腺相关病毒（AAV）蛋白的肽作图方法与流程

腺相关病毒(aav)蛋白的肽作图方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2021年2月19日提交的名称为“methods for peptide mapping of adeno-associated virus(aav)proteins”的美国临时专利申请63/151,366号的优先权和权益。该专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
3.序列表
4.本技术包含序列表，其已经以ascii格式以电子方式提交，并且据此全文以引用的方式并入本文。在2021年5月6日创建的所述ascii副本命名为w-4332-wo01_sl.txt，大小为7,256字节。
技术领域
5.本公开整体涉及基于lc和lc/ms的用于递送蛋白质(诸如腺相关病毒衣壳蛋白)的综合表征的方法。


背景技术：

6.基因疗法是指出于治疗目的而修饰或操纵活细胞的基因表达或遗传改变。许多基因疗法常用的病毒载体的主要功能是保护被包封的遗传有效载荷(rna或dna)并参与细胞靶向和运输。从临床前研究和临床研究中出现的最有效的病毒载体是腺病毒，诸如腺相关病毒(aav)和慢病毒。探索最多的病毒载体似乎是aav，这是由于它在人体中的风险较低，并且在多种细胞和组织中有效转导。
7.aav是无包膜的单链dna细小病毒，在自然界中发现了许多野生型。在结构上，aav是由排列成五聚体亚结构的60个病毒蛋白(vp)单体组装而成的直径约26nm的二十面体衣壳。每个衣壳以1:1:10的比例含有三个高度同源的vp(vp1、vp2和vp3)，其中vp2(约65kda)由vp3(约60kda)的完整氨基酸序列与n-末端延伸组成，vp1(约80kda)是vp2的n-末端延伸。迄今为止，至少8种不同的aav血清型已经用于基因疗法。尽管这些aav血清型通常显示51％至99％的序列同源性，但它们的vp的一级序列的差异赋予对各种宿主细胞受体的独特结合亲和力，从而导致不同的组织嗜性。


技术实现要素：

8.重组腺相关病毒(raav)由于其非致病性和长期基因表达能力，已经成为主要的基因递送平台。aav衣壳除了保护病毒基因组之外，还在病毒感染性和基因转导中起重要作用，表明组成性病毒蛋白(vp)的价值已被充分表征为基因疗法开发的一部分。然而，有限的样品可用性和vp共有的序列同源性对适应为常规生物制剂开发的现有分析方法提出了挑战。
9.本公开讨论了基于rplc/ms的方法的开发，这些方法用于以降低的样品消耗在肽水平上表征蛋白质，诸如aav衣壳蛋白。本公开整体涉及aav衣壳蛋白。然而，本公开也涉及所有蛋白质。这些方法不应被解释为仅适用于aav衣壳蛋白。本公开的方法允许使用荧光检
测和通过台式飞行时间(tof)质谱仪进行的完整质量/翻译后修饰(ptm)分析来测量vp表达。
10.通过将本公开的方法应用于多种常见的aav血清型，证明了用于基因疗法产品开发的方法的普遍适用性和有效性。还开发了使用1.25μg aav病毒蛋白的一小时酶消化法，提供大于98％的蛋白质序列覆盖率。通过本公开的方法实现的对aav衣壳蛋白的有效且灵敏的分析可以用于改善对aav相关治疗剂的理解，并且在整个商业化过程中指导aav相关治疗剂的开发。
11.基于aav的基因治疗剂的持续进步和扩大的产品管道对产品表征提出了挑战。类似于常规生物制剂，良好表征的aav需要满足纯度、效力和安全性的预定规范和监管标准。该行业需要精确和准确的分析技术来监测产品质量并确保批次间的一致性。此外，随着更多aav治疗剂从早期发现进展到临床开发，分析方法的稳健性、有效性和易用性对于确保顺利过渡到后期开发和商业化变得越来越重要。
12.分析测试raav载体的挑战之一是高度的结构复杂性。多聚体性质以及个体vp的变化使得aav的结构比许多单体重组蛋白治疗剂更复杂。为了进一步增加复杂性，整个raav颗粒不仅由蛋白质组成，而且还包含遗传物质。这显然需要开发除应用于更确定的模式的那些方法之外的方法，以确保aav生物学的独特性质得到完全发挥。
13.本公开描述了一种新的消化方法，其与开发用于肽作图的低微克量的aav相容。通过最大限度减少缓冲液交换和液体转移步骤，极大地减少了蛋白质损失。考虑到有限的样品量，选择整个aav衣壳而不是分离的vp来进行单一酶消化。为了从aav中除去表面活性剂，开发了基于变性sec的8分钟方法来从表面活性剂中分离aav vp。
14.在一些方面，本公开提供了一种表征样品中的蛋白质的方法。该方法包括经由变性尺寸排阻色谱法从样品中除去非离子表面活性剂，以形成变性样品；经由液相色谱法洗脱变性样品，以收集该样品的级分，其中该样品的级分包括蛋白质级分；将蛋白质级分冻干，以增加蛋白质浓度；用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分，以使蛋白质变性；用酶消化所变性的蛋白质级分；以及对所消化的蛋白质级分进行分析。
15.在一些实施方案中，该方法还包括在将蛋白质级分冻干之前向该蛋白质级分中添加甲硫氨酸。
16.在一些实施方案中，蛋白质级分少于10μg。在一些实施方案中，蛋白质级分包括腺相关病毒衣壳蛋白。
17.在一些实施方案中，对所消化的蛋白质级分进行分析包括用液相色谱-质谱联用法进行分析。经由液相色谱-质谱联用法对所消化的蛋白质级分进行分析可以包括对所消化的蛋白质级分的完整质量/翻译后修饰进行分析。在某些实施方案中，经由液相色谱-质谱联用法对所消化的蛋白质级分进行分析可以包括台式飞行时间(tof)质谱仪。在一些实施方案中，对所消化的蛋白质级分进行分析包括用荧光检测法测量病毒蛋白表达。而在一些实施方案中，对所消化的蛋白质级分进行分析包括提供大于95％的蛋白质序列覆盖率。特别地，对所消化的蛋白质级分进行分析可以包括提供大于97％的蛋白质序列覆盖率。
18.在一些实施方案中，缓冲液还包含还原剂。在某些实施方案中，缓冲液可以还包含还原剂和金属螯合剂。
19.在一些实施方案中，酶是胰蛋白酶。
20.在一些实施方案中，用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分以使蛋白质变性是在高于65℃的温度下进行的。用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分以使蛋白质变性可以进行少于约5分钟，例如约3分钟。
21.在一些实施方案中，用酶消化所变性的蛋白质级分在约30℃至约50℃的温度范围内进行约50分钟至约70分钟。在某些实施方案中，用酶消化所变性的蛋白质级分进行约60分钟。
附图说明
22.通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
23.图1是本公开的消化工作流程的一个实例的流程图。
24.图2a、图2b、图2c和图2d显示了使用变性尺寸排阻色谱法(sec)来除去表面活性剂。
25.图3a示出了aav完整蛋白(vp3)的xic，其显示未消化的蛋白质非常少。图3b示出了aav肽图的总离子色谱图(tic)。
26.图4a和图4b显示了使用约1.25μg蛋白质作为酶消化的起始材料对aav5 vp进行肽分析的结果。图4b公开了seq id no:4。
27.图5a、图5b和图5c显示经由串联质谱法鉴定aav5 vp的n-末端肽。图5a至图5c按出现顺序分别公开了seq id no:1、1至2、2至3和3。
具体实施方式
28.为了表征raav载体，已经使用x射线晶体学和冷冻电子显微镜(cryo-em)来确定多种aav血清型的三维(3d)结构，结果显示，仅vp3共同序列是有序的。虽然这些对3d结构的研究揭示了病毒体的关键结构信息，但是仅提供了处于低能状态的衣壳拓扑结构的“快照”。已经付出努力来进行分子水平研究，这些研究通常在常规生物治疗药物的整个开发过程中进行。焦点之一是建立对衣壳组成(例如，翻译后修饰(ptm))及其对病毒感染性和功效的潜在影响的深入理解。
29.基因疗法是快速增长的市场。这种疗法将治疗性基因递送到功能障碍细胞以治愈疾病。aav是最流行的基因递送载体/媒介物。本公开讨论了基因疗法开发中对腺相关病毒(aav)衣壳蛋白进行lc-ms肽作图。在对aav进行肽作图中的一些挑战包括：样品可用性有限；在缓冲液交换中，制剂中的非离子表面活性剂难以除去并且蛋白质回收率低；以及蛋白质浓度低。典型的样品制备需要缓冲液交换来除去表面活性剂和变性剂。典型的样品制备还需要10μg至20μg蛋白质，并且表面活性剂的去除通常是无效的。较小的样品量在过滤器上存在非特异性吸附，因此导致蛋白质回收率低。aav生产成本高，因而剂量低(1e13 vg/ml样品含有约5μg/ml vp1和vp2，以及约45μg/ml vp3)(zolgensma@2e13和luxturna@5e12)。低样品量可能需要ms检测来进行变体测试。
30.本公开(参见图1)讨论了一种解决方案，包括使用变性sec除去非离子表面活性剂，之后是蛋白质冻干，rapigest
tm
sf表面活性剂(购自waters corporation,milford,ma)变性和胰蛋白酶消化。
31.变性sec能够以高回收率除去表面活性剂(参见图2a、图2b、图2c和图2d)。非离子
表面活性剂可以通过变性sec(无盐流动相)来除去。蛋白质负荷可以低至1.25μg(在我们的lc/ms上运行的最小样品量)。基于收集的级分和遗留物的峰面积，蛋白质回收率为98.6％。
32.在一些实例中，变性sec可以通过使用容纳在基于移液管尖的装置内的耐压筛分介质来完成，该基于移液管尖的装置与手持式移液管或正压源对接。样品的体积将决定所使用的耐压筛分介质的体积。例如，10μl至50μl样品需要体积为20μl至200μl的耐压筛分介质。由于样品的体积和数量小，所以具有防止非特异性结合的经改进表面性质的耗材对于高回收率很重要(等离子处理，quanrecovery产品，购自waters corporation,milford,ma)。
33.aav生产成本高，因而剂量低(1e13 vg/ml样品含有约5μg/ml vp1和vp2，以及约45μg/ml vp3)(zolgensma@2e13和luxturna@5e12)。低样品量可能需要ms检测来进行变体测试。本公开的方法(参见图1)耗时约2.5小时，解决了其他方法的种种问题。将收集的蛋白质级分冷冻蒸发至干，以增加蛋白质浓度。在一些实例中，可以添加甲硫氨酸以抑制方法诱导氧化。ms友好试剂rapigest
tm sf表面活性剂(购自waters corporation,milford,ma)消除了在消化前进行缓冲液交换的需要。酶消化可以使用ms级、测序级产物在溶液中进行。酶也可以固定在固体载体上，该固体载体呈现出与rapigest sf(购自waters corporation,milford,ma)的相容性。
34.图3a示出了aav完整蛋白(vp3)的提取离子色谱图(xic)，其显示未消化的蛋白质非常少。未消化的蛋白质只有极少量(《1％)。图3b示出了aav肽图的tic。
35.建立对衣壳组成的深入理解通常使用诸如质谱法(ms)或液相色谱法(lc)等物理化学方法，因为它们不需要诸如单克隆抗体等产物特异性分析试剂。已经应用了多种分析方法(包括ms、等电聚焦和cryo-em)来表征由两种制造平台即人hek293细胞和草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)(sf9)昆虫细胞产生的aav8样品。这些raav8样品在ptm方面有所不同，包括糖基化、乙酰化、磷酸化和甲基化，这揭示了它们在各种靶细胞类型中观察到的效力差异的原因。
36.本公开探索了稳定胺基团并改善载体性能的突变策略。为了支持基于aav的基因疗法开发，用于肽表征的一种充分执行的方法是使用反相(rp)lc-ms，使得能够进行对13种aav血清型的直接质量测量和肽序列确认，以便鉴定和纯度评估。使用基于二氧化硅杂化的酰胺hilic柱，并使用三氟乙酸(tfa)作为流动相改性剂，可以对宽范围的aav血清型进行分离，并且通过用丙酸和异丙醇将ms去溶剂化气体改性来提高ms灵敏度。尽管这些方法有点不一样，但它们确实提供了对aav样品质量的深入了解，并突出了lc/ms作为有效分析工具促进基因疗法产品开发的能力。
37.与典型的重组蛋白相比，对raav的分析除结构复杂性之外，仍然需要克服多个挑战。大规模制造和纯化aav中的困难导致样品的产率低。这在支持过程开发中可能带来问题，因为在这种情况下，通常只有数微克raav可供分析人员用于覆盖一定范围的所需测定。另一个挑战是raav样品的浓度低。作为实例，以每毫升5
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个载体基因组(vg/ml)的浓度配制(一种眼科治疗剂)。如果100％的衣壳含有转基因，这转化为30μg/ml的蛋白质浓度。在相对丰度仅有8％的情况下，vp1和vp2在配制的样品中处于低微克水平，从而增大了样品制备和分析期间蛋白质损失的风险。因此，非常需要一种灵敏而稳健的方法来应对raav的结构复杂性和样品稀缺性的挑战，同时递送关于产品质量属性的富有洞察力的
信息。
38.本公开使用lc-ms技术探索对raav衣壳的表征，目的是开发稳健、通用且节省样品的方法，这些方法只需最少的专业知识即可支持raav过程开发和制造中日益增长的活动。这些分析扩展到涵盖显示临床前景的raav血清型，并且发现这些方法在测量关键质量属性诸如vp化学计量和衣壳蛋白的ptm(例如，脱酰胺、氧化)程度方面具有广泛适用性。一般来讲，本发明的技术利用sec技术来除去非离子表面活性剂并维持具有足够大的分辨率来分析样品的能力，尤其是对于低浓度样品和/或少量样品。
39.实施例
40.aav5 vp的酶消化
41.在酶消化之前，使用变性尺寸排阻色谱法(sec)从aav样品中除去表面活性剂，例如酯，诸如聚氧乙烯山梨糖醇酯(例如，购自milliporesigma,st.louis,mo的20)、聚山梨醇酯(诸如吐温20)。将二十五(25.0)μl aav5样品(1
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vg/ml)进样到保持在23℃的acquitybeh sec200色谱柱(2.1mm
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150mm，1.7μm，waters corp,milford,ma)上。以0.08ml/min的流速使用含有0.1％三氟乙酸、0.1％甲酸、10％乙腈、20％异丙醇和69.8％水(所有溶剂和添加剂均来自fisher scientific,waltham,ma)的流动相。
42.洗脱的aav5 vp在柱后手动收集2分钟至4分钟，向其中添加5μl的1mm甲硫氨酸，然后在0.5ml protein 管(eppendorf,hamburg,germany)中混合。将混合物立即放入-80℃冷冻机中快速冷冻，然后使用centrivap真空浓缩器(labconco corp.,kansas city,mo)在1小时内冻干。将干燥的aav5 vp置于5μl缓冲溶液中复溶，该缓冲溶液由以下成分组成：0.05％(w/v)rapigest
tm
sf表面活性剂变性剂(waterscorp.,milford,ma)、0.5mm二硫苏糖醇(dtt，fisher scientific,waltham,ma)、0.1mm乙二胺四乙酸(edta，sigma-aldrich,st.louis,mo)和50mm ph 8.0 tris-hcl缓冲液(fisher scientific,waltham,ma)。将复溶的aav5 vp在70℃下孵育3分钟，使其变性。冷却至室温后，将所变性的aav5 vp溶液与2μl0.1μg/μl测序级经修饰胰蛋白酶(promega,madison,wi)混合，在37℃下保持1小时以便蛋白水解消化。然后使用18μl 10mm甲硫氨酸(水溶液)对所消化的aav5样品进行稀释，置于样品管理器中在4℃下进行lc-ms分析。
43.uhplc-ms肽作图
44.对aav肽的lc-ms分析在bioaccord系统(waters corp,milford,ma)上进行，该系统的配置与完整质量分析部分中所指定的配置相同。将二十(20.0)μl(约1μg蛋白质)aav vp胰蛋白酶消化物进样到保持在65℃的acquity beh c18色谱柱(2.1mm
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100mm，1.7μm，waters corp,milford,ma)上。使用含有0.1％lc-ms级甲酸(fisher scientific,waltham,ma)的水溶液(a)和乙腈(b)的流动相将肽分离。在0.2ml/min的流速下，将梯度设定为1％b维持3分钟，然后在18分钟内从1％b斜线上升至15％b，在48分钟内从15％b斜线上升至30％b，在51分钟内从30％b斜线上升至55％b，在65分钟内从55％b斜线上升至95％b并维持在95％b直到67分钟，然后从70分钟至85分钟设定为1％b达到平衡。
45.在rda检测器上以“full scan with fragmentation”模式收集ms数据。在该采集模式下，同时获取低能量肽前体数据和对应的高能量碎裂数据。其他ms设置如下：毛细管电压，1.2kv；锥孔电压，20v；碎裂锥孔电压，60v至120v；去溶剂化温度，350℃；扫描范围，50m/
z至2000m/z；扫描速率，2hz。synapt-xs四极杆飞行时间质谱仪(waters corp,milford,ma)也用于序列确认，其设置如下：毛细管电压，2.2kv；源温度，120℃；碰撞能量，20ev至50ev；去溶剂化温度，350℃；去溶剂化气体流量，500l/h；扫描范围，50m/z至2000m/z；扫描速率，2hz。靶向ms/ms用于对低丰度n-末端肽进行序列确认，碰撞能量在30ev至50ev的范围内斜线上升。使用waters_connect信息学平台内的肽作图工作流程对ms数据进行处理。质量公差对于前体离子设定为10ppm，对于碎裂离子设定为20ppm。将最多一次缺失切割与最少3个b-/y-离子匹配设定为肽鉴定的标准。
46.结果和讨论
47.aav5 vp的酶消化法开发
48.本公开(参见图1)讨论了一种解决方案，包括使用变性sec除去非离子表面活性剂，之后是蛋白质冻干，rapigest
tm
sf表面活性剂(购自waters corporation,milford,ma)变性和胰蛋白酶消化。
49.在对蛋白质进行酶消化后对蛋白水解消化物进行lc/ms分析通常用于对蛋白质治疗剂进行序列确认和ptm鉴定。尽管之前的报告已通过多酶消化证明了vp的全序列覆盖，但本次工作使用10μg至20μg aav vp来制备蛋白质消化物。由于aav样品在早期开发阶段的可用性有限，因此难以满足单个肽作图工作流程的这种样品要求。然而，使用大幅度减少的aav材料进行酶消化在样品制备过程中面临多重挑战。
50.除了低样品浓度的限制之外，aav制剂缓冲液中的表面活性剂(诸如泊洛沙姆或吐温)在ms分析中也带来了问题。虽然这些表面活性剂与完整vp分离并且在先前的rplc-ms分析中没有引起问题，但是它们可能严重妨碍肽的lc-ms分析。典型地，在消化之前需要缓冲液交换步骤来除去表面活性剂以及酶抑制剂(诸如变性剂和烷基化试剂)。然而，完全除去表面活性剂是有难度的，因为表面活性剂的浓度通常高于临界胶束浓度(cmc)。此外，在常用的缓冲液交换方法(诸如离心过滤或渗析)中，低蛋白质浓度可能导致显著的样品损失，这主要是膜过滤器的非特异性吸附所致。此外，在低浓度aavvp(约50μg/ml)的情况下，在分析中尝试使用较少材料将导致两种困难的情形，要么采集非常少量的aav样品，要么采集大量低蛋白质浓度的样品。从样品制备的角度来看，样品量小意味着许多常见的缓冲液交换装置/方案无法轻易采用。另一方面，低浓度的蛋白质样品会进一步降低酶消化率和蛋白质回收率。这些挑战阻碍了对有限样品采用常规的酶消化方案，需要人们开发全新的样品制备方法。
51.本公开描述了一种新的消化方法，其与开发用于肽作图的低微克量的aav相容。通过最大限度减少缓冲液交换和液体转移步骤，极大地减少了蛋白质损失。考虑到有限的样品量，选择整个aav衣壳而不是分离的vp来进行单一酶消化。为了从aav中除去表面活性剂，开发了基于变性sec的8分钟方法来从表面活性剂中分离aav vp。
52.以aav5为例，在2分钟窗口内进样并收集1.25μg vp，得到不含表面活性剂的样品，蛋白质回收率超过95％(图2a至图2d)。将该级分冻干至干燥，以除去有机溶剂并增加蛋白质浓度用于以下步骤。使用含有0.05％(w/v)的ms友好变性剂rapigest
tm sf表面活性剂(购自waters corporation,milford,ma)的5μl复溶缓冲液，开发了一锅变性和消化法。尽管aav5 vp在理论上不具有二硫键，但是在缓冲液中包含了低水平的还原试剂dtt，来避免二硫键配对。该缓冲液组合物可以在对酶活性影响最小的情况下提高变性蛋白质的溶解度，
使得在消化之前不需要缓冲液交换步骤。此外，在消化缓冲液中存在变性剂和还原剂的情况下，不需要烷基化来防止二硫键重新形成，这进而消除了对额外的缓冲液交换的需要。
53.图2a、图2b、图2c和图2d显示了使用变性sec来除去表面活性剂。使用开发的8分钟方法，将aav vp与表面活性剂和其他赋形剂分离，如图2a所示，25ngaav的tic。在图2b中，在flr检测下，仅观察到2.68分钟处的峰，证实图2a中在4分钟后洗脱的峰不含蛋白质。在图2c中，在矩形201的范围内收集1.25μg aav的洗脱液用于随后的酶消化，而在图2d中观察到最少的遗留物，图2d是级分收集后的一次空白进样。基于在图2c和图2d中观察到的所收集级分在所有峰上的面积，计算蛋白质回收率为98.6％。进样体积为25μl，其可以基于aav样品的浓度来调节。
54.进一步开发该消化法，以便基于胰蛋白酶对aav5进行蛋白质水解，最大程度地减少样品制备伪影和消化错误切割。为了减少人为氧化，在冻干前将10mm甲硫氨酸作为除氧剂添加到从变性sec分级分离收集的aav vp中。这是可选步骤/结果增强步骤，不一定需要在每个实例中都执行。据报道，缓冲液中存在dtt可能会因金属催化还原形成过氧化氢而导致甲硫氨酸氧化。因此，我们添加edta作为金属螯合剂，并将消化溶液中dtt的浓度降至0.5mm。该dtt浓度大约是单克隆抗体消化方法中通常所用浓度的1/10。尽管在本方法中使用较低的浓度，但是dtt与aav5中半胱氨酸残基的摩尔比仍然是过量的(》25:1)，以防止潜在的二硫键形成。开发其他消化条件是为了实现肽缺失切割与方法诱导的修饰之间的平衡。为了促进更完全的消化，在70℃下进行aav5 vp变性，之后在37℃下以1:10的酶:底物比进行胰蛋白酶消化。为了最大限度地减少样品制备伪影，例如氧化和脱酰胺，将变性时间和消化时间分别设定为3分钟和1小时，因而总样品制备时间为2.5小时。
55.这种消化法允许相对灵活的蛋白质消耗。然而，考虑到aav衣壳上vp1和vp2的丰度较低(《10％)，所述1.25μg蛋白质消化物通常排除使用uv检测，并且正在接近本研究中使用的uhplc/ms仪器配置的检测能力。尽管出于稳健性目的，优选分析规模的肽作图，但是消化中的样品用量可能会进一步减少，以满足其他分析(诸如纳米lc/ms)的需求。
56.对aav5 vp胰蛋白酶消化物的uhplc/ms分析
57.在台式uhplc-ms系统上对所消化的aav5 vp进行分析，以验证所开发的消化方案的aav蛋白质序列覆盖率。图4a和图4b显示了使用约1.25μg蛋白质作为酶消化的起始材料对aav5 vp进行肽分析的结果。在unifi肽作图工作流程中对数据进行处理。使用45分钟梯度，在c18rp柱上将肽充分分离，在tic迹线中显示强烈的ms信号(图4a)。基于观察到的质量和高能量碎裂离子来指定肽身份。aav5 vp1的覆盖率图(图4b)显示蛋白质序列的覆盖率为98％，未鉴定的肽在框中示出(例如，k、r和mlr)。vp2和vp3的序列覆盖率也都是98％，因为它们的多肽主链之间唯一不同的肽是源自其n-末端的那些肽。
58.图5a、图5b和图5c显示经由质谱法鉴定aav5 vp的n-末端肽。鉴定的初级离子以下列序列的ms碎裂谱示出：(图5a)vp3 n-末端(ac)saggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdr(seq id no:1)、(图5b)vp1 n-末端(ac)sfvdhppdwleevgeglr(seq id no:2)和(图5c)vp2 n-末端aptgk(seq id no:3)。单电荷vp2 n-末端的碎裂谱是经由目标ms/ms在较高碰撞能量下获得的。图5a示出了vp3 n-末端的去卷积ms碎裂谱，其中有带注释的前体质量(3460.3516 da)和广泛分布的b-/y-离子系列，证实肽序列为saggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdr(seq id no:1)。ms数据还显示与vp3 n-末端肽的理论质量(质量精度为
0.2ppm)相比，质量位移为+42 da，表明存在与肽相关联的n-乙酰化。在丝氨酸残基上添加42 da质量的y
34
离子和y
max
离子证实在n-末端发生了乙酰化。类似地，vp1 n-末端肽sfvdhppdwleevgeglr(seq id no:2)(图5b)以2.2ppm的前体质量精度得到鉴定，而且还发现在丝氨酸残基上发生了n-乙酰化。仅由5个氨基酸残基组成的vp2 n-末端肽aptgk(seq id no:3)仅微弱地保留在rp柱上。此外，这种单电荷vp2n-末端肽在数据独立采集(dia)模式中使用的一般ms碎裂设置下不易碎裂。因此，采用目标ms/ms数据采集模式和更高的碰撞能量来生成更广泛的b-离子片段和y-离子片段以确认肽身份(图5c)。
59.在该工作中，开发了基于多重lc和lc/ms的方法来提供对aav衣壳蛋白的更全面的表征。对几种aav血清型的分析证明了该方法对于常规使用(诸如可比较性研究)的普遍适用性。使用变性sec分级分离和ms友好去污剂rapigest
tm sf表面活性剂(购自waters corporation,milford,ma)的组合，该1小时酶消化法只需1.25μg aav样品即可以生成高质量的胰蛋白酶消化物，其中所有vp均实现近100％的序列覆盖率。总之，这些方法提供的效率和灵敏度可以有益于对aav衣壳蛋白的分析，以提高对新aav治疗剂的理解并且指导对新aav治疗剂的设计和制造。

技术特征：
1.一种表征样品中的蛋白质的方法，所述方法包括：经由变性尺寸排阻色谱法从所述样品中除去非离子表面活性剂，以形成变性样品；经由液相色谱法洗脱所述变性样品，以收集所述样品的级分，其中所述样品的所述级分包括蛋白质级分；将所述蛋白质级分冻干，以增加蛋白质浓度；用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分，以使所述蛋白质变性；用酶消化所变性的蛋白质级分；以及对所消化的蛋白质级分进行分析。2.根据权利要求1所述的方法，还包括在将所述蛋白质级分冻干之前向所述蛋白质级分中添加甲硫氨酸。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质级分少于10μg。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质级分包括腺相关病毒衣壳蛋白。5.根据权利要求1所述的方法，其中对所消化的蛋白质级分进行分析包括用液相色谱-质谱联用法进行分析。6.根据权利要求5所述的方法，其中经由液相色谱-质谱联用法对所消化的蛋白质级分进行分析包括对所消化的蛋白质级分的完整质量/翻译后修饰进行分析。7.根据权利要求5所述的方法，其中经由液相色谱-质谱联用法对所消化的蛋白质级分进行分析包括台式飞行时间(tof)质谱仪。8.根据权利要求1所述的方法，其中对所消化的蛋白质级分进行分析包括用荧光检测法测量病毒蛋白表达。9.根据权利要求1所述的方法，其中对所消化的蛋白质级分进行分析包括提供大于95％的蛋白质序列覆盖率。10.根据权利要求1所述的方法，其中对所消化的蛋白质级分进行分析包括提供大于97％的蛋白质序列覆盖率。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液还包含还原剂。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液还包含还原剂和金属螯合剂。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是胰蛋白酶。14.根据权利要求1所述的方法，其中用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分以使所述蛋白质变性是在高于65℃的温度下进行的。15.根据权利要求1所述的方法，其中用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分以使所述蛋白质变性进行少于约5分钟。16.根据权利要求15所述的方法，其中用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分以使所述蛋白质变性进行约3分钟。17.根据权利要求1所述的方法，其中用酶消化所变性的蛋白质级分在约30℃至约50℃的温度范围内进行。18.根据权利要求1所述的方法，其中用酶消化所变性的蛋白质级分进行约50分钟至约70分钟。19.根据权利要求18所述的方法，其中用酶消化所变性的蛋白质级分进行约60分钟。

技术总结
本公开涉及一种表征样品中的蛋白质的方法。该方法包括：经由变性尺寸排阻色谱法从样品中除去非离子表面活性剂，以形成变性样品；经由液相色谱法洗脱变性样品，以收集该样品的级分，其中该样品的级分包括蛋白质级分；将蛋白质级分冻干，以增加蛋白质浓度；用包含表面活性剂的缓冲液复溶所冻干的蛋白质级分，以使蛋白质变性；用酶消化所变性的蛋白质级分；以及对所消化的蛋白质级分进行分析。及对所消化的蛋白质级分进行分析。


技术研发人员：张希墨 S
受保护的技术使用者：沃特世科技公司
技术研发日：2021.05.07
技术公布日：2023/10/8