经由新的人工生物合成途径由苯乙烯、L-苯丙氨酸、葡萄糖或甘油生物生产(R)-扁桃酸

经由新的人工生物合成途径由苯乙烯、l-苯丙氨酸、葡萄糖或甘油生物生产(r)-扁桃酸
技术领域
1.本发明涉及有用和有价值的对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的生物生产。更具体地，本发明提供了通过经基因工程化为相对于野生型细胞过表达至少一种酶的一种或多种重组微生物细胞生物生产对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的方法，该方法包括使起始材料在一锅反应体系中进行多种酶催化的化学转化，其中起始材料选自包括以下的组：葡萄糖、甘油、l-苯丙氨酸或取代的l-苯丙氨酸、苯乙烯或取代的苯乙烯。


背景技术：

2.本说明书中对先前公开的文件的列出或讨论不应必然地被视为承认该文件是现有技术的一部分或者是公知常识。
3.(r)-扁桃酸(ma)是一种重要且有用的手性分子，用于生产抗生素诸如头孢菌素(cephalosporin)和半合成青霉素(penicillins)，以及抗肿瘤和抗肥胖剂。(r)-ma还作为手性拆分剂广泛应用于外消旋胺和醇两者的拆分，并且被用作手性模板来合成手性印迹介孔材料(t.yutthalekha et al.,electroanalysis2015,27,2209
–
2213)。
4.目前，(r)-ma的合成主要是经由化学方法实现的。基于氰化物的方法涉及两步反应，包括使用nacn或过渡金属催化剂诸如手性配体的钛或钒络合物对苯甲醛的氰化作用，以及使用盐酸对扁桃腈进行水解，从而得到对映纯(r)-ma(wo 2002066410 a1；and b.b.corson et al.,org.synth.1926,6,58)。该方法需要使用剧毒的氰化物、昂贵的过渡金属催化剂连同手性配体，但得到不令人满意的对映体过量，低总产率，而且生成许多副产物和大量废物。基于二氯苯乙酮的方法涉及用氯(cl2)来氯化苯乙酮，随后在65℃下用氢氧化钠进行碱性水解，并用氯化氢进行酸解。该方法需要使用有毒且危险的cl2、高温，并且还存在与副产物(一、三氯苯乙酮)相关的问题(j.g.astonet al.,org.synth.1943,23,48)。在实际中，主要采用化学方法来产生外消旋ma，然后通过拆分工艺得到对映纯(r)-或(s)-ma。分离外消旋混合物以获得对映纯ma仍然具有挑战性，并且因此，通常需要动力学拆分，但理论上的最大产率仅为50％。因此，化学方法通常涉及多步反应，并且需要分离中间体。因此，化学方法可能成本高昂，而且会生成副产品和大量废物。
5.由于全球气候变化和石油枯竭，由可再生原料生物合成高价值化学品以实现化学品的可持续制备越来越受关注。与化学方法相比，生物方法因生物催化剂无毒、反应条件温和、化学选择性、区域选择性和立体选择性高而更为环保且更可持续。用清洁、绿色和高产的生物催化制备代替化学合成被认为是实现化学品可持续制备的最有吸引力的策略之一。然而，目前用于生产(r)-ma的生物方法也存在一些缺陷。由酶诸如腈水解酶(nlase)、脂肪酶、酯酶或脱氢酶催化的一步动力学拆分通常具有低效率和低产率，并且外消旋ma原料仍然来源于化学合成。报道了由葡萄糖生物合成(r)-ma，但由于使用低效的天然途径和酶(例如，羟基扁桃酸合酶(hmas)，z.sun et al.,microb.cell fact.2011,10,71)，该方法产物
浓度低(≤1g/l)。目前，由于缺乏有效的途径，在实际工业应用中，(r)-ma的发酵生产仍然具有挑战性。
6.已知一种由l-苯丙氨酸(l-phe)和葡萄糖生产(r)-ma的途径，涉及hmas(参见图1a)。然而，其不是特别有效或高产。为了提高产量，可以预期该领域的工作人员将尝试：
7.·
通过降低酶的数量而非添加更多的酶来缩短现有的途径；
8.·
用具有更好活性的其它酶代替限速酶；或
9.·
使宿主细胞中的一些酶缺失，以避免中间体转化为其他不相关的产物；或
10.·
上述的组合。
11.开发具有高活性和期望选择性的生物合成途径是有效直接合成(r)-ma的最有前景的方式之一。然而，由于缺乏新的途径和合适的酶，相应的技术开发仍然具有挑战性。因此，需要开发有效、可持续且非化学的合成方法，该方法使用温和的条件、无毒的试剂和催化剂来生产对映纯ma。


技术实现要素：

12.现在将参照如下编号的条款来描述本发明。
13.1.一种用于使用经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞来生产对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的方法，所述方法包括使苯乙烯或其衍生物在一锅反应体系中进行多种酶催化的化学转化，任选地，其中，至少一种过表达的酶位于一个或多个质粒上或者整合在所述一种或多种重组微生物细胞中的每一种的染色体中。
14.2.根据条款1所述的方法，其中，所述方法生产对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物，包括以下步骤：
15.(a)通过进行由环氧化酶催化的环氧化反应形成氧化苯乙烯或其衍生物，并在环氧化物上进行由环氧化物水解酶催化的水解反应，或通过由双加氧酶催化的二羟基化反应来由苯乙烯或其衍生物生成对映体纯或对映体富集的苯乙二醇或其衍生物；和
16.(b)通过使用氧化酶将苯乙二醇上的伯醇选择性氧化为羧酸，由对映体纯或对映体富集的苯乙二醇或其衍生物生成对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物。
17.3.根据条款2所述的方法，其中
18.(a)所述环氧化酶是苯乙烯单加氧酶，任选地，其中，所述苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属(pseudomonas sp.)vlb120、或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶；和/或
19.(b)当使用时，环氧化物水解酶来自马铃薯(solanum tuberosum)或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶；和/或
20.(c)所述氧化酶是醇氧化酶，任选地，其中，所述醇氧化酶来自天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。
21.4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞中的一种(即，所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞0是大肠杆菌(e.coli)t7-pcdf-smo-steh，prsf-aldo。
22.5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括通过以下来提供苯乙烯或其衍生物：通过经由氨裂合酶催化的脱氨反应由l-苯丙氨酸或其衍生物生成反
式肉桂酸或其衍生物，并在由脱羧酶催化的脱羧反应中由所述反式肉桂酸或其衍生物生成苯乙烯或其衍生物。
23.6.根据条款5的方法，其中，所述氨裂合酶是来自拟南芥(arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨裂合酶，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。
24.7.根据条款5或条款6所述的方法，其中，脱羧物是来自黑曲霉(aspergillus niger)的苯基丙烯酸脱羧酶、或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。
25.8.根据条款5至7中任一项所述的方法，其中，所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞中的一种(即，所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞)是大肠杆菌(e.coli)t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo。
26.9.根据条款6至8中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的细胞，所述细胞将甘油的葡萄糖转化为l-苯丙氨酸。
27.10.根据条款9所述的方法，其中由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞过表达选自由以下组成的组中的一种或多种的至少一种酶：dahp合酶(arog)、莽草酸激酶(arok)、莽草酸脱氢酶(ydib)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(phea)和酪氨酸氨基转移酶(tyrb)，或者其突变体或具有超过50％同一性的相似酶，任选地，其中，由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞过表达至少一种酶是：
28.(a)arog的反馈抑制抗性突变体；
29.(b)phea的反馈抑制抗性突变体。
30.11.根据条款10所述的方法，其中，由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞过表达至少一种酶，其中，所述微生物细胞突变为缺失或失活crr和/或tyra基因。
31.12.根据条款9-11中任一项所述的方法，其中，过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的微生物细胞是大肠杆菌(e.coli)nst74-pcdf-phe、pet-pal-pad、pacyc-smo-steh、prsf-aldo，其用于由葡萄糖或甘油产生(r)-扁桃酸。
32.13.根据条款9至12中任一项所述的方法，其中，过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的微生物细胞是大肠杆菌(e.coli)nst74-phe，其与大肠杆菌t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo组合以由葡萄糖或甘油提供(r)-扁桃酸。
33.14.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用水性介质。
34.15.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用双相介质，任选地，其中所述双相介质由以下组成：水性和固体树脂介质或者水性和有机溶剂介质(例如，所述有机溶剂介质选自一种或多种烷烃溶剂和/或一种或多种酯溶剂)。
35.16.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用吸收树脂或纳米材料用于原位移出产物。
36.17.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码至少一种异源催化酶，所述异源催化酶选自包括以下的组：
37.(a)用于进行环氧化反应以由苯乙烯或其衍生物形成氧化苯乙烯或其衍生物的环氧化酶和用于在环氧化物上进行水解反应以提供苯乙二醇或其衍生物的环氧化物水解酶，或者通过二羟基化反应由苯乙烯或其衍生物生成苯乙二醇或其衍生物的加氧酶；
38.(c)用于通过苯乙二醇或其衍生物上伯醇的选择性氧化生成对映体纯或对映体富
集的(r)-扁桃酸或其衍生物的氧化酶；或者
39.(d)用于通过脱氨反应由l-苯丙氨酸或其衍生物生成反式肉桂酸或其衍生物的氨裂合酶；以及
40.(e)用于在脱羧反应中由反式肉桂酸或其衍生物生成苯乙烯或其衍生物的脱羧酶。
41.18.根据条款17所述的分离的核酸，所述分离的核酸编码多种所述催化酶。
42.19.根据条款18所述的分离的核酸分子，其中，所述多个催化酶被布置为选自包括以下的组的至少一个模块：
43.i)包括在表达时将苯乙烯或其衍生物酶促转化为苯乙二醇或其衍生物的异源核酸序列的模块；
44.ii)包括在表达时将苯乙二醇或其衍生物酶促转化为(r)-扁桃酸或其衍生物的异源核酸序列的模块；以及
45.iii)包括在表达时将l-苯丙氨酸或其衍生物酶促转化为苯乙烯或其衍生物的异源核酸序列的模块；
46.或其任意组合。
47.20.一种表达构建体，包括至少一种根据条款17至19中任一项所述的核酸分子。
48.21.一种或多种重组原核细胞或真核细胞，选自包括以下的组：细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，其中，所述细胞包括如条款20中所述的至少一种表达构建体。
49.22.根据条款21所述的一种或多种重组原核细胞或真核细胞，其中，所述细胞是重组细菌细胞。
50.23.根据条款21或条款22所述的一种或多种重组原核细胞或真核细胞，其中，所述酶与选自包括以下的至少一种酶具有至少50％的氨基酸同一性：
51.(a)来自假单胞菌属(pseudomonas sp.)vlb120的苯乙烯单加氧酶；
52.(b)来自马铃薯(solanum tuberosum)的环氧化物水解酶；
53.(c)来自天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)的醇氧化酶；
54.(d)来自拟南芥(arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨裂合酶；
55.(e)来自黑曲霉(aspergillus niger)的苯基丙烯酸脱羧酶。
56.24.根据条款23所述的一种或多种重组细胞，其中,所述细胞选自：
57.(a)大肠杆菌(e.coli)t7-pcdf-smo-steh、prsf-aldo；
58.(b)大肠杆菌(e.coli)t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo；以及
59.(c)大肠杆菌(e.coli)nst74-pcdf-phe、pet-pal-pad、pacyc-smo-steh、prsf-aldo。
60.25.一种试剂盒，包括至少一种根据条款17至19中任一项所述的分离的核酸。
附图说明
61.图1描绘了(a)由l-phe和葡萄糖生产(r)-ma，涉及羟基扁桃酸合酶(hmas)；和(b-c)由l-phe、葡萄糖或甘油生物生产(r)-ma的酶级联。(b)含有苯丙氨酸氨裂合酶(pal)、苯基丙烯酸脱羧酶(pad)、苯乙烯单加氧酶(smo)、选择性环氧化物水解酶(steh)和醇氧化酶
(aldo)的五酶人工级联用于将l-phe转化为(r)-ma；以及(c)通过组合l-phe生物合成途径和五酶人工级联将甘油或葡萄糖生物转化为(r)-ma。
62.图2描绘了由(r)-1,2-苯基乙二醇(ped)、苯乙烯和l-phe生产(r)-ma的时程。(a)在磷酸钾(kp)缓冲液(200mm，ph 8.0)中用大肠杆菌(aldo)细胞(15g cdw/l)将(r)-ped生物转化为(r)-ma；(b)在kp缓冲液和正十六烷(1:1；v/v)的混合物中用大肠杆菌(s2a)细胞(15g cdw/l)将苯乙烯生物转化为(r)-ma；以及(c)在kp缓冲液和正十六烷(1∶1；v/v)的混合物中用大肠杆菌(p2s2a)细胞(15g cdw/l)将l-phe生物转化为(r)-ma。全部反应均在30℃和250rpm下进行。
63.图3描绘了工程化大肠杆菌细胞共表达smo、steh和aldo用于将苯乙烯生物转化为(r)-ma。
64.图4描绘了高压液相色谱(hplc)色谱图。(a)标准(r)-ma；和(b)在30℃下，在含有0.5％葡萄糖的kp缓冲液(200mm，ph 8.0)和正十六烷(1:1，v/v)的混合物中，用大肠杆菌(s2a)细胞的静息细胞(15g cdw/l)生物转化苯乙烯(20mm)24h期间产生的(r)-ma。使用苯甲醇作为内标(i.s.)。
65.图5描绘了用于生物生产(r)-ma的大肠杆菌细胞的总细胞内蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析。泳道a：大肠杆菌(aldo)；泳道b：大肠杆菌(s2a)；和泳道c：大肠杆菌(p2s2a)。
66.图6描绘了共表达多种酶用于生物生产(r)-ma的大肠杆菌细胞的构建。(a)大肠杆菌(p2s2a)菌株，其携带编码pal和pad的质粒pet-pal-pad、编码smo和steh的质粒pcdf-smo-steh以及编码aldo的质粒prsf-aldo，用于将l-phe转化为(r)-ma；(b)大肠杆菌nst74(p2s2a)菌株，其携带编码pal和pad的质粒pet-pal-pad、编码smo和steh的质粒pcdf-smo-steh以及编码aldo的质粒prsf-aldo，用于将甘油或葡萄糖转化为(r)-ma；(c)将在莽草酸途径(shikimate pathway)中过表达五种限制酶的大肠杆菌nst74-phe菌株与表达五酶人工级联的大肠杆菌(p2s2a)组合，用于将甘油或葡萄糖转化为(r)-ma；以及(d)sds-page。泳道m：蛋白标记；泳道a：大肠杆菌nst74的细胞内总蛋白；和泳道b：大肠杆菌nst74(p2s2a)的总细胞内蛋白。
67.图7描绘了hplc色谱图。(a)标准(r)-ma；和(b)在30℃下，在含有0.5％葡萄糖的kp缓冲液(200mm，ph 8.0)和正十六烷(1:1，v/v)的混合物中，用大肠杆菌(p2s2a)细胞的静息细胞(15g cdw/l)生物转化l-phe(15mm)24h期间产生的(r)-ma。使用苯甲醇作为i.s.。
68.图8描绘了用于由葡萄糖或甘油生物生产(r)-ma的大肠杆菌菌株的构建。(a)涉及酶共表达l-phe生物合成途径的工程化大肠杆菌细胞用于由葡萄糖或甘油发酵生产l-phe；以及(b)涉及酶pal、pad、smo、steh和aldo共表达l-phe生物合成途径的工程化大肠杆菌细胞用于将葡萄糖或甘油生物转化为(r)-ma。
69.图9描绘了在25℃下用单一工程化大肠杆菌nst74(p2s2a)由甘油或葡萄糖生产(r)-ma的时程。(a)在单一水相体系中由甘油发酵；(b)在单一水相体系中由葡萄糖发酵；(c)在正十六烷-水相体系(1:2；v/v)中由甘油发酵；以及(d)在正十六烷-水相体系(1:2；v/v)中由葡萄糖发酵。
70.图10描绘了经由联合大肠杆菌(nst74-phe)和大肠杆菌(p2s2a)由甘油生产(r)-ma的时程。(a)用大肠杆菌(nst74-phe)由甘油发酵生产l-phe；和(b)通过将大肠杆菌
(p2s2a)细胞加入到大肠杆菌(nst74-phe)的甘油发酵培养基中将l-phe生物转化为(r)-ma。
71.图11描绘了在水性正十六烷两相体系中经由联合大肠杆菌nst74-phe和大肠杆菌(p2s2a)细胞将葡萄糖生物转化为(r)-ma的时程。
72.图12描绘了(r)-ma的手性hplc色谱图。(a)外消旋ma标准；(b)(r)-ma标准；和(c)用大肠杆菌(p2s2a)细胞将l-phe生物转化为(r)-ma的分离的(r)-ma产物。
具体实施方式
73.为了由l-苯丙氨酸生产(r)-扁桃酸，可以在大肠杆菌细胞中通过内源性转氨酶将l-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸。如图1a的途径所示，为此目的，只需要3种酶(羟基扁桃酸合酶(hmas)、4-羟基扁桃酸氧化酶(hmo)和d-扁桃酸脱氢酶(dmd))。然而，本文公开的新途径包含5种酶(参见图1b)，并且实际上进行6个反应(aldo催化双氧化反应)。这比现有途径更长。然而，出乎意料的是，我们的新途径比现有途径更有效地用于生产(r)-扁桃酸。
74.在本发明的第一方面，提供了一种用于使用经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞来生产对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的方法，该方法包括在一锅反应体系中使苯乙烯或其衍生物进行多种酶催化的化学转化。在该方面的实施方式中，至少一种过表达的酶位于一个或多个质粒上或者整合在一种或多种重组微生物细胞中的每一种的染色体中。
75.在本文的实施方式中，单词“包括”可以解释为需要所提到的特征，但不限制其他特征的存在。替代地，单词“包括”也可以涉及以下情形，其中旨在仅所列举的组成/特征存在的情况(例如，单词“包括”可以被短语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”替换)。明确地设想了较广泛和较狭义的解释两者均可适用于本发明的所有方面和实施方式。换言之，词语“包括”及其同义词可以用短语“由
……
组成”或短语“基本上由
……
构成”或其同义词替换，并且反之亦然。
76.短语“基本上由
……
组成”及其假名在本文中可以解释为指可能存在少量杂质的材料。例如，材料可以大于或等于90％纯，诸如大于95％纯、诸如大于97％纯、诸如大于99％纯、诸如大于99.9％纯、诸如大于99.99％纯、诸如大于99.999％纯、诸如100％纯。
77.如本文所公开的，这些多个反应可以在一个反应容器中同时或依次进行，从而允许直接由苯乙烯或其衍生物、苯丙氨酸或其衍生物、葡萄糖或甘油来绿色、高效和经济地生产对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物。这样的一锅级联反应可以避免昂贵且耗能的中间体分离和纯化，最小化废物的生成，并且克服了传统多步合成中通常遇到的可能的热力学障碍。例如，多种酶可以在一个重组微生物菌株内共表达，并且菌株的全细胞可以直接用作一锅中一系列级联反应的催化剂。替代地，酶可以在不同菌株的细胞中单独表达、单独纯化或固定化(经纯化的酶或细胞含有所述酶的全部或一些)。在任何情况下，可以以任何合适的组合将生物催化剂(酶、细胞、固定化酶和固定化细胞)混合在一起，以实现本文所讨论的一锅转化。
78.如上所述，提供了一种用于生产对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的方法，该方法包括在一锅反应体系中使苯乙烯或其衍生物(或本文提及的其他合适的起始材料)进行多种酶催化的化学转化。
79.苯乙烯及其衍生物可以在石油化学工业中以非常大的规模制备(例如，通过烃裂解)，由此形成容易获得且廉价的起始材料用于本文所讨论类型的有机合成。例如，许多芳族和脂肪族烯烃以非常大的量和非常低的价格生产。如下文所述，苯乙烯和取代的苯乙烯是非常有用的底物，用于生产以高对映体纯度的各种手性芳族1,2-氨基醇(诸如苯乙醇胺、苯甘氨醇、非(伪)麻黄碱)和α-氨基酸(诸如苯甘氨酸)。
80.虽然设想使用从石油化学工业生成的合适的苯乙烯及其衍生物，但本发明还允许借助于将在下文中讨论的其他酶催化转化将l-苯丙氨酸及其衍生物转化为苯乙烯及其衍生物。这可以使得能够获得否则难以获得的苯乙烯衍生物，并提供更大量可能的苯乙烯底物用于本文所述的酶催化转化。
81.应当理解，术语“对映体纯”和“对映体富集”是指化合物的对映异构体。“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，它们是彼此不可叠加的镜像。
82.本文中使用的立体化学定义和约定一般地遵循s.p.parker,ed.,mcgraw-hill dictionary of chemical terms(1984)mcgraw-hill book company,new york；和eliel,e.and wilen,s.,“stereochemistry of organic compounds”,john wiley&sons,inc.,new york,1994。本发明的化合物可以含有不对称的或手性中心，并且因此以不同的立体异构形式存在。本发明化合物的所有立体异构形式包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体及其混合物诸如外消旋混合物，其构成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有能够旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀d和l或者r和s用于表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或者(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转符号，(-)或l(l)表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d(d)的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们是彼此的镜像。特定的立体异构体也可以称为对映异构体，这种异构体的混合物通常称为对映异构混合物。将对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，其可能发生在化学反应或过程中没有立体选择性或立体特异性的情况下。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构种类的等摩尔混合物，没有光学活性。
83.当在本文中提及时，术语“对映体富集的”可以指对映体过量50％或更多。例如，本文公开的方法可以提供对映体过量60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％或更多的终产物。在本发明的一些实施方式中，通过本文所述的方法提供手性化合物的仅一种对映异构体或非对映异构体(即，该化合物是“对映体纯的”)。
84.当在本文中使用时，应用于苯乙烯和l-苯丙氨酸的术语“其衍生物”涉及苯环含有一个或多个非h的取代基(例如，1、2、3、4或5诸如1-3，诸如1或2个取代基)的化合物。所述取代基可以是卤素、烷基、环烷基、芳基、杂环、oh、nh2、sh及其组合(例如，烷基芳基、o烷基、n(烷基)h、n(烷基)2，n(烷基)(芳基)等)。
85.除非另有说明，否则术语“烷基”是指非支链或支链的、饱和或不饱和的烃基基团(由此形成例如烯基或炔基)，其可以是取代的或未取代的(例如具有一个或多个卤素原子)。烷基基团可以是c
1-10
烷基，更优选c
1-6
烷基(诸如乙基、丙基(例如正丙基或异丙基)、丁基(例如支链或非支链的丁基)、戊基或更优选甲基)。术语“烯基”和“炔基”应作相应解释。
86.除非另有说明，否则术语“环烷基”是指非支链或支链的、饱和或不饱和的烃基基团(由此形成例如环烯烃基基团)，其可以是取代的或未取代的。环烷基基团可以是c
3-12
环
烷基，以及更优选c
5-10
(例如c
5-7
)环烷基。术语“环烯基”应作相应解释。
87.当在本文中使用时，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
88.当在本文使用时，术语“芳基”包括可以是取代或未取代的c
6-14
(诸如c
6-13
(例如c
6-10
))芳基基团。这样的基团可以是单环、二环或三环的，并且具有6至14个环碳原子，其中至少一个环是芳族的。芳基基团的连接点可以通过环体系的任何原子。然而，当芳基基团是双环或三环时，它们经由芳族环与分子的其余部分相连。c
6-14
芳基基团包括苯基、萘基等，诸如1,2,3,4-四氢萘基、茚满基、茚基和芴基。最优选的芳基基团包括苯基。
89.当在本文中使用时，术语“芳基烷基”应根据上文中提供的“烷基”和“芳基”的定义来解释，其中基团与式(i)或(ii)化合物的其余部分的连接点是通过芳基烷基基团的烷基部分。
90.当在本文中使用时，术语“杂环”是指完全饱和、部分不饱和、全芳族或部分芳族的环体系，其中环体系中的一个或多个(例如，一至四个)原子不是碳(即，杂原子，该杂原子优选地选自n、o和s)，并且其中环体系中的原子总数在三至十二个之间(例如，五至十个之间)。杂环基团可以是取代的或未取代的。可以提及的杂环基团包括7-氮杂双环[2.2.1]庚基、6-氮杂双环[3.1.1]庚基，6-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、吖丙啶基、氮杂环丁烷基、二氢吡喃基、二氢吡啶基、二氢吡咯基(包括2,5-二氢吡咯基)、二氧戊环基(包括1,3-二氧戊环基)、二氧己环基(包括1,3-二氧己环基和1,4-二氧己环基)、二噻烷基(包括1,4-二噻烷基)、二硫戊环基(包括1,3-二硫戊环基)、咪唑烷基、咪唑啉基、吗啉基、7-氧杂双环[2.2.1]庚基、6-氧杂双环[3.2.1]辛基、氧杂环丁烷基、环氧乙烷基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、吡咯啉基、奎宁环基、亚砜基、3-亚砜基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢吡啶基(诸如1,2,3,4-四氢吡啶基和1,2,3,6-四氢吡啶基)、硫杂环丁烷基、环硫乙烷基(thirranyl)、硫杂环戊烷基、硫代吗啉基、三噻烷基(包括1,3,5-三噻烷基)、托品烷基、苯并噻二唑基(包括2,1,3-苯并噻二唑基)、异硫代苯并二氢吡喃基，以及更优选吖啶基、苯并咪唑基、苯并二噁烷基、苯并二氧杂庚基(benzodioxepinyl)、苯并二噁茂基(包括1,3-苯并二噁茂基)、苯并呋喃基、苯并呋吖基、苯并噻唑基、苯并噁二唑基(包括2,1,3-苯并噁二唑基)、苯并噁嗪基(包括3,4-二氢-2h-1,4-苯并噁嗪基)、苯并噁唑基、苯并吗啉基、苯并硒二唑基(包括2,1,3-苯并硒二唑基)、苯并噻吩基、咔唑基、苯并二氢吡喃基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吲唑基、吲哚啉基、吲哚基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基(包括1,6-萘啶基或优选地1,5-萘啶基和1,8-萘啶基)、噁二唑基(包括1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基和1,3,4-噁二唑基)、噁唑基、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹嗪基、喹喔啉基、四氢异喹啉基(包括1,2,3,4-四氢异喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基)、四氢喹啉基(包括1,2,3,4-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢喹啉基)、四唑基、噻二唑基(包括1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基和1,3,4-噻二唑基)、噻唑基、硫代苯并二氢吡喃基、thiophenetyl、噻吩基、三唑基(包括1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基和1,3,4-三唑基)等。在适当的情况下，杂环基团上的取代基可以位于环体系中的任何原子包括杂原子上。杂环基团的连接点可以是经由包括(在适当的情况下)杂原子(诸如氮原子)的环体系中的任何原子，或者可以作为环体系的一部分存在的任何稠合碳环上的原子。杂环基团也可以是n-或s-氧化形式。本文中可
提及的杂环基团包括环状氨基基团，诸如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或环醚诸如四氢呋喃基。
[0091]
当在本文中使用时，术语“杂环烷基”应根据上文中提供的“烷基”和“杂环”的定义来解释，其中基团与式(i)或(ii)化合物的其余部分的连接点是通过杂环烷基基团的烷基部分。
[0092]
本文中提及的取代基可以是取代的或未取代的。当取代基被取代时，它们可以被选自以下的基团中的一个或多个基团取代：卤素(例如，单个卤素原子或多个卤素原子,在多个卤素原子的情况下，形成基团诸如cf3或带有cl3的烷基基团)、氰基、硝基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、杂环、芳基、ora、sra、s(
═
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o)2re，其中，ra是氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、杂环或芳基；rb、rc和rd独立地为氢、烷基、环烷基、杂环、芳基，或者所述rb和rc连同它们所结合的n一起任选地形成杂环；以及re是烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、杂环或芳基。应当理解，这些取代的基团可以是未取代的，或者它们自身被一个或多个卤素原子取代。
[0093]
为免存疑，在两个或更多个的特征(identity)可能相同的情况下，各取代基的实际特征在任何方面都不相互依赖，另有说明除外。
[0094]
本文中可提及的特定苯乙烯和l-苯丙氨酸衍生物包括其中苯乙烯和/或苯丙氨酸的苯环被选自f、cl、br、ch3或och3的(a)一个取代基单取代或或多个取代基二取代的那些。例如，苯乙烯和/或苯丙氨酸的苯环可以被o-f、m-f、p-f、m-cl、p-cl、m-br、p-br、m-ch3、p-ch3或p-och3单取代。
[0095]
在本文中也可提及的本发明的特定实施方式中，苯乙烯衍生物可以是未取代的茚或如上所述针对苯乙烯进行取代的茚。
[0096]
术语“分离的”在本文中被定义为生物组分(诸如核酸、肽或蛋白)，其在天然存在该组分的生物的细胞中与其他生物组分即其他染色体和染色体外dna和rna以及蛋白基本上分离、分开产生或纯化。因此，已经分离的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸。
[0097]
如本文所用的短语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其任何片段，指基因组或合成来源的dna或rna，其可以是单链或双链，并且可以代表有义链或反义链，指肽核酸(pna)，或指任何dna样或rna样材料。在本发明的上下文中，“片段”是指长度大于约60个核苷酸的那些核酸序列，以及最优选长度为至少约100个核苷酸、至少约1000个核苷酸或至少约10,000个核苷酸，它们不是全长天然序列但保持催化酶活性。
[0098]
本文中使用的术语“寡核苷酸”是指至少约6个核苷酸至60个核苷酸、优选约15个至30个核苷酸、和最优选约20个至25个核苷酸的核酸序列，其可用于pcr扩增或杂交测定或微阵列。如本文所用，术语“寡核苷酸”基本上等同于术语“扩增子”、“引物”、“低聚物”和“探针”，如这些术语在本领域中通常定义的那样。
[0099]
术语“变体”和“突变体”在本文中可互换使用。编码至少一种催化酶的至少一种核酸可以编码保持活性的示例性催化酶的变体或突变体。如本文所用的催化酶的“变体”是指
被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，用异亮氨酸替换亮氨酸)。更罕见的是，变体可能会发生“非保守”变化(例如，用色氨酸替换甘氨酸)。类似的微小改变也可以包括氨基酸缺失或插入，或两者兼而有之。可以使用本领域公知的计算机程序例如dnastar软件找到在不消除催化活性的情况下确定哪些氨基酸残基可以被置换、插入或缺失的指导。在一些实施方式中，变体酶在氨基酸水平上与本文所述的示例性氨基酸序列(例如，过氧化氢酶、醇脱氢酶、α-转氨酶)或其功能片段具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源或同一性——例如，长度为成熟参考序列长度的超过约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
[0100]
如本文所述，术语“苯乙醛还原酶”(par)和“醇脱氢酶”(adh)可以互换使用。
[0101]
载体可以包括适用于在宿主细胞中表达一种或多种核酸的形式的一种或多种催化酶核酸。优选地，重组表达载体包括与待表达的一种或多种核酸序列操作性连接的一个或多个调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的那些，以及组织特异性调控和/或诱导序列，诸如本文实施例中公开的t7 iptg诱导型启动子。表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平等因素。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞中，从而产生如本文所述的由核酸编码的蛋白或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，催化酶蛋白、融合蛋白等)。
[0102]
可以将本发明的重组表达载体设计成用于在原核细胞或真核细胞中表达催化酶蛋白。例如，本发明的多肽可以在细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在goeddel,(1990)gene expression technology:methods in enzymology 185,academic press,san diego,calif中对合适的宿主细胞进行了进一步讨论。替代地，一种或多种重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用t7启动子调控序列和t7聚合酶。
[0103]
蛋白在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中使用含有引导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体将许多氨基酸添加到其中编码的蛋白中，通常添加到重组蛋白的氨基末端。这种融合载体通常用于三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；和3)通过在亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这些酶及其同源识别序列包括xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pgex(pharmacia biotech inc；smith,d.b.and johnson,k.s.gene 1988,67:31-40)、pmal(new england biolabs,beverly,mass.)和prit5(pharmacia,piscataway,n.j.)，它们分别将谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖e结合蛋白或蛋白a融合到靶重组蛋白。
[0104]
最大化重组蛋白在大肠杆菌中的表达是在蛋白水解切割重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达该蛋白(gottesman,s.gene expression technology:methods in enzymology 1990 185,academic press,san diego,calif.119-128)。另一种策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的单独密码子是在大肠杆菌中优先使用的密码子(wada et al.,nucleic acids res.1992 20:2111-2118)。本发明核酸序
列的这种改变可以通过标准dna合成技术进行，并在实例中进行了描述。
[0105]
催化酶表达载体可以是酵母表达载体、用于在昆虫细胞中表达的载体(例如，杆状病毒表达载体)、用于在细菌细胞中表达的载体(例如，质粒载体)，或者适用于在哺乳动物细胞中表达的载体。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能可以由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。
[0106]
在优选的实施方式中，启动子是诱导型启动子，例如，由类固醇激素、由多肽激素(例如，借助于信号转导途径)、由化学物质(例如，异丙基β-d-1硫代吡喃半乳糖苷(iptg))或异源多肽调控的启动子。
[0107]
本文所述的方法利用酶来催化一系列反应。虽然这些反应可以单独进行，或者更特别地，其中两个或更多个组合进行，但是所有反应都可以组合成级联反应序列，该级联反应序列在一锅中由初始起始材料提供产物，从而排除了对分离中间体的需要，并且潜在地增加反应序列的总产率。这些级联反应可以涉及在所述反应容器中使用选自由以下组成的组的一种或多种反应性组分：细胞、固定化细胞、细胞提取物、分离的酶和固定化酶。
[0108]
本发明的另一个方面提供了至少一种表达构建体，其包括根据本发明任何方面的是异源的至少一种核酸序列。优选地，至少一种构建体包括适用于在细菌中表达至少一种催化酶的质粒。
[0109]
本发明的另一个方面提供了宿主细胞，其包括本文所述的至少一种核酸分子，例如重组表达载体内的至少一种催化酶核酸分子或含有允许同源重组至宿主细胞基因组的特定位点的序列的催化酶核酸分子。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。这样的术语不仅指特定的受试细胞，而且指这样的细胞的后代或潜在的后代。由于某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，因此这种后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
[0110]
宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，至少一种催化酶蛋白可以在以下中表达：细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞(诸如草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)sf9细胞)、酵母或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho)或cos细胞(非洲绿猴肾细胞cv-1来源的sv40细胞；gluzman cell 1981,i23:175-182))。本领域技术人员已知其他合适的宿主细胞。
[0111]
一种或多种载体dna可以经由常规转化或转染技术引入宿主细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”意指用于将外源核酸(例如dna)引入宿主细胞中的各种本领域公知的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae-右旋糖酐介导的转染、脂质转染或电穿孔。例如，根据本发明，宿主细胞可以包括一个、两个、三个、四个或更多个质粒，质粒中的每一个可以表达至少一种催化酶，该催化酶在从烯烃起始材料到对映体纯的或对映体富集的1,2-氨基醇或α-氨基酸的途径中引导化学转化。宿主细胞还可以包括表达用于提供烯烃的催化酶的载体，例如，通过由氨裂合酶催化的脱氨反应从α-氨基酸生成乙烯基羧酸，以及在由脱羧酶催化的脱羧反应中从乙烯基羧酸生成烯烃。
[0112]
在优选的实施方式中，将烯烃起始材料转化为对映体纯的或对映体富集的1,2-氨基醇或α-氨基酸所需的催化酶作为模块布置在表达载体上，其中每个模块包括催化酶的组合以在整个体系内进行特定反应。例如，第一模块可以包括用于将末端烯烃二羟基化为在质粒上共表达的1,2-二醇的酶；第二模块可以包括用于将1,2-二醇氧化-胺化为在质粒上
共表达的1，2-氨基醇的酶；第三模块可以包括用于将1,2-二醇双重氧化为在质粒上共表达的α-羟基酸的酶；第四模块可以包括用于将α-羟基酸氧化-胺化为在质粒上共表达的α-氨基酸的酶；以及第五模块可以包括用于将α-氨基酸脱氨基-脱羧为烯烃的酶。这种酶作为模块的布置允许在一个锅中构建一系列级联反应的灵活性。一个或多个模块可以被工程化到同一质粒上。例如，在同一质粒或不同质粒上包括所述第一模块和第三模块的宿主细胞能够催化末端烯烃转化为1,2-氨基醇。同样，包括所述第一、第二和第四模块的宿主细胞能够催化末端烯烃转化为α-氨基酸。如果模块5在宿主细胞中共表达，则可以为细胞提供α-氨基酸原料，以生成用于级联反应的其自身末端烯烃。
[0113]
在本发明的一个方面，提供了选自包括以下的组的一种或多种重组原核细胞或真核细胞：细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，其中所述细胞包括至少一种表达构建体和/或异源核酸分子，其编码从烯烃到对映体纯的或对映体富集的1,2-氨基醇或者从α-氨基酸到对映体纯的或对映体富集的1,2-氨基醇的途径中所需的至少一种催化酶。
[0114]
细胞可以包含单一表达载体或构建体，诸如质粒，其在至少一种调控元件的控制下表达单一催化酶或共表达本文所述的多种催化酶。催化酶可以在每个基因之前在具有一个核糖体结合位点的启动子的控制下作为单独的人工操纵子布置在质粒中，或者与单独的启动子一起布置。因此，一锅合成级联可以使用在一个或多个质粒上表达所有所需催化酶的细胞来实现，或者使用各自表达特定催化酶库的不同重组细胞来实现，前提是包括用于特定化学转化的必要细胞。
[0115]
在另一优选的实施方式中，用于本发明的所述催化酶与本文提及的至少一种酶具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性或氨基酸同一性。
[0116]
本发明的宿主细胞可用于产生(即表达)一种或多种催化酶蛋白。因此，本发明进一步提供了用于使用本发明的宿主细胞来产生一种或多种催化酶蛋白例如本文所述的一种或多种催化酶蛋白的方法。在一种实施方式中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(已经/已经将编码一种或多种催化酶蛋白的一种或多种重组表达载体引入其中)，从而产生一种或多种催化酶蛋白。在另一实施方式中，该方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离一种或多种催化酶蛋白。
[0117]
本发明第一方面中产生对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的方法可以包括以下步骤：
[0118]
(a)通过进行由环氧化酶催化的环氧化反应形成氧化苯乙烯或其衍生物，并在环氧化物上进行由环氧化物水解酶催化的水解反应，或通过由双加氧酶催化的二羟基化反应来由苯乙烯或其衍生物生成对映体纯的或对映体富集的苯乙二醇或其衍生物；和
[0119]
(b)通过使用氧化酶将苯乙二醇上的伯醇选择性氧化为羧酸，由对映体纯的或对映体富集的苯乙二醇或其衍生物生成对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物。
[0120]
在上述酶促级联中，可以应用以下的一种或多种：
[0121]
(a)环氧化酶可以是苯乙烯单加氧酶，任选地，其中，苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属vlb120或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶；和/或
[0122]
(b)当使用时，环氧化物水解酶可以是来自马铃薯或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶；和/或
[0123]
(c)氧化酶可以是醇氧化酶，任选地，其中醇氧化酶来自天蓝色链霉菌，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。
[0124]
如上所述，当前公开的发明可以利用经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞(即，经基因工程化为过表达多种酶的一种或更多种重组微生物细胞)。例如，重组微生物细胞可以是大肠杆菌t7-pcdf-smo-steh、prsf-aldo。当寻求从苯乙烯或其衍生物生成(r)-扁桃酸或其衍生物时，这种重组微生物细胞可能特别有用。然而，当试图从l-苯丙氨酸或其衍生物或从葡萄糖或甘油生成(r)-扁桃酸或其衍生物时，效用可能有限(除非连同其他重组细胞一起使用)。
[0125]
因此，在本发明的另一实施方式中，该方法可以进一步包括通过以下来提供苯乙烯或其衍生物：通过经由氨裂合酶催化的脱氨反应由l-苯丙氨酸或其衍生物生成反式肉桂酸或其衍生物，并在由脱羧酶催化的脱羧反应中由反式肉桂酸或其衍生物生成苯乙烯或其衍生物。在这些实施方式中可以使用任何合适的氨裂合酶。例如，氨裂合酶可以是来自拟南芥的苯丙氨酸氨裂合酶，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。在这些实施方式中可以使用任何合适的脱羧物。例如，脱羧物可以是来自拟南芥的苯基丙烯酸脱羧酶，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。在可以在本文中提及的特定实施方式中，经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞中的一种(即，经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞)可以是大肠杆菌t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo。
[0126]
如上所述，本文公开的方法可以利用细胞装置由葡萄糖或甘油生成用于酶促级联的原料。因此，在本发明的一些实施方式中，该方法可以进一步包括过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的细胞，该细胞将葡萄糖或甘油转化为l-苯丙氨酸。例如，由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞可以过表达至少一种酶，该酶选自由以下组成的组中的一种或多种：dahp合酶(arog)、莽草酸激酶(arok)、莽草酸脱氢酶(ydib)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(phea)和酪氨酸氨基转移酶(tyrb)，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。更特别地，由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞可以过表达至少一种酶，该酶是：
[0127]
(a)arog的反馈抑制抗性突变体；
[0128]
(b)phea的反馈抑制抗性突变体。
[0129]
如将要理解的，可以过表达这些酶中的一种或两种。
[0130]
在本发明的特定实施方式中，过表达至少一种酶由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞可以是其中微生物细胞突变为缺失或失活crr和/或tyra基因的微生物细胞。
[0131]
在本发明的特定实施方式中，过表达至少一种酶由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞可以是大肠杆菌nst74-pcdf-phe、pet-pal-pad、pacyc-smo-steh、prsf-aldo，其也可以用于由葡萄糖或甘油产生(r)-扁桃酸。替代地，过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的微生物细胞可以是大肠杆菌nst74-phe，其可以与大肠杆菌t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo组合以由葡萄糖或甘油提供(r)-扁桃酸。不希望受理论的束缚，认为如本文所讨论的，认为将由葡萄糖和/或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞的一种菌株(例如，大肠杆菌nst74-phe)与将l-苯丙氨酸转化为(r)-扁桃酸的微生物细胞的第二种菌株组合可以是该方法的可选配置。
[0132]
该方法可以利用任何合适的介质来进行反应。例如，一锅反应体系可以包括水性
介质。替代地或此外，一锅反应体系可以包括使用双相介质，任选地，其中，双相介质由以下组成：水性和固体树脂介质或者水性和有机溶剂介质(例如，有机溶剂介质选自一种或多种烷烃溶剂和/或一种或多种酯溶剂)。本文中可以提及的烷烃溶剂包括但不限于正十六烷。
[0133]
在本文公开的本发明的实施方式中，一锅反应体系可以包括使用吸收树脂或纳米材料用于原位移出产物。
[0134]
在本发明的另一方面，提供了一种分离的核酸分子，其编码至少一种异源催化酶，该异源催化酶选自包括以下的组：
[0135]
(a)用于进行环氧化反应以由苯乙烯或其衍生物形成氧化苯乙烯或其衍生物的环氧化酶和用于在环氧化物上进行水解反应以提供苯乙二醇或其衍生物的环氧化物水解酶，或者通过二羟基化反应由苯乙烯或其衍生物生成苯乙二醇或其衍生物的加氧酶；
[0136]
(c)用于通过苯乙二醇或其衍生物上伯醇的选择性氧化生成对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的氧化酶；或者
[0137]
(d)用于通过脱氨反应由l-苯丙氨酸或其衍生物生成反式肉桂酸或其衍生物的氨裂合酶；以及
[0138]
(e)用于在脱羧反应中由反式肉桂酸或其衍生物生成苯乙烯或其衍生物的脱羧酶。
[0139]
如将理解的，上述分离的核酸分子可以编码两种或更多种、诸如三种或更多种、诸如四种或更多种或者所有所述催化酶。也就是说，分离的核酸可以编码多种所述催化酶。在这样的实施方式中，
[0140]
所述多种催化酶可以被布置为选自包括以下的组的至少一个模块：
[0141]
i)包括在表达时将苯乙烯或其衍生物酶促转化为苯乙二醇或其衍生物的异源核酸序列的模块；
[0142]
ii)包括在表达时将苯乙二醇或其衍生物酶促转化为(r)-扁桃酸或其衍生物的异源核酸序列的模块；以及
[0143]
iii)包括在表达时将l-苯丙氨酸或其衍生物酶促转化为苯乙烯或其衍生物的异源核酸序列的模块；
[0144]
或其任意组合。
[0145]
本发明的另一方面可以涉及包括至少一种如上所述的核酸分子的表达构建体。表达构建体可以包括一种或多种重组原核细胞或真核细胞，该重组原核细胞或真核生物细胞选自包括以下的组：细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。例如，一种或多种重组原核细胞或真核细胞可以是其中所述酶与选自包括以下的组的至少一种酶具有至少50％的氨基酸同一性的重组原核细胞或真核细胞：
[0146]
(a)来自假单胞菌属(pseudomonas sp.)vlb120的苯乙烯单加氧酶；
[0147]
(b)来自马铃薯(solanum tuberosum)的环氧化物水解酶；
[0148]
(c)来自天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)的醇氧化酶；
[0149]
(d)来自拟南芥(arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨裂合酶；
[0150]
(e)来自黑曲霉(aspergillus niger)的苯基丙烯酸脱羧酶。
[0151]
在本发明的特定实施方式中，一种或多种重组细胞可以选自：
[0152]
(a)大肠杆菌t7-pcdf-smo-steh、prsf-aldo；
broth，tb)培养基作为替代培养基，其含有(每升)：24g酵母膏、20g胰胨和4ml甘油。
[0166]
分析技术
[0167]
反相高效液相色谱法(hplc)
[0168]
使用反相hplc(shimadzu prominence hplc system)分析l-phe、(r)-ped和(r)-ma。柱：安捷伦poroshell 120sb-c18(150mm x 4.6mm x 2.7μm)。流动相：30％ acn和70％含0.1％tfa的水。流速：0.4ml/min，温度：25℃。检测器：光电二极管阵列检测器。波长：210nm。停留时间：(r)-1,2-苯基乙二醇5.5min，(r)-ma 5.8min，l-苯丙氨酸4.1min，苯甲醇8.3min(内标)。
[0169]
正相hplc
[0170]
用手性柱通过正相hplc来测定(r)-ma的对映体过量(ee)。柱：daicel chiralpak ic-3(250
×
4.6mm，3μm)。流动相：10％异丙醇和90％正己烷。流速：0.8ml/min。检测波长：210nm。温度：25℃。
[0171]
气相色谱法(gc)
[0172]
使用安捷伦7890agc分析苯乙烯和(s)-氧化苯乙烯。柱：安捷伦hp-5(30m x 0.32mm x 0.25mm)。温度程序：初始温度为70℃，增加25℃/min，直到达到200℃；随后以50℃/分钟的速度升至250℃，然后保持1分钟；最后，以20℃/分钟的速度升至270℃。停留时间：苯乙烯2.8min，(s)-氧化苯乙烯4.0min，以及苯甲醇3.8min(内标)。
[0173]
sds-page
[0174]
凝胶制备：
[0175]
首先制备10ml分离凝胶，该分离凝胶含有h2o(3.2ml)、8％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺(4ml)、1.5m tris(ph 8.8，2.6ml)、10％(w/v)sds(0.1ml)、10％(w/v)、过硫酸铵(0.1ml)和temed(0.01ml)。随后，向固化的分离凝胶上添加5ml积层凝胶，该积层凝胶含有h2o(2.975ml)、0.5m tris-hcl(ph 6.8，1.25ml)、10％(w/v)sds(0.05ml)、8％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺(0.67ml)、10％(w/v)sds(0.05ml)、10％(w/v)过硫酸铵(0.05ml)和temed(5μl)。
[0176]
样品制备：
[0177]
首先接种指定菌株并用相应的抗生素培养，随后收获并以5000g离心10min。通过使用h2o将细胞沉淀重悬至1g cdw/l的细胞密度。随后加入sds-page加载染料，并且随后将每个样品在95℃下进行加热15min。相应地将10μl的每种样品加载到孔中，并进行sds-page 90分钟。
[0178]
核磁共振(nmr)光谱法
[0179]
使用bruker avance
tm iii hd 400mhz光谱仪进行1h和
13
c nmr分析。
[0180]
由甘油或葡萄糖产生l-phe的补料分批培养细胞发酵的通用程序
[0181]
在37℃和250rpm下将大肠杆菌nst74-phe接种在含有50μg/ml链霉素的100ml lb培养基中12小时。随后将接种的菌株转移并培养在具有含有以下项的改良nh4培养基的1.5升生物反应器中持续28h：10g/l(nh4)2so4、5g/l kh2po4、5mg/l mgso4、5g/l酵母膏、50μg/ml链霉素和10g/l的碳源(甘油或葡萄糖)。使用30％ nh4oh和80％碳源作为进料，以将碳源分别控制在ph 6.8和5-10g/l，而没有乙酸盐/酯积累。还分别将通风和搅拌器速度在0.5-3升/分钟和500-2000rpm之间进行调整，以将溶解氧(do)水平保持在20-30％。在8h时添加
iptg至0.1mm的终浓度以诱导蛋白表达。在发酵结束时，在进行另外的生物转化之前，加入30％nh4oh以将反应混合物调节至ph 8.0。
[0182]
培养大肠杆菌细胞的通用程序
[0183]
用含有适当的抗生素(50μg/ml卡那霉素、50μg/ml氯霉素、50μg/ml链霉素或100μg/ml氨苄青霉素)的lb培养基接种大肠杆菌菌株，在37℃和250rpm下持续8-10h。随后将接种的菌株转移并在具有m9培养基的250ml带挡板的培养瓶中培养，该m9培养基含有总体积为50ml的适当的抗生素。当细胞密度(od600
nm
)达到～0.6时，加入iptg至终浓度为0.5mm，以在22℃下诱导蛋白质表达。在生长14h后通过离心(4000g，10min)收获细胞。
[0184]
实施例1苯乙烯转化为(r)-ma的人工酶级联的开发
[0185]
重组大肠杆菌菌株的基因工程
[0186]
基于genscript已报道的基因序列(genbank登录号：sco6147)对来自天蓝色链霉菌a3(2)的糖醇氧化酶(aldo)基因进行了密码子优化和合成。使用phusion dna聚合酶通过聚合酶链式反应(pcr)扩增aldo的基因片段，正向引物5
′‑
tatatcatgagcgacattaccgttaccaac-3
′
和反向引物5
′‑
ctcgaattcttaacctgccagaacgccacgaac-3
′
(限制性位点以下划线示出)。用bsphi和ecori消化pcr产物，并且然后用ncoi和ecori酶切的prsfduet-1连接，以得到prsf-aldo。通过将prsf-aldo转化到化学感受态大肠杆菌t7细胞中来制备大肠杆菌(aldo)菌株。
[0187]
通过将prsf-aldo和先前构建的pcdf smosteh(y.zhou,s.wu&z.li,angew.chem.int.ed.2016,55,11647
–
11650)共转化到化学感受态大肠杆菌t7细胞中来制备大肠杆菌(s2a)菌株。通过将先前构建的pet-pal-pad(y.zhou,s.wu&z.li,angew.chem.int.ed.2016,55,11647
–
11650)转化到化学感受态大肠杆菌(s2a)细胞中来制备大肠杆菌(p2s2a)菌株。大肠杆菌nst74(p2s2a)菌株的工程化类似于使用我们先前构建的大肠杆菌nst74(de3)细胞的上述程序(y.zhou et al.,chemsuschem 2018,11,2221-2228)。表1-2中列出了本研究中使用的所有菌株和酶。
[0188]
表1.在本研究中使用的菌株。
[0189]
[0190][0191]
表2.在本研究中使用的酶。
[0192]
[0193][0194]
实施例2(r)-ped至(r)-ma的生物转化
[0195]
使用水相中的大肠杆菌(aldo)静息细胞将(r)-ped生物转化为(r)-ma
[0196]
用卡那霉素抗生素(50mg/l)培养大肠杆菌(aldo)细胞，收获并重悬于10ml含有2.76g/l(20mm)(r)-ped的kp缓冲液(磷酸钾缓冲液,100
–
200mm,ph 8.0)中至细胞密度为10-15g cdw/l，在30℃和250rpm下进行生物转化24h。收集50μl水相，并用含0.5％tfa的450μl超纯水和含2mm苯甲醇的500μl acn稀释。使用hplc对样品进行分析，以量化(r)-ma和(r)-ped的浓度。
[0197]
结果与讨论
[0198]
选择来自天蓝色链霉菌a3(2)的糖醇氧化酶(aldo)用于将(r)-ped转化为(r)-ma(图1b，d.p.h.m.heuts et al.,j.biol.chem.2007,282,20283
–
20291；and e.w.van hellemond et al.,adv.synth.catal.2009,351,1523
–
1530)。将aldo基因克隆到prsfduet-1质粒中，并转化到大肠杆菌t7菌株中，从而得到大肠杆菌(aldo)。在30℃下，用大肠杆菌(aldo)细胞(10
–
15g cdw/l)在kp缓冲液体系(200mm，ph 8.0)中研究(r)-ped至(r)-ma的生物转化，持续24h，并且15g cdw/l的细胞得到最好的结果。时程如图2a所示。在(r)-ped的快速消耗下，(r)-ma在最初的8h内以线性速率产生。生物转化8h后，产生1.9g/l的(r)-ma，得到的时空产率为237.5mg/l。这些结果清楚地表明，aldo催化(r)-ped转化为(r)-ma。随着反应的继续，反应速率逐渐降低，在24h内以80％的产率产生2.43g/l(16mm)的(r)-ma，而600mg/l(4mm)(r)-ped仍未反应。这可能是因为对(r)-ped的高km(101mm)(e.w.van hellemond et al.,adv.synth.catal.2009,351,1523
–
1530)和相对较低的aldo活性。可能需要酶进化来增加其与(r)-ped的亲和力以及活性。尽管在与20mm底物的反应期间可以产生h2o2，但细胞中产生的低水平h2o2并不影响酶促反应。这可能是因为大肠杆菌细胞产生了能够分解h2o2的内源性过氧化氢酶。还尝试了大肠杆菌中过氧化氢酶与aldo的共表达。然而，产品产量并没有增加。
[0199]
实施例3.在正-十六烷-水性两-相体系中经由全细胞生物转化由苯乙烯一锅生物
生产(r)-ma
[0200]
苯乙烯是一种很好的工业原料，因为它可以以非常大的规模和低成本由乙基苯通过脱氢生产。由苯乙烯直接生产(r)-ma提供了一种经济且无氰的合成方法。因此，为苯乙烯生物转化为(r)-ma设计了包括smo、steh和aldo的合成途径(图1b)。将共表达smo、steh和aldo的大肠杆菌(s2a)细胞用作全细胞催化剂，用于将苯乙烯生物转化为(r)-ma。
[0201]
(图3)。
[0202]
在两-相体系中用大肠杆菌(s2a)静息细胞将苯乙烯生物转化为(r)
‑‑
ma
[0203]
接种大肠杆菌(s2a)细胞并用抗生素(50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素)培养，然后收获并重悬于10ml含有0.5％葡萄糖的kp缓冲液(200mm，ph 8.0)中，使细胞密度达到15g cdw/l。加入10ml含有2.08g/l(20mm)苯乙烯的正十六烷，在30℃和250rpm下进行24h的生物转化。收集50μl水相，并用含有0.5％tfa的450μl超纯水和含有2mm苯甲醇的500μl acn稀释。使用hplc对样品进行分析，以量化(r)-ma和(r)-ped的浓度。收集50μl有机相，用含有2mm苯甲醇的950μl乙酸乙酯稀释，并使用gc分析样品，以量化苯乙烯和(s)-氧化苯乙烯的浓度。
[0204]
结果与讨论
[0205]
用prsf-aldo与pcdf smo-steh一起共转化，得到共表达smo、steh和aldo的大肠杆菌(s2a)，用于苯乙烯直接转化为(r)-ma(图1b)。在30℃下在含有0.5％葡萄糖的kp缓冲液(200mm，ph 8.0)和正十六烷的混合物(1:1；v/v)中，使用大肠杆菌(s2a)细胞(15g cdw/l)进行苯乙烯至(r)-ma的级联生物转化，持续24h。有机相用作有毒底物苯乙烯和中间体氧化苯乙烯的储库。如图4所示，在正十六烷-水两相体系中，使用大肠杆菌(s2a)细胞的静息细胞，在苯乙烯(20mm)的生物转化期间产生(r)-ma。由苯乙烯产生(r)-ma的时程在图2b中示出。随着时间的推移，苯乙烯的浓度迅速下降，并且(r)-ma和(r)-ped的浓度逐渐增加。在最初的10h内成功地获得了1.07g/l(7mm)的(r)-ma，这对应于107mg/l/h的时空产率。反应24h后，由2.08g/l(20mm)的苯乙烯以及剩余的(r)-ped(800mg/l；6mm)和苯乙烯(300mg/l；3mm)产生了1.52g/l(10mm)(r)-ma(》99％ee)。观察到少量的质量不平衡(约1mm)，这可能是由于苯乙烯的蒸发。
[0206]
实施例4.在正-十六烷-水性两-相体系中经由全细胞生物转化由l-phe一锅生物产生(r)-ma
[0207]
l-phe是可再生的生物基起始材料，其可以经由微生物发酵以非常大规模和低成本生产。由l-phe直接生产(r)-ma提供了经济且可持续的合成方法。为了实现这一目标，选择pal和pad并将其用于l-phe至苯乙烯的转化。然后，将这两种酶加入实施例3中描述的将苯乙烯转化为(r)-ma的人工途径中，以构建新的合成途径。
[0208]
用于将l-phe转化为(r)-ma的人工酶级联的开发
[0209]
为了开发由l-phe产生(r)-ma的酶级联，将来自拟南芥的pal催化的脱氨反应和来自黑曲霉的pad[由阿魏酸脱羧酶(fdc1)和苯基丙烯酸脱羧酶(pad1)组成]催化的脱羧反应引入上述环氧化-水解-双氧化人工酶级联中，产生新的五酶级联。pal和pad的加入使得l-phe能够生物转化为(r)-ma(图1b)。
[0210]
为了工程化表达五酶人工级联反应的大肠杆菌菌株，将先前构建的pet-palpad(y.zhou,s.wu&z.li,angew.chem.int.ed.2016,55,11647
–
11650)转化到大肠杆菌(s2a)细
胞中，以得到大肠杆菌(p2s2a)。通过sds-page分析酶在大肠杆菌(p2s2a)中的表达(图5)。清楚地观察到了pal、pad、smo、steh和aldo的相应蛋白条带，这表明这些酶良好表达。将共表达pal、pad、smo、steh和aldo的大肠杆菌(p2s2a)细胞用作全细胞催化剂，用于将l-phe生物转化为(r)-ma(图6)。
[0211]
在两-相体系中用大肠杆菌(p2s2a)的静息细胞将l-phe生物转化为(r)-ma
[0212]
用含有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb培养基接种大肠杆菌(p2s2a)细胞。然后，培养、收获大肠杆菌(p2s2a)细胞，并将其重悬于含有0.5％葡萄糖和2.48g/l(15mm)l-phe的10ml kp缓冲液(200mm，ph 8.0)中，使细胞密度为15g cdw/l。加入10ml正十六烷，以在30℃和250rpm下进行生物转化24h。收集50μl水相，并用含有0.5％ tfa的450μl超纯水和含有2mm苯甲醇的500μlacn稀释。使用hplc对样品进行分析，以量化(r)-ma、(r)-ped和l-phe的浓度。收集50μl有机相，用含有2mm苯甲醇的950μl乙酸乙酯稀释，并使用gc分析样品，以量化苯乙烯和(s)-氧化苯乙烯的浓度。
[0213]
结果与讨论
[0214]
在含有0.5％葡萄糖和2.48g/l(15mm)l-phe的kp缓冲液(200mm，ph 8.0)和正十六烷(1:1；v/v)的混合物中，在30℃和250rpm下使用大肠杆菌(p2s2a)细胞(15g cdw/l)进行l-phe到(r)-ma的级联生物转化。有机相用作有毒中间体诸如苯乙烯和氧化苯乙烯的储库。如图7所示，在使用大肠杆菌(p2s2a)细胞的静息细胞进行15mm l-phe的生物转化期间中产生了(r)-ma。反应的时程在图2c中示出。随着l-phe的快速还原，苯乙烯、(r)-ped和(r)-ma逐渐增加。生物转化6小时后，产生650mg/l的(r)-ma，时空产率为108.3mg/l。在2.48g/l(15mm)l-phe的24h生物转化后，获得了913mg/l(6mm)的(r)-ma(》99％ee)。这些结果表明，通过新开发的五酶级联，l-phe成功地生产了(r)-ma，并代表了在自然资源生物生产中最高的(r)-ma浓度。考虑到剩余的未反应的l-phe(3mm)和中间体苯乙烯(1mm)和(r)-ped(6mm)，观察到了少量的质量不平衡(约1mm)，这也可能是由于苯乙烯蒸发。此外，(r)-ma的效价远高于先前报道的效价(酵母细胞中236mg/l，大肠杆菌细胞中680mg/l，m.reifenrath&e.boles,metab.eng.2018,45,246
–
254；and z.sun et al.,microb.cell fact.2011,10,71)。
[0215]
生物转化也在相同的反应条件下使用5mm或10mm l-phe进行。3mm和6mm的(r)-ma在两种情况下都以60％的转化率产生，这高于从15mm l-phe获得的转化率。尽管产品效价远高于先前的报道，但尚不足以用于商业应用。当许多不同的酶在大肠杆菌细胞中共表达时，aldo的表达处于相对低的水平(图6d)。另外，aldo示出活性不足。这些可能是(r)-ped积累的原因。需要进一步的优化诸如以高水平和良好的比率表达不同的酶，以及工程化更有效的酶，以增加转化率，提高产品效价，并减少中间体的积累。
[0216]
实施例5.使用表达五-酶人工级联的l-phe-高产大肠杆菌菌株来由甘油或葡萄糖一锅发酵生产(r)-ma
[0217]
葡萄糖或甘油是在许多微生物发酵过程中常用的原料，用于以大规模且低成本生产精细化学品。由葡萄糖或甘油直接产生(r)-ma为药物和高价值化学品的绿色、经济和可持续生物合成提供了一种良好的方法。
[0218]
对于单菌株方法，l-phe和(r)-ma在同一细胞中产生。天然l-phe生物合成途径和实施例4中描述的将l-phe转化为(r)-ma的人工途径的组合导致了一种新的途径，使得葡萄
糖或甘油能够在一个细胞中生物转化为(r)-ma(图1c)。
[0219]
由甘油或葡萄糖生产(r)-ma的大肠杆菌菌株的工程化
[0220]
为了由甘油或葡萄糖合成(r)-ma，将大肠杆菌t7宿主转化为大肠杆菌nst74菌株。后者是l-phe高产菌株，由甘油或葡萄糖产生l-phe(y.j.choi&d.e.tribe,biotechnol.lett.1982,4,223
–
228)。将prsf-aldo、pet-pal-pad和pcdf-smo-steh转化到先前工程化的大肠杆菌nst74(de3)菌株(y.zhou,s.wu&z.li,angew.chem.int.ed.2016,55,11647
–
11650)中，以得到大肠杆菌nst74(p2s2a)菌株(图6c)。通过sds-page分析大肠杆菌nst74(p2s2a)中的蛋白质表达(图6d)。与来自大肠杆菌(p2s2a)的结果相似，参与人工酶级联的所有酶都在大肠杆菌nst74(p2s2a)菌株中良好表达。将共表达l-phe生物合成途径涉及酶pal、pad、smo、steh和aldo的大肠杆菌nst74(ps2s2a)细胞用作将葡萄糖或甘油生物转化为(r)-ma的全细胞催化剂(图8)。
[0221]
在水性体系中使用单株大肠杆菌菌株由甘油或葡萄糖发酵产生(r)-ma
[0222]
用含有适当的抗生素(50μg/ml卡那霉素、50μg/ml链霉素或100μg/ml氨苄青霉素)的lb培养基接种大肠杆菌nst74(p2s2a)菌株，在37℃和250rpm下持续8-10h。随后将接种的菌株转移并在具有m9培养基或tb培养基(含有0.4％(v/v)甘油作为碳源)的250ml带挡板的培养瓶中培养，并且适当的抗生素的总体积为50ml。当od600
nm
达到～0.6时，加入终浓度为0.1mm的iptg以诱导蛋白表达。在25℃下再培养细胞另外的24h。培养24h后，通过离心(4000g，10分钟)收获细胞。通过hplc分析(r)-ma、l-phe和(r)-ped的浓度。通过gc分析反应样品中苯乙烯的浓度。
[0223]
在正-十六烷-水性两-相体系中使用单株大肠杆菌菌株来由甘油或葡萄糖发酵生产(r)-ma
[0224]
在正-十六烷-水性两-相体系中由甘油或葡萄糖发酵生产(r)-ma是按照上述发酵生产方案进行的，不同之处在于在加入iptg后加入25ml正十六烷(正十六烷:水＝1:2)。
[0225]
结果与讨论
[0226]
甘油(图9a)和葡萄糖(图9b)的发酵生物转化分别成功地得到75mg/l(0.49mm)和48mg/l(0.31mm)的(r)-ma浓度。与用葡萄糖为碳源进行的发酵相比，甘油的发酵产生了更高的(r)-ma效价，这表明细胞倾向于消耗更多的葡萄糖用于生长，而不是用于(r)-ma的产生。应当注意，在发酵期间观察到苯乙烯在水相中的高积累，这对细胞造成毒性并导致低产物产率。
[0227]
为了解决苯乙烯的毒性问题，将正十六烷-水两相体系用于发酵。在此，正十六烷作为有毒底物和中间体的储库，用于降低它们对细胞的毒性。在上述条件下在m9或tb培养基中培养大肠杆菌nst74(p2s2a)细胞。发酵的时程示于图9c-d中。(r)-ped和(s)-氧化苯乙烯的浓度非常低(图9)，这可能是由甘油或葡萄糖产生的l-phe的低浓度引起的。与以前的单一水性体系相比，两相体系仍然显著提高了产物浓度。当l-phe、(r)-ped和(r)-ma在水相中形成时，中间体苯乙烯和(s)-氧化苯乙烯保留在有机相中以避免毒性问题。甘油和葡萄糖在两相体系中的发酵生物转化分别获得了228mg/l(1.5mm)和152mg/l(1mm)的(r)-ma的最佳结果，苯乙烯的积累显著减少。
[0228]
实施例6.通过分别表达人工酶级联和l-phe生物合成途径的两个大肠杆菌菌株的联合，来由甘油或葡萄糖一锅生产(r)-ma。
[0229]
对于联合菌株方法，l-phe由一个大肠杆菌菌株产生，并且(r)-ma的产生由第二个大肠杆菌菌株催化。大肠杆菌能够经由莽草酸途径由甘油或葡萄糖产生l-phe。
[0230]
在正-十六烷-水性两-相体系中经由两个联合的大肠杆菌菌株来由甘油或葡萄糖发酵生产(r)-ma
[0231]
为了增强大肠杆菌产生l-phe的能力，选择了涉及包括以下的酶的l-phe生物合成途：oahp合酶arog*(反馈抑制抗性突变体arog-d146n)、莽草酸脱氢酶ydib、莽草酸激酶arok、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶phea*(反馈抑制抗性突变体，具有1-300aa的phea截短版)和酪氨酸氨基转移酶tyrb，并且这些酶也在大肠杆菌中过表达。将这些酶克隆到pcdf-duet-1载体中，并将所得质粒pcdf-phe转化至大肠杆菌nst74中。
[0232]
首先，通过在补料分批生物反应器中用大肠杆菌nst74－phe菌株(图8a，b.s.sekar,b.r.lukito&z.li acs sustainable chem.eng.2019,7,14,12231
–
12239)来由甘油或葡萄糖通过微生物发酵生产来产生l-phe。将大肠杆菌(nst74－phe)从甘油原液接种至含有链霉素(50mg/l)的100ml的lb中，并在37℃下于250ml烧瓶中生长，直到od600
nm
达到3-4。将培养物转移到含有1l发酵培养基(10g/l葡萄糖或甘油、10g/l(nh4)2so4、5g/l kh2po4、5g/l mgso4、5g/l酵母膏、15mg/l feso4、15mg/l mnso4和1g/l甜菜碱)的3l生物反应器中。在发酵期间，加入600g/l葡萄糖或800g/l甘油溶液以将葡萄糖或甘油的浓度维持在5-10g/l。通过nh4oh溶液将ph控制在6.8。通过以0.5-3l/min供应空气或纯氧并在500和1500rpm之间改变搅拌速度，使do保持在20-30％。当od600
nm
达到15-20时，加入终浓度为0.1mm的iptg。当培养物达到固定相时，停止发酵。含有生物合成的l-phe的发酵培养物直接用于以下生物转化实验。
[0233]
在发酵产生l-phe的时间段期间，用含有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb培养基接种大肠杆菌(p2s2a)菌株。然后，培养、收获大肠杆菌(p2s2a)细胞并重悬于3-4ml kp缓冲液(4m，ph 8.0)中。将浓缩的大肠杆菌(p2s2a)细胞悬浮液、kp缓冲溶液(4m，ph 8.0)和40％葡萄糖溶液加入含有l-phe(67mm来自葡萄糖或78mm来自甘油)和大肠杆菌(nst74phe)细胞的发酵培养基中，得到5ml含有60或72mm l-phe、kp缓冲液(200mm，ph 8.0)、1％葡萄糖和15g cdw/l大肠杆菌(p2s2a)细胞悬浮液的反应混合物。加入5ml正十六烷，在30℃和250rpm下进行l-phe至(r)-ma的生物转化24h(图10a)。最终反应混合物包含1.65g/l(10mm)的l-phe、200mm的kp缓冲液(ph 8.0)、1％的葡萄糖、15g cdw/l的大肠杆菌(p2s2a)细胞和正十六烷(1:1，v/v)。通过hplc分析反应样品以量化(r)-ma、l-phe和(r)-ped的浓度。通过gc分析反应样品中苯乙烯的浓度。
[0234]
结果与讨论
[0235]
通过联合过表达五种限制酶以经由莽草酸途径将甘油或葡萄糖转化为l-phe的大肠杆菌nst74－phe(b.s.sekar,b.r.lukito&z.li acs sustainable chem.eng.2019,7,14,12231
–
12239)和表达新的人工级联以将l-phe转化为(r)-ma的大肠杆菌(p2s2a)来检测由甘油或葡萄糖产生(r)-ma(图2c)。首先将大肠杆菌nst74－phe在含有10g/l甘油或葡萄糖的改性nh4培养基中生长28h，以分别由甘油和葡萄糖产生12.88g/l(78mm，图10a)和11.07g/l(67mm)的l-phe。
[0236]
随后，将新鲜制备的大肠杆菌(p2s2a)细胞、浓缩的kp缓冲液(ph8.0)和葡萄糖溶液直接加入到发酵培养基中，得到含有1.65g/l l-phe、200mm kp缓冲溶液(ph8.0)、1％葡
萄糖和15g cdw/l大肠杆菌(p2 s2a)细胞的反应混合物。加入正十六烷以使水相和有机相的比率为1:1(v/v)。在30℃和250rpm下进行生物转化24h。分别从甘油发酵培养基和葡萄糖发酵培养基获得了760(5mm)和455mg/l(3mm)的(r)-ma(图10和图11)，反应体系中残留有一定量的(r)-ped和苯乙烯(表3)。虽然由甘油或葡萄糖表达和产生l-phe的最佳温度为37℃(b.s.sekar,b.r.lukito&z.li acs sustainable chem.eng.2019,7,14,12231
–
12239)，但人工酶级联表达的最佳温度是22℃，以及对于l-phe级联生物转化为(r)-ma的最佳温度则是30℃。因此，25℃下的单细胞发酵产生较低的产物浓度。相反，两种细胞体系可以在它们各自的最佳温度下操作，以得到更高的产率。使用甘油作为原料示出比先前报道的(r)-ma效价(酵母细胞中236mg/l，大肠杆菌细胞中680mg/l，m.reifenrath&e.boles,metab.eng.2018,45,246
–
254；and z.sun et al.,microb.cell fact.2011,10,71)更高的(r)-ma效价。
[0237]
表3.经由联合大肠杆菌(nst74－phe)和大肠杆菌(p2s2a)细胞将葡萄糖或甘油生物转化为(r)-ma。
[0238][0239]
a)
反应在30℃和250rpm下进行24h。
[0240]
在此，分别报道了开发用于由廉价且容易获得的苯乙烯、生物基l-phe产生(r)-ma的新的人工酶级联(图6a)，以及用于在单个菌株中由葡萄糖或甘油产生(r)-ma的天然l-phe生物合成途径和人工酶级联的组合(图6b)和联合细胞生物转化(图6c)。这些结果成功地证明了由廉价且易于获得的可再生原料产生(r)-ma的强和合成潜力。
[0241]
实施例7.在水性-正-十六烷两-相体系中l-phe至(r)-ma的制备型生物转化
[0242]
在水性－正-十六烷两相体系中l-phe至(r)-ma的制备型生物转化
[0243]
将含有大肠杆菌(p2s2a)细胞(15g cdw/l)、0.5％葡萄糖和10mm l-phe的50ml kp缓冲液(100mm，ph 8.0)与50ml正十六烷混合，以在30℃和250rpm下进行生物转化24h。随后将反应混合物离心(5000g，15min)，以将水相与有机相和细胞沉淀分离。收集水相，用nacl饱和，并通过加入10m hcl将ph调节至1，随后用乙酸乙酯(3x 50ml)萃取。然后收集有机相并使用na2so4干燥，随后过滤。随后通过使用旋转蒸发器蒸发有机相以去除乙酸乙酯。通过在65℃下溶解并缓慢冷却至-20℃，使粗产物在乙酸乙酯中进行结晶。通过过滤取出晶体，并蒸发母液并再次结晶。将收集的晶体在真空下干燥12h，用于另外的手性hplc和nmr分析。
[0244]
(r)-ma
[0245]1h nmr谱(400mhz,cd3od),δ7.47(dd,j＝15.1,7.2hz,2h),7.31(ddd,j＝10.7,9.0,5.1hz,3h),5.19(s,1h).
13
c nmr谱(101mhz,cd3od),δ176.27,140.75,129.53,129.33,127.96,74.21。
[0246]
结果与讨论
[0247]
在大肠杆菌(p2s2a)细胞的两相体系中进行了l-phe至(r)-ma的制备型生物转化，
其在24h内产生6mm(r)-ma，转化率为60％。纯化后，以46％的分离产率获得纯产物。1h和
13
c nmr分析确认了(r)-ma产物的化学结构。手性hplc分析示出所产生的(r)-ma的ee＞99％(图12)。

技术特征：
1.一种用于使用经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞来生产对映体纯的或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的方法，所述方法包括使苯乙烯或其衍生物在一锅反应体系中进行多种酶催化的化学转化，任选地，其中，至少一种过表达的酶位于一个或多个质粒上或者整合在所述一种或多种重组微生物细胞中的每一种的染色体中。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法生产对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物，包括以下步骤：(a)通过进行由环氧化酶催化的环氧化反应形成氧化苯乙烯或其衍生物，并在所述环氧化物上进行由环氧化物水解酶催化的水解反应，或通过由双加氧酶催化的二羟基化反应来由苯乙烯或其衍生物生成对映体纯或对映体富集的苯乙二醇或其衍生物；和(b)通过使用氧化酶将苯乙二醇上的伯醇选择性氧化为羧酸，由对映体纯或对映体富集的苯乙二醇或其衍生物生成对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物。3.根据权利要求2所述的方法，其中：(a)所述环氧化酶是苯乙烯单加氧酶，任选地，其中，所述苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属(pseudomonas sp.)vlb120、或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶；和/或(b)当使用时，所述环氧化物水解酶来自马铃薯(solanumtuberosum)或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶；和/或(c)所述氧化酶是醇氧化酶，任选地，其中，所述醇氧化酶来自天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)，或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞中的一种(即，所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞)是大肠杆菌(e.coli)t7-pcdf-smo-steh，prsf-aldo。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过以下来提供苯乙烯或其衍生物：通过经由氨裂合酶催化的脱氨反应由l-苯丙氨酸或其衍生物生成反式肉桂酸或其衍生物，并在由脱羧酶催化的脱羧反应中由所述反式肉桂酸或其衍生物生成苯乙烯或其衍生物。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述氨裂合酶是来自拟南芥(arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨裂合酶、或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中，脱羧物是来自黑曲霉(aspergillus niger)的苯基丙烯酸脱羧酶、或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶。8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中，所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞中的一种(即，所述经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞)是大肠杆菌(e.coli)t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo。9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的细胞，所述细胞将甘油的葡萄糖转化为l-苯丙氨酸。10.根据权利要求9所述的方法，其中，由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞过表达选自由以下组成的组中的一种或多种的至少一种酶：dahp合酶(arog)、莽草酸激酶(arok)、莽草酸脱氢酶(ydib)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(phea)和酪氨酸氨基转移酶(tyrb)、或其突变体或具有超过50％同一性的相似酶，任选地，其中，由葡萄糖或甘油产生
l-苯丙氨酸的微生物细胞过表达至少一种酶是：(a)arog的反馈抑制抗性突变体；(b)phea的反馈抑制抗性突变体。11.根据权利要求10所述的方法，其中，由葡萄糖或甘油产生l-苯丙氨酸的微生物细胞过表达至少一种酶，其中，所述微生物细胞突变为缺失或失活crr和/或tyra基因。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，过表达天然l-苯丙氨酸生物合成途径的微生物细胞是大肠杆菌nst74-pcdf-phe、pet-pal-pad、pacyc-smo-steh、prsf-aldo，其用于由葡萄糖或甘油产生(r)-扁桃酸。13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，过表达所述天然l-苯丙氨酸生物合成途径的微生物细胞是大肠杆菌nst74-phe，其与大肠杆菌t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo组合以由葡萄糖或甘油提供(r)-扁桃酸。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一锅反应体系包括使用水性介质。15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用双相介质，任选地，其中，所述双相介质由以下组成：水性和固体树脂介质或者水性和有机溶剂介质(例如，有机溶剂介质选自一种或多种烷烃溶剂和/或一种或多种酯溶剂)。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一锅反应体系包括使用吸收树脂或纳米材料来原位移出产物。17.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码至少一种异源催化酶，所述异源催化酶选自包括以下的组：(a)用于进行环氧化反应以由苯乙烯或其衍生物形成氧化苯乙烯或其衍生物的环氧化酶和用于在所述环氧化物上进行水解反应以提供苯乙二醇或其衍生物的环氧化物水解酶，或者通过二羟基化反应由苯乙烯或其衍生物生成苯乙二醇或其衍生物的加氧酶；(c)用于通过苯乙二醇或其衍生物上伯醇的选择性氧化生成对映体纯或对映体富集的(r)-扁桃酸或其衍生物的氧化酶；或者(d)用于通过脱氨反应由l-苯丙氨酸或其衍生物生成反式肉桂酸或其衍生物的氨裂合酶；以及(e)用于在脱羧反应中由反式肉桂酸或其衍生物生成苯乙烯或其衍生物的脱羧酶。18.根据权利要求17所述的分离的核酸，所述分离的核酸编码多种所述催化酶。19.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述多种催化酶被布置为选自包括以下的组的至少一个模块：i)包括在表达时将苯乙烯或其衍生物酶促转化为苯乙二醇或其衍生物的异源核酸序列的模块；ii)包括在表达时将苯乙二醇或其衍生物酶促转化为(r)-扁桃酸或其衍生物的异源核酸序列的模块；以及iii)包括在表达时将l-苯丙氨酸或其衍生物酶促转化为苯乙烯或其衍生物的异源核酸序列的模块；或其任意组合。20.一种表达构建体，包括至少一种根据权利要求17至19中任一项所述的核酸分子。
21.一种或多种重组原核细胞或真核细胞，选自包括以下的组：细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，其中，所述细胞包括至少一种根据权利要求20中所述的表达构建体。22.根据权利要求21所述的一种或多种重组原核细胞或真核细胞，其中，所述细胞是重组细菌细胞。23.根据权利要求21或权利要求22所述的一种或多种重组原核细胞或真核细胞，其中，所述酶与选自包括以下的组的至少一种酶具有至少50％的氨基酸同一性：(a)来自假单胞菌属(pseudomonas sp.)vlb120的苯乙烯单加氧酶；(b)来自马铃薯(solanum tuberosum)的环氧化物水解酶；(c)来自天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)的醇氧化酶；(d)来自拟南芥(arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨裂合酶；(e)来自黑曲霉(aspergillus niger)的苯基丙烯酸脱羧酶。24.根据权利要求23所述的一种或多种重组细胞，其中所述细胞选自：(a)大肠杆菌(e.coli)t7-pcdf-smo-steh、prsf-aldo；(b)大肠杆菌(e.coli)t7-pet-pal-pad、pcdf-smo-steh、prsf-aldo；以及(c)大肠杆菌(e.coli)nst74-pcdf-phe、pet-pal-pad、pacyc-smo-steh、prsf-aldo。25.一种试剂盒，包括至少一种根据权利要求17至19中任一项所述的分离的核酸。

技术总结
本发明涉及一种用于使用经基因工程化为过表达多种酶的一种或多种重组微生物细胞来生产对映体纯的或对映体富集的(R)-扁桃酸或其衍生物的方法，该方法包括使苯乙烯或其衍生物在一锅反应体系中进行多种酶催化的化学转化，任选地，其中，至少一种过表达的酶位于一个或多个质粒上或者整合在一种或多种重组微生物细胞中的每一种的染色体中。在特定的实施方式中，对一种或多种重组微生物细胞进行基因工程化以过表达多种酶，包括环氧化酶、环氧化物水解酶、加氧酶、氧化酶、氨裂合酶和脱羧酶。氨裂合酶和脱羧酶。氨裂合酶和脱羧酶。


技术研发人员：李智 本尼迪克特
受保护的技术使用者：新加坡国立大学
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2023/10/8