抗原、her2、psa、trp-1、trp-2、epcam、gpc3、cea、muc1、mage-a1、ny-eso-1、ssx-2、间皮素(msln)、egfr、细胞裂解物或源自肿瘤的其他物质(例如，肿瘤来源的外来体)。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸触发神经酰胺在内体的内小叶上的积聚，从而使内体膜去稳定并促进所述多肽抗原在细胞内递送后的内体逃逸。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸引发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸是胆汁酸。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸是初级胆汁酸或次级胆汁酸。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸是或包括：(a)胆汁酸，所述胆汁酸为：胆酸(ca)、鹅脱氧胆酸(cdca)、脱氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)、甘氨脱氧胆酸(gdca)、甘氨胆酸(gca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨脱氧胆酸(cdca)、甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)、牛磺脱氧胆酸(tdca)、甘氨石胆酸(glca)、牛磺石胆酸(tlca)、牛磺猪脱氧胆酸(thdca)、牛磺鹅脱氧胆酸(tcdca)、熊胆酸(uca)、牛磺熊脱氧胆酸(tudca)、熊脱氧胆酸(udca)或甘氨熊脱氧胆酸(gudca)；(b)(a)的所述胆汁酸的类似物，所述类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；触发增加的酸性鞘磷脂酶(asm)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺；并
且/或者具有比胆酸的疏水性更高的疏水性；(c)比胆酸(例如cdca、dca、lca、tca、tdca、tcdca、gca、gdca或gcdca)疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物；或(d)(a)至(c)的任何组合。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中每个修饰的多肽抗原分子与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2021、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个类固醇酸部分缀合。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原分子在所述多肽抗原的溶剂可及的胺(例如，伯胺)和/或巯基处与所述类固醇酸缀合。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原分子经由接头(例如，双官能接头、三官能接头或多官能接头)与所述类固醇酸缀合。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述类固醇酸被包含在类固醇酸-肽缀合物中并且所述多肽抗原与所述类固醇酸-肽缀合物缀合(例如，经由所述肽，诸如在n端或c端残基处)。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽：(i)包含刺激内吞作用和/或内体形成的蛋白质转导结构域；(ii)包含亚细胞靶向信号；(iii)是阳离子肽(例如，非细胞穿透性阳离子肽)；(iv)是非免疫原性肽；或(v)(i)至(iv)的任何组合。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述亚细胞靶向信号是核定位信号，诸如经典nls(例如，来自sv-40大t抗原的nls(例如，pkkkrkv；seq id no:7)或其他经典nls)或非经典nls(例如hnrnp a1蛋白中的酸性m9结构域；酵母转录阻遏因子matα2中的序列kipik；py-nls；核糖体nls；以及usnrnp的复合信号)。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述核定位信号是：sv40nls(例如，包含在seq id no:1或7中)、gwg-sv40nls(例如，包含在seq id no:8中)、hnrnpa1 m9 nls(例如，包含在seq id no:9中)、hnrnp d nls(例如，包含在seq id no:10中)、hnrnp m nls(例如，包含在seq id no:11中)、pqbp-1nls(例如，包含在seq id no:12中)、nls2-rg结构域rps17(例如，包含在seq id no:13中)、nls1 rps17(例如，包含在seq id no:14中)、nls2 rps17(例如，包含在seq id no:15中)、nls3 rps17(例如，包含在seq id no:16中)、cmyc nls(例如，包含在seq id no:17中)、hur nls(例如，包含在seq id no:18中)、tus nls(例如，包含在seq id no:19中)或核质蛋白nls(例如，包含在seq id no:20中)；或是具有核定位活性的nls的变体，所述nls包含seq id no:7至20中任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原触发：(i)所述修饰的多肽抗原与相应未修饰的多肽抗原相比增加的胞质递送；(ii)所述修饰的多肽抗原与相应未修饰的多肽抗原相比增加的总细胞递送；(iii)与相应未修饰的多肽抗原相比，针对所述多肽抗原增强的细胞免疫；
(iv)与相应未修饰的多肽抗原相比，暴露于所述多肽抗原后，cd8+t细胞的ifn-γ产生增加；(v)与相应未修饰的多肽抗原相比，针对所述多肽抗原增强的体液免疫；(vi)与相应未修饰的多肽抗原相比，针对所述多肽抗原的抗体物质的种类增加；或者(vii)(i)至(vi)的任何组合。20.一种细胞群(例如，体内或离体的)，所述细胞群包含通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原或根据权利要求1至19中任一项所述的修饰的多肽抗原。21.根据权利要求20所述的细胞群，所述细胞群包括免疫细胞(例如，t细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞)、表达mhc i类的细胞、表达mhc ii类的细胞或它们的任何组合。22.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原、根据权利要求1至19中任一项所述的修饰的多肽抗原、根据权利要求20或21所述的细胞群或它们的任何组合；和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂(例如，乳液佐剂、水包油乳液佐剂或基于角鲨烯的水包油乳液佐剂)。23.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物是治疗性疫苗或预防性疫苗(例如，抗癌疫苗、抗病毒疫苗或抗细菌疫苗)。24.一种用于在受试者中触发针对未修饰的目标多肽抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求22或23所述的免疫原性组合物。25.一种用于针对感染性疾病对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求22或23所述的免疫原性组合物，其中所述多肽抗原包含引起所述感染性疾病的病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的抗原性片段。26.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求22或23所述的免疫原性组合物。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法与免疫检查点抑制剂疗法组合。28.根据权利要求1至19中任一项所述的，或通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法产生的修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的免疫原性组合物。29.根据权利要求1至19中任一项所述的修饰的多肽抗原、通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原、根据权利要求20或21所述的细胞群或根据权利要求22或23所述的免疫原性组合物用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的药物(例如，疫苗)的用途。30.根据权利要求28所述使用的修饰的多肽抗原或根据权利要求29所述的用途，其中所述免疫应答包括与从相应未修饰的多肽抗原产生的相比，针对所述多肽抗原的增强的细胞免疫、在暴露于所述多肽抗原后cd8+t细胞的增加的ifn-γ产生、针对所述多肽抗原的增强的体液免疫、或它们的任何组合。31.一种用于制备多肽抗原的方法，所述方法包括将未修饰的多肽抗原与足够数目的类固醇酸部分缀合以产生修饰的多肽抗原，所述修饰的多肽抗原表现出比缀合前所述多肽抗原的稳定性更高的稳定性(例如，热稳定性)。
id no:1或7)、gwg-sv40nls(seq id no:8)、hnrnpa1m9 nls(seq id no:9)、hnrnp d nls(seq id no:10)、hnrnp m nls(seq id no:11)、pqbp-1nls(seq id no:12)、nls2-rg结构域rps17(seq id no:13)、nls1 rps17(seq id no:14)、nls2 rps17(seq id no:15)、nls3 rps17(seq id no:16)、cmyc nls(seq id no:17)、hur nls(seq id no:18)、tus nls(seq id no:19)或核质蛋白nls(seq id no:20)。45.根据权利要求34至44中任一项所述的方法，其中所述核定位信号是具有核定位活性的nls的变体，所述nls包含seq id no:7至20中任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。46.根据权利要求34至45中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原经由接头与所述一个或多个胆汁酸-肽部分缀合。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述接头是双官能接头、三官能接头或多官能接头。48.根据权利要求34至47中任一项所述的方法，其中所述修饰的多肽抗原分子经由所述多肽抗原的溶剂可及的官能团与所述一个或多个胆汁酸-肽部分缀合。49.根据权利要求34至48中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、源自肿瘤的细胞裂解物、肿瘤来源的外体、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的其他抗原。50.根据权利要求34至49中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括sars-cov刺突蛋白或其抗原性片段。51.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：通过根据权利要求34至50中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原或包含通过根据权利要求34至50中任一项所述的方法产生的所述修饰的多肽抗原的细胞群，以及药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。52.根据权利要求51所述的免疫原性组合物，其中所述细胞群包括树突细胞、b细胞、t细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞、表达mhc i类的细胞、表达mhc i i类的细胞或它们的任何组合。53.一种用于在受试者中触发针对未修饰的目标多肽抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求52所述的免疫原性组合物。

技术总结
本文描述了具有改善的免疫原性和/或稳定性的共价修饰的多肽抗原，以及与所述多肽抗原有关的组合物、细胞和方法。多肽抗原与一个或多个类固醇酸部分共价缀合，以改善它们的稳定性和/或在施用于受试者后引发针对所述抗原的改善的细胞免疫或改善的细胞和体液免疫。所述类固醇酸包括胆汁酸和胆汁酸类似物，通过加强内体膜内鞘磷脂向神经酰胺的酶促裂解而增强内体截留的货物的内吞作用和/或内体逃逸。所述类固醇酸部分可以与肽预缀合，并且所述类固醇酸-肽部分随后与所述多肽抗原缀合。所述肽可包含一个或多个赋予所述修饰的多肽抗原附加功能性的结构域。加功能性的结构域。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：防御治疗公司
技术研发日：2021.11.01
技术公布日：2023/10/7