结合偏肺病毒F蛋白的抗体及其用途的制作方法

结合偏肺病毒f蛋白的抗体及其用途
1.本发明涉及抗偏肺病毒(mpv)的抗体领域，尤其涉及结合融合前构象的偏肺病毒(mpv)的f蛋白(融合蛋白)的抗体。本发明还涉及这种抗体的用途，例如在中和mpv感染的方法中，在检测mpv抗原的方法中或在测试mpv疫苗的方法中的用途。
2.人类偏肺病毒(hmpv)于2001年首次分离，是儿童和老年人毛细支气管炎和肺炎的常见原因。mpv还会引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，这种感染可能在任何年龄发生，尤其是在老年人中发生或在心脏、肺或免疫系统受损的人中发生。mpv与住院和门诊儿童中5％至40％的呼吸道感染有关。mpv感染是高危早产儿、早产儿慢性肺病、充血性心脏病和免疫缺陷的重要疾病负担(martino等人，2005，biology of blood and marrow transplantation：journal of the american society for blood and marrow transplantation 11：781-796)。
3.mpv属于肺炎病毒亚科和副粘病毒科的偏肺病毒属，是有包膜的非节段性负链rna病毒。mpv的基因结构与呼吸道合胞病毒(rsv)相似，尽管mpv缺乏rsv中发现的非结构基因ns1和ns2。rsv和mpv包膜包含三种病毒编码的跨膜表面糖蛋白：主要附着蛋白g、融合蛋白f和小的疏水性sh蛋白。
4.mpv f蛋白通过病毒颗粒包膜和宿主细胞质膜之间的融合来指导病毒穿透。首先，mpv f蛋白被表达为多肽前体(“f
0”)。f-蛋白前体f0在保守的切割位点被蛋白水解加工，产生f1和f2多肽。成熟的三聚体f蛋白由f
2-f1异二聚体的三个原聚体组装而成，采用亚稳态融合前构象。f亚单位的n-末端由蛋白水解切割产生，包含氨基酸的疏水延伸，称为融合肽，可以直接插入靶膜以启动融合。在与靶细胞结合并随后活化后，亚稳态融合前f蛋白经历一系列结构重排，导致病毒和靶细胞膜融合并形成稳定的融合后f蛋白。
5.mpv f蛋白是抗mpv中和抗体的主要靶标，也是疫苗开发的主题。然而，尽管鉴定了有效中和的抗体，如mpe8(corti等人，2013，cross-neutralization of four paramyxoviruses by a human monoclonal antibody.nature 501：439-443)，但仍需要对mpv融合前f蛋白表现出增强亲和力的抗体，以提供有效的mpv中和作用，用于检测mpv抗原，例如在诊断中，以及用于开发针对mpv的疫苗。
6.鉴于上述情况，本发明的目的是克服现有技术的缺点特别地，本发明的目的是提供以高结合亲和力结合mpv的融合前f蛋白的抗体。本发明的另一个目的是提供有效中和mpv感染的抗体。
7.这个目的是通过下面和所附权利要求书中提出的主题来实现的。
8.尽管下面详细描述了本发明，但应理解的是，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
9.在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，但应该理解的是，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方案。各种描述的实施例和实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并
涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本技术的描述中公开了本技术中所有所描述要素的任何排列和组合。
10.在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则术语“包括”以及诸如“含有”和“包含”的变体将被理解为暗示包括所陈述的成员、整数或步骤，但不排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。术语“由
…
组成”是术语“包括”的特定实施方案，其中排除了任何其他未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包括”涵盖术语“由
……
组成”。因此，术语“包括”涵盖“包含”以及“由
……
组成”例如，“包括”x的组合物可以仅由x组成、或可以包含括其他内容，例如x+y。
11.在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)术语前不使用数量词限定应被解释为涵盖单数和复数，除非本文中另有说明或者与上下文明显矛盾。本文中对数值范围的引用仅旨在用作单独提到落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。说明书中的任何语言都不应解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
12.词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上没有”y的组合物可以完全没有y。必要时，可以从本发明的限定中省略词语“基本上”。
13.与数值x有关的术语“约”是指x
±
10％，例如x
±
5％，或x
±
7％，或x
±
10％，或x
±
12％，或x
±
15％，或x
±
20％。
14.本文所用的术语“疾病”意在通常与术语“病症”和“病况”(如在医学状况中)同义，并可互换使用，因为所有这些都反映了人类或动物身体或其一个部分的损害正常功能的异常状况，并且通常通过有区别的病征和症状来表现，并导致人类或动物生存期限缩短或生活质量降低。
15.如本文所用，对对象或患者的“治疗”是指包括防治、预防、减毒、改善和治疗。术语“对象”或“患者”在本文可互换使用，以表示包括人类在内的所有哺乳动物。对象的例子包括人类、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一些实施方案中，患者为人类。
16.剂量通常与体重有关。因此，以[g、mg或其他单位]/kg(或g、mg等)表示的剂量通常是指[g、mg或其他单位]“每kg(或g、mg等)体重”，即使未明确提及术语“体重”。
[0017]
术语“结合”和类似的引用通常指“特异性结合”，不包括非特异性黏附。
[0018]
如本文所用，术语“抗体”涵盖各种形式的抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段(诸如抗原结合片段)、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体和基因工程抗体(变体或突变抗体)，只要保留本发明的特性即可。在一些实施方案中，抗体是人类抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。例如，抗体是人单克隆抗体。
[0019]
如上所述，术语“抗体”通常也包括抗体片段。抗体的片段可以保留抗体的抗原结合活性。这种片段被称为“抗原结合片段”。抗原结合片段包括但不限于单链抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。抗体的片段可通过以下方法从抗体获得：通过包括用酶，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的方法，和/或通过由化学反应造成的二硫键裂解。或者，抗体的片段可以通过重组手段获得，例如通过克隆和表达重链和/或轻链序列的一部分(片段)。本发明还包括来源于本发明抗体的重链和轻链的单链fv片段(scfv)。例如，本发明包括scfv，其包含来自本发明抗体的cdr。还包括重链或轻链单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结
构域轻链抗体以及单链抗体，例如单链fv，其中重链和轻链可变结构域通过肽接头连接。本发明的抗体片段可以包含在本领域技术人员已知的多种结构中。此外，本发明的序列可以是多特异性分子的组分，其中本发明的序列靶向本发明的表位，并且该分子的其他区域结合其他靶标。尽管说明书(包括权利要求书)在某些地方可以明确地指代抗原结合片段、抗体片段、抗体的变体和/或衍生物，但应理解的是，术语“抗体”包括所有类别的抗体，即抗原结合片段、抗体片段、抗体的变体和衍生物。
[0020]
人抗体在现有技术中是众所周知的(van dijk，m.a.，和van de winkel，j.g.，curr.opin.chem.biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述动物在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的人抗体库或选择的人抗体。人种系免疫球蛋白基因阵列在此类种系突变小鼠中的转移将导致抗原攻击后产生人抗体(参见例如jakobovits，a.，等人，proc.natl.acad.sci.usa 90(1993)2551-2555；jakobovits，a.，等人，nature 362(1993)255-258；bruggemann，m.，等人，year immunol.7(1993)3340)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(hoogenboom，h.r.，和winter，g.，j.mol.biol.227(1992)381-388；marks，j.d.，et al.，j.mol.biol.222(1991)581-597)。cole等人和boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(cole等人，monoclonal antibodies and cancer therapy，alan r.liss，第77页(1985)和boerner等人j.immunol.，147(1991)86-95)。在一些实施方案中，通过使用改良的ebv-b细胞永生化来制备人单克隆抗体如traggiai e，becker s，subbarao k，kolesnikova l，uematsu y，gismondo mr，murphy br，rappuoli r，lanzavecchia a.(2004)：an efficient method to make human monoclonal antibodies from memory b cells：potent neutralization of sars coronavirus.nat med.10(8)：871-5中所述的。如本文所用，术语“可变区”(轻链可变区(v
l
)，重链可变区(vh))表示直接参与抗体与抗原结合的一对轻链和重链中的每一个。
[0021]
本发明的抗体可以是任何同种型抗体(例如，iga、igg、igm，即α、γ或μ重链)。例如，抗体是igg型的。在igg同种型中，抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚类，例如igg1。本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。在一些实施方案中，抗体是igg1型，并且具有κ轻链。
[0022]
本发明的抗体可以纯化形式提供。通常，抗体将存在于基本上不含其他多肽的组合物中，例如，其中少于90％(重量)，通常少于60％，更通常少于50％的组合物由其他多肽构成。
[0023]
根据本发明的抗体可以在人和/或非人(或异源)宿主例如小鼠中具有免疫原性。例如，抗体可以具有在非人宿主中具有免疫原性但在人宿主中不具有免疫原性的独特型。用于人的本发明抗体包括不能轻易从宿主例如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等中分离的抗体，并且通常不能通过人源化或从异种小鼠中获得。
[0024]
如本文所用，“中和抗体”是可以中和，即预防、抑制、减少、阻碍或干扰病原体在宿主中引发和/或持久感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和的抗体”或“中和用抗体”在本文可互换使用。这些抗体可以根据适当的配方单独或组合用作预防剂或治疗剂，并与主动疫苗接种一起用作诊断工具或本文所述的生产工具。
[0025]
如本文所用，术语“突变”是指与参考序列例如相应的基因组序列相比，核酸序列和/或氨基酸序列的变化。突变，例如与基因组序列相比的突变，可以是例如(天然存在的)体细胞突变、自发突变、诱导突变，例如由酶、化学物质或辐射引起的诱导突变，或通过定点
诱变(用于在核酸序列和/或氨基酸序列中进行特异性和有意改变的分子生物学方法)获得的突变。因此，术语“突变”或“变异”应被理解为还包括用物理的方式进行突变，例如在核酸序列或氨基酸序列中进行突变。突变包括一个或多于一个核苷酸或氨基酸的替换、缺失和插入，以及几个连续核苷酸或氨基酸的倒位。为了实现氨基酸序列的突变，可以将突变引入编码所述氨基酸序列的核苷酸序列中，以表达(重组)突变的多肽。突变可以例如通过例如定点诱变改变编码一个氨基酸的核酸分子的密码子以产生编码不同氨基酸的密码子来实现，或通过合成序列变体来实现，例如通过知晓编码多肽的核酸分子的核苷酸序列，并且通过设计包含编码该多肽的变体的核苷酸序列的核酸分子的合成而无需突变核酸分子的一个或多于一个核苷酸。
[0026]
在本说明书的全文中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、用法说明等)均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开内容。
[0027]
应当理解的是，本发明不限于这里描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0028]
抗体及其抗原结合片段
[0029]
在第一方面，本发明提供了(分离的)抗体或其抗原结合片段，其(特异性地)结合偏肺病毒(mpv)，特别是人偏肺病毒(hmpv)的f蛋白(融合蛋白)。
[0030]
mpv f蛋白是i型跨膜表面蛋白，具有n-末端切割的信号肽和靠近c-末端的膜锚。mpv f蛋白作为无活性的f0前体合成，组装成同源三聚体，并通过切割激活。f蛋白由三个结构域(di到diii)、融合肽(fp)和三个七肽重复区(hr-a、-b和-c)组成。mpv f糖蛋白通过病毒颗粒包膜和宿主细胞质膜之间的融合来指导病毒穿透。f亚单位的n-末端由蛋白水解切割产生，包含融合肽，直接插入靶膜以启动融合。在与靶细胞结合并随后活化后，亚稳态融合前f蛋白经历一系列结构重排，导致融合肽插入靶细胞膜，随后形成稳定的螺旋束，该螺旋束在病毒和细胞膜并置时形成。这些结构的改变导致了稳定的融合后f蛋白的形成。在感染后期，在感染细胞的细胞表面表达的f蛋白可以介导与邻近的未感染细胞融合，形成大的合胞体。
[0031]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合mpv，特别是人偏肺病毒(hmpv)的融合前f蛋白。
[0032]
融合前f蛋白是阻止病毒进入的相关构象。因此，识别mpv f蛋白融合前构象的抗体在中和中特别有效。
[0033]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段对融合前f蛋白的结合亲和力高于对融合后f蛋白的结合亲和力。因此，抗体或其抗原结合片段可以对融合前f蛋白(相对于融合后f蛋白)具有选择性。对可作为诱饵的大量融合后f蛋白的识别消耗了抗体，从而降低了抗体效力，这优选被降低或避免。
[0034]
更具体地说，50％抗体结合mpv融合后f蛋白所需的抗体或其抗原结合片段的浓度是50％抗体结合mpv融合前f蛋白所需的浓度的至少100倍。
[0035]
评估根据本发明的抗体或其抗原结合片段的结合的标准方法是本领域技术人员已知的，包括例如elisa(酶联免疫吸附测定)。因此，可以通过测量达到50％在饱和时的最大结合所需的抗体浓度(ec
50
)来确定抗体结合的相对亲和力。
[0036]
示例性标准elisa可以按以下方式进行：可以用足够量(例如1μg/ml)的待测试抗体结合的蛋白质/复合物/颗粒(例如融合前或融合后构象的mpv f蛋白)包被elisa板。然后可以将板与待测试的抗体一起孵育。洗涤后，可显示抗体结合，例如使用识别测试抗体的标记抗体，如偶联至碱性磷酸酶的山羊抗人igg。然后可以洗涤板，可以添加所需的底物(例如，p-npp)，并且可以例如在405nm读取板。可以通过测量达到50％在饱和时的最大结合所需的mab浓度(ec
50
)来确定抗体结合的相对亲和力。ec
50
值可以通过用具有可变斜率的四参数非线性回归拟合的结合曲线的插值来计算。
[0037]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段中和mpv，特别是hmpv的感染。本发明的抗体和抗原结合片段可能具有高中和效力。50％中和mpv所需的本发明抗体的浓度为例如约500ng/ml或低于500ng/ml。在某些实施方案中，50％中和mpv所需的本发明抗体的浓度为约500ng/ml、450ng/ml、400ng/ml、350ng/ml、300ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、175ng/ml、150ng/ml、125ng/ml或约100ng/ml或低于ng/ml。这意味着mpv的50％中和仅需低浓度的抗体。特异性和效力可以使用本领域技术人员已知的标准试验来测量。
[0038]
例如，为了在实验室中研究和定量中和，本领域技术人员知晓各种标准的“中和测定”。对于中和试验，病毒(待中和)通常在细胞和/或细胞系中繁殖。例如，在中和试验中，在待测抗体存在(或不存在)的情况下，培养的细胞可以与固定量的mpv(hmpv)一起孵育。作为针对实例的读值，例如可以使用流式细胞仪。可选地，也可以想到其他读值。
[0039]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合mpv亚组a1、a2、b1和b2的f蛋白，即mpv的所有四个亚组。因此，抗体或其抗原结合片段可以中和mpv亚组a1、a2、b1和b2的感染，即mpv的所有四个亚组。mpv的g蛋白和f蛋白的氨基酸序列被分为a组和b组，并进一步分成4个亚组：a1、a2、b1和b2。如所附实例所示，本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合mpv的所有四个亚群：a1、a2、b1和b2。此外，在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段有效中和mpv的所有四个亚群：a1、a2、b1和b2。
[0040]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合与mpe8相同(或重叠)的表位(例如，corti等人，2013，cross-neutralization of four paramyxoviruses by a human monoclonal antibody.nature 501：439-443中所述，该文献通过引用并入本文)。据描述，mpe8与rsv(和可能的mpv)f胞外结构域中部附近的表位结合，该表位位于f三聚体的两个亚单位的di、dii和diii结构域的交叉处(也称为“抗原位点iii”)。
[0041]
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合与mpv f蛋白上的mpe8表位不同(且不重叠)的表位(即，与抗原位点iii不同)。
[0042]
一般而言，根据本发明，抗体或其抗原结合片段可包含重链上的(至少)三个互补决定区(cdr)和轻链上的(至少)三个cdr。通常，互补决定区(cdr)是存在于重链可变域和轻链可变域中的高变区。通常，抗体的重链的cdr和所连接轻链一起形成抗原受体。通常，三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)在可变域中非连续排列。由于抗原受体通常由两个可变结构域组成(在两个不同的多肽链上，即重链和轻链：重链可变区(vh)和轻链可变区(vl))，每个抗原受体通常有六个cdr(重链：cdrh1、cdrh2和cdrh3；轻链：cdrl1、cdrl2和cdrl3)。例如，典型的
igg抗体分子通常具有两个抗原受体，因此包含十二个cdr。重链和/或轻链上的cdr可以通过框架区分开，其中框架区(fr)是可变域中比cdr“可变性”小的区域。例如，可变区(或每个可变区)分别由被三个cdr隔开的四个框架区域构成。
[0043]
确定了本发明的示例性抗体的重链和轻链的序列，包括重链上的三个不同的cdr和轻链上的三个不同的cdr。cdr氨基酸的位置根据imgt编号系统确定(imgt：http：//www.imgt.org/；cf.lefranc，m.-p.等人(2009)nucleic acids res.37，d1006-d1012)。
[0044]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0045]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、sfq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0046]
如本说明书通篇所用，通常根据参考序列(即本技术中所述的序列)的全长来计算序列同一性。如本文所指，百分比同一性可以通过例如本领域已知的方法来确定，例如使用blast使用由ncbi(美国国家生物技术信息中心；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数来确定[blosum 62矩阵；空位开放罚分为11，空位延伸罚分为1]。
[0047]“序列变体”具有改变的序列，其中将参考序列中的一个或多于一个氨基酸被缺失或替换，和/或将一个或多于一个氨基酸插入参考氨基酸序列的序列中。作为改变的结果，氨基酸序列变体具有与参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。具有至少70％同一性的变体序列对参考序列的每100个氨基酸具有不超过30个改变，即缺失、插入或替换的任意组合。在“序列变体”中，可以保持参考序列的功能性(例如，在本例中结合mpv的f蛋白)。
[0048]
一般来说，虽然可能存在非保守氨基酸替换，但这些替换通常是保守氨基酸替换，其中替换的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸具有相似的结构或化学性质。举例来说，保守的氨基酸替换涉及用其他氨基酸替换一种脂肪族或疏水性氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；用其他氨基酸替换一种含羟基的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸；用其他氨基酸替换一种酸性残基例如谷氨酸或天冬氨酸；用其他氨基酸替换一种含酰胺的残基例如天冬酰胺和谷氨酰胺；用其他氨基酸替换一种芳香族残基例如苯丙氨酸和酪氨酸；用其他氨基酸替换一种碱性残基例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并用其他氨基酸替换一种小氨基酸例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和甘氨酸。
[0049]
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或多于一百个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括氨基酸序列的n-或c-末端与报告分子或酶的融合。
[0050]
本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：1和seq id no：18氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0051]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：
[0052]-与seq id no：1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr1序列；
[0053]-与seq id no：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr2序列；
[0054]-与seq id no：3的氨基酸序列具有至少85％或90％序列同一性的重链cdr3序列；
[0055]-与seq id no：4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr1序列；
[0056]-与seq id no：5或6的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr2序列；和
[0057]-与seq id no：7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr3序列。
[0058]
更具体地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0059]-根据seq id no：1的重链cdr1序列；
[0060]-根据seq id no：2的重链cdr2序列；
[0061]-与seq id no：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链cdr3序列；
[0062]-根据seq id no：4的轻链cdr1序列；
[0063]-根据seq id no：5或6的轻链cdr2序列；以及
[0064]-根据seq id no：7的轻链cdr3序列。
[0065]
在一些实施方案中，seq id no：3中的c-末端asp(d)残基被替换。更具体地，seq id no：3中的c-末端asp残基可以被另一种极性氨基酸替换。极性氨基酸的实例包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。例如，seq id no：3中的c-末端天冬氨酸残基可以被组氨酸残基替换。因此，抗体或其抗原结合片段可以包含根据seq id no：3或10的重链cdr3序列。
[0066]
因此，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0067]-根据seq id no：1的重链cdr1序列；
[0068]-根据seq id no：2的重链cdr2序列；
[0069]-根据seq id no：3的重链cdr3序列；
[0070]-根据seq id no：4的轻链cdr1序列；
[0071]-根据seq id no：5或6的轻链cdr2序列；以及
[0072]-根据seq id no：7的轻链cdr3序列。
[0073]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0074]-根据seq id no：1的重链cdr1序列；
[0075]-根据seq id no：2的重链cdr2序列；
[0076]-根据seq id no：10的重链cdr3序列；
[0077]-根据seq id no：4的轻链cdr1序列；
[0078]-根据seq id no：5或6的轻链cdr2序列；以及
[0079]-根据seq id no：7的轻链cdr3序列。
[0080]
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：
[0081]-与seq id no：12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1序列；
[0082]-与seq id no：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr2序列；
[0083]-与seq id no：14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr3序列；
[0084]-与seq id no：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr1序列；
[0085]-与seq id no：16或17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr2序列；和
[0086]-与seq id no：18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链cdr3序列。
[0087]
更具体地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0088]-与seq id no：12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1序列；
[0089]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0090]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0091]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0092]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及
[0093]-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0094]
在一些实施方案中，重链可变区氨基酸残基n34、s36和c38(分别对应于seq id no：12中的n6、s8和c10)中的一个或多于一个被替换。更具体地，
[0095]-n34(对应于seq id no：12中的n6)可以被另一种极性氨基酸替换，例如gln(q)或ser(s)；
[0096]-s36(对应于seq id no：12中的s8)可以被另一种小氨基酸替换，例如ala(a)；和/或
[0097]-c38(对应于seq id no：12中的c10)可以被任何氨基酸替换，例如ser(s)、ala(a)或tyr(y)。
[0098]
极性氨基酸的实例包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。小氨基酸的实例包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，其中丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸是特别小的。
[0099]
抗体或其抗原结合片段的重链cdr1序列可以与seq id no：12有多达三个氨基酸的不同，特别是如上所述。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的重链cdr1序列在单个氨基酸替换上不同于seq id no：12，这可选自n34、s36和c38，如上所述。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段的重链cdr1序列在(确切地)两个氨基酸替换上不同于seq id no：12，这可选自如上所述的n34/s36、n34/c38和s36/c38，例如n34/c38处的氨基酸残基可如上所述被替换。
[0100]
例如，抗体或其抗原结合片段可以包含根据seq id no 12、21、23、25、27、29、31和33中任何一个的重链cdr1序列。
[0101]
因此，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0102]-根据seq id no：12的重链cdr1序列；
[0103]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0104]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0105]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0106]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及
[0107]-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0108]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0109]-根据seq id no：21的重链cdr1序列；
[0110]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0111]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0112]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0113]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0114]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0115]-根据seq id no：23的重链cdr1序列；
[0116]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0117]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0118]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0119]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序
列。
[0120]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0121]-根据seq id no：25的重链cdr1序列；
[0122]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0123]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0124]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0125]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0126]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0127]-根据seq id no：27的重链cdr1序列；
[0128]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0129]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0130]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0131]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0132]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0133]-根据seq id no：29的重链cdr1序列；
[0134]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0135]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0136]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0137]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及
[0138]-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0139]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0140]-根据seq id no：31的重链cdr1序列；
[0141]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0142]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0143]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0144]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及
[0145]-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0146]
可选地，抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0147]-根据seq id no：33的重链cdr1序列；
[0148]-根据seq id no：13的重链cdr2序列；
[0149]-根据seq id no：14的重链cdr3序列；
[0150]-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；
[0151]-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及
[0152]-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。
[0153]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8有70％或多于70％(例如，71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区(vh)和含有与seq id no：9有70％或多于70％(例如，71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区(vl)。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3或10中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：4、seq id no：5或6和seq id no：7中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0154]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：19有70％或多于70％(例如，71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20有70％或多于70％(例如，71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33，seq id no：13和seq id no：14中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：15、seq id no：16或17和seq id no：20中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0155]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8有75％或多于75％(例如，76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与seq id no：9有75％或多于75％(例如，76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3或10中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：4、seq id no：5或6和seq id no：7中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0156]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：19有75％或多于75％(例如，76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20有75％或多于75％(例如，76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33，seq id no：13和seq id no：14中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：15、seq id no：16或17和seq id no：20中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0157]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8有80％或多于80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9有80％或多于80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3或10中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：4、seq id no：5或6和seq id no：7中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0158]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：19有80％或多于80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20有80％或多于80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33，seq id no：13和seq id no：14中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：15、seq id no：16或17和seq id no：20中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0159]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8有85％或多于85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9有85％或多于85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3或10中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：4、seq id no：5或6和seq id no：7中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0160]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：19有85％或多于85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20有85％或多于85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33，seq id no：13和seq id no：14中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：15、seq id no：16或17和seq id no：20中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0161]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8有90％或多于90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9有90％或多于90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3或10中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：4、seq id no：5或6和seq id no：7中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0162]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：19有90％或多于90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20有90％或多于90％(例如，
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33，seq id no：13和seq id no：14中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：15、seq id no：16或17和seq id no：20中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0163]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)包含与seq id no：8有95％或多于95％(例如、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与seq id no：9有95％或多于95％(例如、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上定义的cdr序列(分别在seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3或10中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：4、seq id no：5或6和seq id no：7中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0164]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：19有95％或多于95％(例如、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20有95％或多于95％(例如、96％、97％、98％、99％或多于99％)同一性的氨基酸序列的轻链可变区。因此，如上限定的cdr序列(分别在seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33，seq id no：13和seq id no：14中列出的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；以及分别在seq id no：15、seq id no：16或17和seq id no：20中列出的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)可以被保留。
[0165]
更具体地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：8所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：9所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0166]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：11所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：9所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0167]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：19所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0168]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：22所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0169]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：24所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0170]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：26所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0171]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：28所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0172]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：30所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0173]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：32所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0174]
可选地，抗体或其抗原结合片段可包含含有seq id no：34所示氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no：20所示氨基酸序列的轻链可变区。
[0175]
本发明的示例性抗体，即抗体mpf5_vh117d(mpf5)和mpf5_vh117h、mpe33、mpe33_s36a、mpe33_n34q、mpe33_n34s、mpe33_c38s、mpe33_c38a、mpe33_c38y和mpe33_n34s_c38y
的cdr和vh/vl序列显示在下表1中。
[0176][0177]
表1：本发明示例性抗体的cdr和vh/vl序列(seq id no)。
[0178]
在一些实施方案中，本发明的抗体是人抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。例如，本发明的抗体可以是人单克隆抗体。
[0179]
本发明的抗体可以是任何同种型抗体(例如，iga、igg、igm，即α、γ或μ重链)。例如，抗体可以是igg型的。在igg同种型中，抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚类，例如igg1。本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。在一些实施方案中，抗体是igg1型，并且具有λ或κ轻链。
[0180]
在一些实施方案中，抗体是人igg1型。抗体可以是任何同种异型。术语“同种异型”是指在igg亚类中发现的等位基因变异。例如，抗体可以是g1m1(或g1m(a))同种异型、g1m2(或g1m(x))同种异型、g1m3(或g1m(f))同种异型和/或g1m17(或gm(z))同种异型。g1m3和g1m17同种异型位于ch1结构域的相同位置(根据eu编号的位置214)。g1m3对应r214(eu)，而g1m17对应k214(eu)。g1m1同种异型位于ch3结构域(在位置356和358(eu))并指替换e356d和m358l。g1m2同种异型指431位(eu)的丙氨酸被甘氨酸替换。g1m1同种异型可以与例如g1m3或g1m17同种异型组合。在一些实施方案中，抗体是没有g1m1的同种异型g1m3(g1m3，-1)。在一些实施方案中，抗体是g1m17，1同种异型。在一些实施方案中，抗体是g1m3，1同种异型。在一些实施方案中，抗体是没有g1m1的同种异型g1m17(g1m17，-1)。任选地，这些同种异型可以与g1m2、g1m27或g1m28同种异型组合(或不组合)。例如，抗体可以是g1m17，1，2同种异型。
[0181]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含fc部分。fc部分可以来源于人源，例如来源于人igg1、igg2、igg3和/或igg4，如人igg1。
[0182]
如本文所用，术语“fc部分”指衍生自免疫球蛋白重链部分的序列，该序列始于木瓜蛋白酶切割位点正上游的铰链区(例如，天然igg中的残基216，重链恒定区的第一个残基为114)，终止于免疫球蛋白重链的c端。因此，fc部分可以是完整的fc部分或其一部分(例如结构域)。完整的fc部分包含至少一个铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域(例如，eu氨基酸第216至446位)。附加的赖氨酸残基(k)有时会出现在fc部分的末端c末端，但通常会从成熟抗体上切割下来。
[0183]
本文对fc部分内的每个氨基酸位置已经根据本领域公认的kabat eu编号系统进行编号，参见例如kabat等人的“sequences of proteins of immunological interest”，u.s.dept.health and human services，1983和1987。eu指数或kabat中的eu编号或eu编号是指eu抗体的编号(edelman gm，cunningham ba，gall we，gottlieb pd，rutishauser u，waxdal mj.the covalent structure of an entire gammag immunoglobulin molecule.proc natl acad sci u s a.1969；63(1)：78-85；kabat e.a.，national institutes of health(u.s.)office of the director，“sequences of proteins of immunological interest”，5
th
edition，bethesda，md：u.s.dept.of health and human services，public health service，national institutes of health，1991，其通过引用整体并入本文)。
[0184]
在一些实施方案中，在本发明的上下文中，fc部分包含以下至少之一：铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域或其变体、部分或片段。fc部分可以包含至少一个铰链结构域、ch2结构域或ch3结构域。fc部分可以是完整的fc部分。相对于天然存在的fc部分，fc部分还可包含一个或多于一个氨基酸插入、缺失或替换。例如，可以缺失铰链结构域、ch2结构域或ch3结构域(或其一部分)中的至少一个。例如，fc部分可包含或组成为：(i)与ch2结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其一部分)、(ii)与ch3结构域(或其一部分)融合的铰链结构域(或其一部分)、(iii)与ch3结构域(或其一部分)融合的ch2结构域(或其一部分)、(iv)铰链结构域(或其一部分)、(v)ch2结构域(或其一部分)或(vi)ch3结构域或其一部分。
[0185]
本领域普通技术人员将理解，可以修饰fc部分，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的完整fc部分不同，同时保留天然存在的fc部分赋予的至少一种所需功能。这样的功能包括fc受体(fcr)结合、抗体半衰期调节、adcc功能、蛋白a结合、蛋白g结合和补体结合。对这种功能负责和/或必需的天然存在的fc部分的一部分是本领域技术人员众所周知的。
[0186]
例如，为了激活补体级联，c1q与至少两个igg1分子或一个igm分子结合，附着于抗原靶位(ward，e.s.，和ghetie，v.，ther.immunol.2(1995)77-94).burton，d.r.，描述了(mol.immunol.22(1985)161-206)，即包含氨基酸残基318至337的重链区域，参与补体固定。duncan，a.r.和winter，g.(nature 332(1988)738-740)使用定点诱变，报道了glu318、lys320和lys322形成c1q的结合位点。glu318、lys320和lys322残基在c1q结合中的作用被含有这些残基的短合成肽抑制补体介导的裂解的能力所证实。
[0187]
例如，fcr结合可以通过(抗体的)fc部分与fc受体(fcr)的相互作用来介导，所述fc受体是造血细胞上的特化细胞表面受体。fc受体属于免疫球蛋白超家族，并显示通过免疫复合物的吞噬作用介导抗体包被病原体的去除，以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性来介导红细胞和由相应抗体包被的各种其他细胞靶标(例如肿瘤细胞)的裂解(adcc；van de winkel，j.g.，和anderson，c.l.，j.leukoc.biol.49(1991)511-524)。fcr通过其对免疫球蛋白类别的特异性来限定；igg抗体的fc受体称为fcγr、ige的称为fcεr、iga的称为fcαr，依此类推，新生fc受体称为fern。fc受体结合描述于例如ravetch，j.v.，和kinet，j.p.，annu.rev.immunol.9(1991)457-492；capel，p.j.，等人，immunomethods 4(1994)25-34；de haas，m.，等人，j lab.clin.med.126(1995)330-341；和gessner，j.e.，等人，
ann.hematol.76(1998)231-248。
[0188]
受体通过天然igg抗体(fcγr)的fc结构域交联，触发了多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。因此，fc部分可以提供受体(fcγr)的交联。在人类中，已鉴定出三类fcγr，它们是：(i)fcγri(cd64)，其以高亲和力结合单体igg，并在巨噬细胞，单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达；(ii)fcγrii(cd32)，其以中等或低亲和力结合复合igg，并且已广泛表达，特别是在白细胞上表达，并且已知是抗体介导的免疫中的核心角色，可分为fcγriia，fcγriib和fcγriic它们在免疫系统中发挥不同的功能，但具有与igg-fc的结合相似的低亲和力，这些受体的胞外结构域高度同源；(iii)fcγriii(cd16)，其以中等至低亲和力结合igg，并分为两种类型：fcγriiia存在于nk细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和t细胞上，并介导adcc，和在嗜中性粒细胞上高度表达的fcγriiib。在参与杀伤的许多细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)中发现了fcγriia，并且似乎能够激活杀伤过程。fcγriib似乎在抑制过程中起作用，并在b细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中发现。重要的是，在肝脏中发现了所有fcγriib的75％(ganesan，l.p.等人，2012：fcγriib on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes.journal of immunology 189：4981-4988)。fcγriib在称为lsec的肝窦内皮细胞上，和在肝中的库普弗细胞上大量表达并且lsec是小免疫复合物清除的主要位点(ganesan，l p.等人，2012：fcγriib on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes.journal of immunology 189：4981-4988)。
[0189]
因此，本发明的抗体及其抗原结合片段或许能够结合fcγriib，例如包含用于结合fcγriib的fc部分，特别是fc区的抗体，例如igg型抗体。此外，可以通过引入突变s267e和l328f来工程改造fc部分以增强fcγriib结合，如chu，s.y.等人，2008：inhibition of b cell receptor-mediated activation of primary human b cells by coengagement of cd19 and fcγriib with fc-engineered antibodies.molecular immunology 45，3926-3933所述的。从而可以提高免疫复合物的清除(chu，s.，等人，2014：accelerated clearance of ige in chimpanzees is mediated by xmab7195，an fc-engineered antibody with enhanced affinity for inhibitory receptor fcγriib.am j respir crit，american thoracic society international conference abstracts)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段，可以包含具有突变s267e和l328f的工程化fc部分，特别是如s.y.等人，2008：inhibition of b cell receptor-mediated activation of primary human b cells by coengagement of cd19 and fcγriib with fc-engineered antibodies.molecular immunology 45，3926-3933中所述的。
[0190]
在b细胞上，似乎可以起到抑制其他免疫球蛋白产生和同种型转换例如说ige类的作用。在巨噬细胞上，fcγriib通过fcγriia抑制吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞中，b形式可通过ige与其独立受体的结合来帮助抑制这些细胞的活化。
[0191]
关于fcγri结合，e233-g236、p238、d265、n297、a327和p329中的至少一种在天然igg中的修饰降低了与fcγri的结合。igg2位于第233至236位的残基替换至igg1和igg4中，将与fcγri的结合降低至103分之一，并消除了人单核细胞对抗体致敏的红细胞的反应(armour，k.l.，et al.eur.j.immunol.29(1999)2613-2624)。关于fcγrii结合，发现例如
e233至g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、r292和k414中至少一种的igg突变减少了对fcγriia的结合。关于fcγriii结合，发现例如e233-g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、s239、e269、e293、y296、v303、a327、k338和d376中的至少一种突变减少了与fcγriiia的结合。对人igg1上与fc受体的结合位点进行作图，上述突变位点和测量与fcγri和fcγriia结合的方法在shields，r.l.，等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604中有所描述。例如，单突变(s239d或i332e)、双突变(s239d/i332e)和三突变(s239d/i332e/a330l)提高了对人fcγriiia的亲和力。此外，突变g236a到s239d/i332e的添加不仅提高了fcγriia：fcγriib比率，而且增强了与fcγriiia的结合。因此，突变g236a/s239d/a330l/i332e被描述为增强fcγriia和fcγriiia的接合。
[0192]
关于与关键的fcγrii的结合，天然igg fc的两个区域似乎对fcγrii和igg的相互作用至关重要，即(i)igg fc的下部铰链位点，特别是氨基酸残基l、l、g、g(234至237，eu编号)，和(ii)igg fc的ch2结构域的相邻区域，特别是与例如在p331的区域的下部铰链区域相邻的上部ch2结构域中的环和链(wines，b.d.，等人，j.immunol.2000；164：5313-5318)。此外，fcγri似乎与igg fc上的相同位点结合，而fcrn和蛋白a结合于igg fc上的不同位点，似乎位于ch2-ch3界面(wines，b.d.，等人，j.immunol.2000；164：5313-5318)。
[0193]
例如，fc部分可以包含或由fc部分的至少一部分组成，该fc部分的至少一部分是本领域已知的fcrn结合或延长半衰期所需的部分。可选地或附加地，本发明抗体的fc部分包含本领域已知的蛋白质a结合所需的至少一部分和/或本发明抗体的fc部分包含本领域已知的蛋白质g结合所需的fc分子的至少一部分。fc部分可以包含本领域已知的fcγr结合所需的至少一部分。如上所述，fc部分可因此至少包含(i)天然igg fc的下部铰链位点，尤其是氨基酸残基l、l、g、g(234-237，eu编号)，和(ii)天然igg fc的ch2结构域的邻近区域，特别是上部ch2结构域中与下部铰链区相邻的环和链，例如在p331的区域中，例如在p331周围的天然igg fc的上部ch2结构域中具有至少3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的区域，例如在天然igg fc的氨基酸第320和340位之间(eu编号)。
[0194]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含fc区。如本文所用，术语“fc区”是指由抗体重链的两个或多于两个fc部分形成的免疫球蛋白的部分。例如，fc区可以是单体或“单链”fc区(即，scfc区)。单链fc区由在单个多肽链内连接的fc部分组成(例如，在单个连续核酸序列中编码)。wo 2008/143954 a2中公开了示例性的scfc区。fc区可以是二聚体。“二聚体fc区”或“dcfc”是指由两个分开的免疫球蛋白重链的fc部分形成的二聚体。二聚体fc区可以是两个相同的fc部分的同二聚体(例如，天然存在的免疫球蛋白的fc区)或两个不同的fc部分的异二聚体。
[0195]
fc区的fc部分可以是相同或不同的类和/或亚类。例如，fc部分可以衍生自igg1、igg2、igg3或igg4亚类的免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)。fc区的fc部分可以属于相同的类别和亚类。然而，fc区(或fc区的一个或多于一个fc部分)也可以是嵌合的，由此嵌合fc区可以包含衍生自不同免疫球蛋白类和/或亚类的fc部分。例如，二聚或单链fc区的至少两个fc部分可以来自不同的免疫球蛋白类和/或亚类。另外地或可替代地，嵌合fc区可包含一个或多于一个嵌合fc部分。例如，嵌合fc区或部分可包含衍生自第一亚类(例如igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的一个或多于一个部分，而fc区或部分的其余部分属于不同的亚类。例如，fc多肽的fc区或部分可以包含衍生自第一亚类免疫球蛋白(例如，igg1、igg2或
is important in antibody protection against hiv.nature 2007，449：101-104；grevys a，bern m，foss s，bratlie db，moen a，gunnarsen ks，aase a，michaelsen te，sandlie i，andersen jt：fc engineering of human igg1 for altered binding to the neonatal fc receptor affects fc effector functions.2015，194：5497-5508)或流式细胞术(perez lg，costa mr，todd ca，haynes bf，montefiori dc：utilization of immunoglobulin g fc receptors by human immunodeficiency virus type 1：a specific role for antibodies against the membrane-proximal external region of gp41.j virol 2009，83：7397-7410；piccoli l，campo i，fregni cs，rodriguez bmf，minola a，sallusto f，luisetti m，corti d，lanzavecchia a：neutralization and clearance of gm-csf by autoantibodies in pulmonary alveolar proteinosis.nat commun 2015，6：1-9)来评估抗体与fc受体的结合。
[0202]
通常，根据本发明的抗体可以被糖基化。例如，附着在重链ch2结构域上的n-连接聚糖可以影响c1q和fcr的结合，且糖基化抗体对这些受体的亲和力较低。因此，根据本发明的抗体的fc部分的ch2结构域可包含一个或多于一个突变，其中糖基化残基被非糖基化残基替换。例如，抗体的聚糖在施用后不导致人免疫原性应答。
[0203]
此外，与未经修饰的抗体相比，可以通过将(随机)氨基酸突变引入重链的ch2或ch3结构域的特定区域来修饰根据本发明的抗体，以改变它们与fcr的结合亲和力和/或其血清半衰期。此类修饰的实例包括但不限于选自重链恒定区的选自氨基酸残基第250、314和428位的至少一个氨基酸的替换。这种fc修饰的其他实例在saxena a，wu d.advances in therapeutic fc engineering-modulation of igg-associated effector functions and serum half-life.front immunol.2016；7：580中有所描述，该文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，抗体可以包含“yte”突变(m252y/s254t/t256e；eu编号)。在一些实施方案中，抗体可包含重链恒定区中的突变m428l和/或n434s(eu编号)。
[0204]
本发明的抗体还包括杂交抗体分子，其包含来自如上定义的本发明抗体的六个cdr和来自另一种抗原抗体的一个或多于一个cdr。例如，抗体可以是双特异性的。根据本发明，双特异性(或多特异性)抗体或其抗原结合片段可包含至少一种如本文所述的特异性(抗体的抗原结合位点)。在一些实施方案中，双特异性(或多特异性)抗体或其抗原结合片段结合mpv f蛋白的两个不同表位。为此，可以组合本发明的两种不同抗体的特异性，例如如下所述的抗体组合(但是可以提供具有组合特异性的双特异性或多特异性抗体，而不是“混合物”)。
[0205]
变体抗体也包括在本发明的范围内。因此，本技术中所述序列的变体也包括在本发明的范围内。这种变体包括在免疫应答过程中通过体内体细胞突变产生的天然变体，或在体外培养永生化b细胞克隆时产生的天然变体。或者，变体可能由于遗传密码的简并而产生，或者可能由于转录或翻译中的错误而产生。
[0206]
本发明的抗体可以以纯化形式提供。通常，抗体将存在于基本上不含其他多肽的组合物中，例如，其中少于90重量％，通常少于60重量％，更通常少于50重量％的组合物由其他多肽构成。
[0207]
本发明的抗体可以在非人类(或异源)宿主例如小鼠中具有免疫原性。特别地，抗体可以具有在非人类宿主中而不是人类宿主中具有免疫原性的独特位。特别地，用于人的
本发明抗体包括不能轻易从宿主例如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等中分离的抗体，并且通常不能通过人源化或从异种小鼠中获得。
[0208]
核酸
[0209]
另一方面，本发明还提供了核酸分子，其包含编码如上所述的根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
[0210]
在一些实施方案中，核酸分子包含一种或多于一种编码本发明的示例性抗体的多核苷酸(例如，如上表1所述)，或如本文所述的其序列变体(例如，具有如上所述的至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或多于99％序列同一性)
[0211]
下表2显示了编码本发明示例性抗体的cdr和vh/vl序列的示例性核酸序列。
[0212]
表2：本发明示例性抗体的示例性核酸cdr和vh/vl序列(seq id no)。
[0213][0214]
例如，核酸分子可以包含：
[0215]
(i)根据seq id no 45或54中任一项的多核苷酸；和根据seq id no 46或55中任一项的多核苷酸；或者
[0216]
(ii)根据seq id no 38或47中任一项的多核苷酸；根据seq id no 39或48中任一项的多核苷酸；根据seq id no 40或49中任一项的多核苷酸；根据seq id no 41或50中任一项的多核苷酸；根据seq id no 42、43、51或52中任一项的多核苷酸；和根据seq id no 44或53中任一项的多核苷酸。
[0217]
核酸分子和/或多核苷酸的实例包括例如重组多核苷酸、载体、寡核苷酸、rna分子例如rrna、mrna、mirna、sirna或trna，或dna分子例如cdna。核酸可能编码抗体的轻链和/或重链。换句话说，抗体的轻链和重链可以由相同的核酸分子编码(例如，以双顺反子的方式)。或者，抗体的轻链和重链可以由不同的核酸分子编码。
[0218]
由于遗传密码的丰余，本发明还包括编码相同氨基酸序列的核酸序列的序列变体。编码抗体的多核苷酸(或完整的核酸分子)可以被优化用于抗体的表达。例如，核苷酸序列的密码子优化可用于提高表达系统中生产抗体的翻译效率。此外，核酸分子可以包含异源元件(即，在自然界中不与抗体(重链或轻链)的编码序列出现在同一核酸分子上的元件)。例如，核酸分子可以包含异源启动子、异源增强子、异源utr(例如，用于获得最佳翻译/表达)、异源聚腺苷酸尾等。
[0219]
核酸分子是包含核酸组分的分子。术语核酸分子通常指dna或rna分子。它可以与术语“多核苷酸”同义使用，即核酸分子可以由编码抗体的多核苷酸组成。或者，除了编码抗体的多核苷酸之外，核酸分子还可以包含其他元件。典型地，核酸分子是包含核苷酸单体或由核苷酸单体组成的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸骨架的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸分子”还涵盖经修饰的核酸分子，例如碱基修饰、糖修饰或骨架修饰等的dna
或rna分子。
[0220]
通常，可以操纵核酸分子以插入、缺失或改变某些核酸序列。这种操作的变化包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、添加或优化转录和/或翻译调节序列等的变化。也可以改变核酸以改变编码的氨基酸。例如，在抗体的氨基酸序列中引入一个或多于一个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸替换、缺失和/或插入可能是有用的。这样的点突变可以修饰效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入氨基酸以连接共价基团(例如标记)，或可以引入标签(例如出于纯化目的)。或者，核酸序列中的突变可以是“沉默的”，即由于遗传密码的丰余而不反映在氨基酸序列中。一般地，突变可以被引入特定位点或可以被随机引入，然后进行选择(例如分子进化)。例如，编码(示例性)抗体的任何轻链或重链的一个或多于一个核酸可以被随机或定向突变，以在编码的氨基酸中引入不同的特性。此类变化可能是迭代过程的结果，其中保留了初始变化，并在其他核苷酸位置引入了新变化。此外，可以组合在独立步骤中实现的变化。
[0221]
在一些实施方案中，编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸(或(完整的)核酸分子)可以是密码子优化的。熟练的技术人员知道用于密码子优化的各种工具，例如描述于：ju xin chin，bevan kai-sheng chung，dong-yup lee，codon optimization online(cool)：a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design，bioinformatics，volume 30，issue 15，1 august 2014，pages 2210-2212；或grote a，hiller k，scheer m，munch r，nortemann b，hempel dc，jahn d，jcat：a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host.nucleic acids res.2005jul 1；33(web server issue)：w526-31；或者例如genscript的optimumgene
tm
算法(如us 2011/0081708 a1中所述)。
[0222]
例如，本发明的核酸分子可以包含seq id no 38至55中任一项所示的核酸序列；或其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列变体。
[0223]
本发明还提供了第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中第一核酸分子包含编码本发明抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸；第二个核酸分子包含编码相同抗体或其相同抗原结合片段的相应轻链的多核苷酸。关于本发明核酸分子的(一般)特征的上述描述相应地适用于组合的第一核酸分子和第二核酸分子。因此，编码抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的一个或两个多核苷酸可以是密码子优化的。例如，该组合可包含seq id no 38至55中任一项所示的核酸序列；或其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列变体。
[0224]
本发明还提供了第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中
[0225]-第一核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸，该多核苷酸包含：(a)根据seq id no 38、39和40的核苷酸序列；或(b)根据seq id no 47、48和49的核苷酸序列；和
[0226]-第二核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸，该多核苷酸包含：(c)根据seq id no 41、42(或43)和44的核苷酸序列；或(d)根据seq id no 50、51(或52)和53的核苷酸序列。
[0227]
这种组合通常编码如上所述的本发明的抗体或其抗原结合片段。同样，关于本发明核酸分子的(一般)特征的上述描述相应地适用于组合的第一核酸分子和第二核酸分子。
[0228]
载体
[0229]
包含在本发明范围内的是包含根据本发明的核酸分子的载体，例如表达载体。通常，载体包含如上所述的核酸分子。
[0230]
本发明还提供了第一载体和第二载体的组合，其中第一载体包含如上所述的第一核酸分子(用于核酸分子的组合)，第二载体包含如上所述的第二核酸分子(用于核酸分子的组合)。
[0231]
载体通常是重组核酸分子，即自然界中不存在的核酸分子。因此，载体可以包含异源元件(即，自然界不同来源的序列元件)。例如，载体可以包含多克隆位点、异源启动子、异源增强子、异源选择标记(以鉴别包含所述载体的细胞与不包含所述载体的细胞)等。在本发明的上下文中，载体适合于掺入或包含所需的核酸序列。这样的载体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。存储载体是允许方便地存储核酸分子的载体。因此，载体可以包含对应于例如根据本发明的所需抗体(的重链和/或轻链)的序列。表达载体可用于产生表达产物，例如rna如mrna或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包含转录载体的序列段的所需的序列，例如(异源)启动子序列。克隆载体通常是包含克隆位点的载体，其可用于将核酸序列纳入到载体中。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适于将核酸分子转移到细胞或生物中的载体，例如病毒载体。在本发明的上下文中，载体可以是例如rna载体或dna载体。例如，在本技术意义上的载体包括克隆位点、选择标记例如抗生素抗性因子、和适合于载体复制的序列例如复制起点。本技术上下文中的载体可以是质粒载体。
[0232]
细胞
[0233]
在另一方面，本发明还提供了表达根据本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞；和/或包含根据本发明的载体(或载体的组合)。
[0234]
这种细胞的实例包括但不限于真核细胞例如酵母细胞、动物细胞或植物细胞。这种细胞的其他实例包括但不限于原核细胞，例如大肠杆菌。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如哺乳动物细胞系。实例包括人细胞、cho细胞、hek293t细胞、per.c6细胞、ns0细胞、人肝细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
[0235]
可以用根据本发明的载体，例如用表达载体来转染细胞。术语“转染”是指将核酸分子，例如dna或rna(例如mrna)分子引入细胞，优选引入例如真核或原核细胞中。在本发明的上下文中，术语“转染”涵盖技术人员已知的用于将核酸分子引入细胞例如导入哺乳动物细胞的任何方法。这样的方法包括例如电穿孔、脂质转染例如基于阳离子脂质和/或脂质体的脂质转染、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染、或基于阳离子聚合物例如deae-葡聚糖或聚乙烯亚胺等的转染。在一些实施方案中，引入是非病毒性引入。
[0236]
此外，本发明的细胞可以用根据本发明的载体稳定或瞬时转染，例如用于表达根据本发明的抗体。在一些实施方案中，用编码根据本发明的抗体的根据本发明的载体稳定转染细胞。在其他实施方案中，用编码根据本发明的抗体的根据本发明的人载体瞬时转染细胞。
[0237]
因此，本发明还提供了重组宿主细胞，其异源表达本发明的抗体或其抗原结合片
段。例如，细胞可以是不同于抗体的另一物种(例如，表达人抗体的cho细胞)。在一些实施方案中，细胞的细胞类型在自然界中不表达(这样的)抗体。此外，宿主细胞可以赋予翻译后修饰(ptm；例如，糖基化)而不存在于其天然状态中。这种ptm可导致功能差异(例如，降低的免疫原性)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可具有翻译后修饰，其不同于天然产生的抗体(例如，人类免疫反应的抗体)。
[0238]
抗体制备
[0239]
可以通过本领域已知的任何方法来制备根据本发明的抗体。例如，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的常用方法是众所周知的(kohler，g.和milstein，c，.1975；kozbar等人1983)。在一些实施方案中，使用wo2004/076677中描述的替代ebv永生化方法。
[0240]
在一些实施方案中，使用wo 2004/076677中描述的方法，该文献通过引用并入本文。在该方法中，用ebv和多克隆b细胞激活剂转化产生本发明抗体的b细胞。可以在转化步骤中任选地添加细胞生长和分化的其他刺激物，以进一步提高效率。这些刺激物可以是细胞因子，例如il-2和il-15。一方面，在永生化步骤中加入il-2以进一步提高永生化效率，但是其使用不是必需的。然后可以使用本领域已知的方法培养使用这些方法产生的永生化b细胞，并从中分离出抗体。
[0241]
wo 2010/046775中描述了另一种实例方法。在这种方法中，将浆细胞进行有限数量的培养，或者在微孔培养板中作为单个浆细胞进行培养。可以从浆细胞培养物中分离出抗体。此外，可以使用本领域已知的方法从浆细胞培养物中提取rna并进行pcr。可以通过rt-pcr(逆转录酶pcr)扩增抗体的vh和vl区、对其进行测序并克隆到表达载体中，然后将其转染到hek293t细胞或其他宿主细胞中。表达载体中的核酸的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养以及所制备的抗体的分离可以使用本领域技术人员已知的任何方法来进行。
[0242]
如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱方法例如hplc或亲和色谱法进一步纯化抗体。包括产生药物级抗体的技术在内的纯化抗体例如单克隆抗体的技术在本领域中是众所周知的。
[0243]
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体的dna序列。所需的dna序列可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成。可以适当使用定点诱变和聚合酶链反应(pcr)技术。
[0244]
任何合适的宿主细胞/载体系统均可用于表达编码本发明抗体分子的dna序列。真核生物例如哺乳动物宿主细胞表达系统可以用于制备抗体分子，包括完整的抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于cho、hek293t、per.c6、ns0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。此外，原核，例如细菌宿主细胞表达系统可用于生产抗体分子，例如完整的抗体分子。合适的细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。
[0245]
本发明还提供了生产根据本发明的抗体分子的方法，包括在适于从编码本发明抗体分子的dna表达蛋白质的条件下培养包含编码本发明核酸的载体的(异源)宿主细胞，并分离抗体分子。
[0246]
为了生产包含重链和轻链的抗体，可以用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽，第二载体编码重链多肽。替代地，可以使用单个载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
[0247]
根据本发明的抗体可以通过(i)在宿主细胞中表达根据本发明的核酸序列，例如通过使用根据本发明的载体，和(ii)分离表达的抗体产物来产生。此外，该方法可以包括(iii)纯化分离的抗体。可以筛选转化的b细胞和培养的浆细胞中产生所需特异性或功能的抗体的细胞。
[0248]
筛选步骤可以通过任何免疫测定进行，例如elisa，通过组织或细胞(包括转染的细胞)的染色，通过中和试验或通过本领域已知的用于鉴定所需特异性或功能的许多其他方法之一。该分析可以基于对一种或多种抗原的简单识别进行选择，或者可以基于所需功能的附加基础进行选择，例如选择中和抗体而不仅仅是抗原结合抗体，选择能够改变靶细胞特征的抗体，例如它们的信号级联、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其他细胞的能力、它们对其他细胞或其他试剂或条件变化的影响的反应、它们的分化状态等。
[0249]
然后可以从阳性转化的b细胞培养物中产生单个转化的b细胞克隆。用于从阳性细胞混合物中分离单个克隆的克隆步骤可以使用有限稀释、显微操作、通过细胞分选的单细胞沉积或本领域已知的其他方法来进行
[0250]
可以使用本领域已知的方法在hek293t细胞或其他已知的宿主细胞中分离、克隆和表达来自培养的浆细胞的核酸。
[0251]
本发明的永生化b细胞克隆或转染的宿主细胞可以多种方式使用，例如作为单克隆抗体的来源，作为编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(dna或mrna)的来源，用于研究等。
[0252]
本发明还提供了组合物，其包含产生本发明抗体的永生化b记忆细胞或转染的宿主细胞。
[0253]
本发明的永生化b细胞克隆或培养的浆细胞也可用作克隆抗体基因的核酸来源，用于随后的重组表达。从重组来源的表达可能比从b细胞或杂交瘤的表达更常用于药物目的，例如，出于稳定性、可再现性、培养容易性等原因。
[0254]
因此，本发明还提供了制备重组细胞的方法，包括以下步骤：(i)从编码感兴趣抗体的b细胞克隆或培养的浆细胞中获得一种或多于一种核酸(例如，重链和/或轻链mrna)；(ii)将核酸插入到表达载体中，和(iii)将载体转染到(异源)宿主细胞中，以允许感兴趣的抗体在该宿主细胞中表达。
[0255]
类似地，本发明还提供了制备重组细胞的方法，包括以下步骤：(i)对来自b细胞克隆或培养的浆细胞的编码感兴趣抗体的核酸进行测序；和(ii)使用来自步骤(i)的序列信息制备用于插入宿主细胞的核酸，以允许目的抗体在该宿主细胞中表达。可以但不必须在步骤(i)和(ii)之间操作核酸，以引入限制性位点，改变密码子使用，和/或优化转录和/或翻译调节序列。
[0256]
此外，本发明还提供了制备转染的宿主细胞的方法，包括用一种或多于一种编码感兴趣的抗体的核酸转染宿主细胞的步骤，其中所述核酸是来源于本发明的永生化b细胞克隆或培养的浆细胞的核酸。因此，首先制备核酸，然后用其转染宿主细胞的程序可以由不同地方(例如，不同国家)的不同人在不同时间进行。
[0257]
然后，本发明的这些重组细胞可用于表达和培养目的。它们特别适用于大规模药物生产的抗体表达。它们也可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何合适的培养技术，包括但不限于静态培养、滚瓶培养、腹水、中空纤维型生物反应器筒、模块化微型发酵罐、搅拌罐、微载体培养、陶瓷芯灌注等。
[0258]
从b细胞或浆细胞获得免疫球蛋白基因并对其测序的方法是本领域众所周知的(例如，参见kuby immunology，4th edition，2000的第四章)。
[0259]
转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如cho细胞、ns0细胞、人细胞如per.c6或hkb11-细胞、骨髓瘤细胞或人肝细胞)，以及植物细胞。在一些实施方案中，转染的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些实施方案中，表达宿主可以糖基化本发明的抗体，特别是利用自身在人体中没有免疫原性的碳水化合物结构。在一些实施方案中，转染的宿主细胞能够在无血清培养基中生长。在其他实施方案中，转染的宿主细胞能够在不存在动物源性产品的培养物中生长。也可以培养转染的宿主细胞以得到细胞系。
[0260]
本发明还提供了用于制备一种或多于一种编码感兴趣抗体的核酸分子(例如，重链和轻链基因)的方法，包括以下步骤：(i)根据本发明制备永生化b细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从b细胞克隆或培养的浆细胞中获得编码感兴趣抗体的核酸。此外，本发明提供了用于获得编码感兴趣抗体的核酸序列的方法，包括以下步骤：(i)根据本发明制备永生化b细胞克隆或培养浆细胞；(ii)对来自b细胞克隆或培养的浆细胞的编码感兴趣抗体的核酸进行测序。
[0261]
本发明还提供了用于制备编码感兴趣抗体的核酸分子的方法，包括获得从本发明的转化b细胞克隆或培养浆细胞获得的核酸的步骤。因此，首先获得b细胞克隆或培养的浆细胞，然后从b细胞克隆或培养的浆细胞获得核酸的程序可以由不同的人在不同的时间在不同的地方(例如，在不同的国家)进行。
[0262]
本发明还包括用于制备根据本发明的抗体(例如，用于药物用途)的方法，包括以下步骤：(i)从表达感兴趣抗体的所选b细胞克隆或培养的浆细胞中获得和/或测序一种或多于一种核酸(例如，重链和轻链基因)；(ii)将核酸插入或使用核酸序列来制备表达载体；(iii)转染能表达感兴趣抗体的宿主细胞；(iv)在表达感兴趣的抗体的条件下，培养或亚培养转染的宿主细胞；以及任选地，(v)纯化感兴趣的抗体。
[0263]
本发明还提供了制备感兴趣的抗体的方法，包括以下步骤：在表达感兴趣的抗体的条件下，培养或传代培养转染的宿主细胞群体，例如稳定转染的宿主细胞群体，以及任选地，纯化感兴趣的抗体，其中所述转染的宿主细胞群是通过以下步骤制备的：(i)提供编码由如上所述制备的b细胞克隆或培养的浆细胞产生的所选感兴趣的抗体的核酸，(ii)将核酸插入表达载体，(iii)将载体转染到能表达感兴趣的抗体的宿主细胞中，和(iv)培养或亚培养包含插入的核酸的转染的宿主细胞以产生感兴趣的抗体。因此，首先制备重组宿主细胞，然后培养其表达抗体的过程可以由不同地方(例如，不同国家)的不同人在非常不同的时间进行。
[0264]
药物组成
[0265]
本发明还提供了包含以下一种或多于一种的药物组合物：
[0266]
(i)本发明的抗体或其抗原结合片段；
[0267]
(ii)本发明的核酸或核酸组合；
[0268]
(iii)本发明的载体或载体组合；和/或
[0269]
(iv)表达根据本发明的抗体或包含根据本发明的载体的细胞
[0270]
和任选的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
[0271]
换句话说，本发明还提供了包含根据本发明的抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的细胞的药物组合物。
[0272]
药物组合物任选地还包含药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。尽管载剂或赋形剂可以促进施用，但其本身不应诱导产生对接收组合物的个体有害的抗体。它也不应是有毒的。合适的载剂可以是大的缓慢代谢的高分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物中的药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂不是针对mpv感染的活性成分。
[0273]
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
[0274]
药物组合物中的药学上可接受的载剂可以另外包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这种组合物中可以存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂或ph缓冲物质。这样的载剂使得药物组合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂和混悬剂，以供对象摄取。
[0275]
本发明的药物组合物可以以各种形式制备。例如，可以将组合物制备成可注射剂、或液体溶液剂或混悬剂。也可以制备适合于在注射之前在液体载体中溶解或悬浮的固体形式(例如，类似于synagis
tm
和的冻干组合物，以用于用含有防腐剂的无菌水复溶)。组合物可制备为局部施用，例如作为软膏剂、霜剂或散剂。组合物可制备为口服施用，例如作为片剂或胶囊剂、作为气雾剂、或作为糖浆剂(任选调味)。可以使用细粉或喷雾剂将组合物制备为肺部施用，例如作为吸入剂。组合物可制备为栓剂或阴道栓剂。可以将组合物制备为鼻部、耳部或眼部的施用，例如以滴剂的形式。组合物可以呈试剂盒形式，设计成使得组合的组合物在即将施用于对象之前被复溶。例如，冻干抗体可以以试剂盒形式与无菌水或无菌缓冲液一起提供。
[0276]
在一些实施方案中，组合物中的(唯一)活性成分是根据本发明的抗体。这样，它可能易于在胃肠道中降解。因此，如果要通过胃肠道的途径施用组合物，则该组合物可以包含保护抗体免于降解且当抗体已从胃肠道吸收后便释放的试剂。
[0277]
在gennaro(2000)remington：the science and practice of pharmacy，20th edition，isbn：0683306472中提供了药学上可接受的载剂的详尽讨论。
[0278]
本发明的药物组合物通常具有5.5至8.5的ph，在一些实施方案中，这可以为6至8，例如约7。可以通过使用缓冲液来维持ph。组合物可以是无菌的和/或无热原的。组合物可以是对人等渗的。在一些实施方案中，本发明的药物组合物以气密容器形式提供。
[0279]
在本发明范围内的是以多种施用形式存在的组合物；该形式包括但不限于适合于肠胃外施用的那些形式，例如通过注射或输注，例如通过推注或连续输注。当产品用于注射或输注时，它可以呈现为油性或水性介质中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，抗体可以是干燥形式，以便在与适当的无菌液体一起使用之前进行复溶。
[0280]
通常将载剂理解为适合于存储、运输和/或施用化合物例如药物活性化合物，特别是根据本发明的抗体的材料。例如，载剂可以是生理上可接受的液体，其适合于存储、运输和/或施用药物活性化合物，特别是根据本发明的抗体。一旦配制完成，就可以将本发明的
组合物直接施用于对象。在一些实施方案中，该组合物适合于施用于哺乳动物例如人类对象。
[0281]
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮、经皮、局部、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下喷射器也可用于施用本发明的药物组合物。可选地，可以将药物组合物制备为口服施用例如作为片剂、胶囊剂等，制备为局部施用，或作为注射剂例如作为液体溶液剂或混悬剂。在一些实施方案中，药物组合物是可注射的。还包括适于在注射前溶解或悬浮在液体载剂中的固体形式，例如药物组合物可以是冻干形式。
[0282]
对于注射例如静脉内、皮肤或皮下注射、或在患病部位注射，活性成分可能为肠胃外可接受的水溶液形式，其不含热原且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗载体例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。无论给予个体的是抗体、肽、核酸分子还是根据本发明的另一种药学上有用的化合物，施用通常是“有效量”，例如“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定)，这足以显示对个体的益处。实际施用的量、施用的速率和时间进程将取决于所治疗药物的性质和严重程度。对于注射，可以例如在预填充的注射器中提供根据本发明的药物组合物。
[0283]
如上限定的本发明药物组合物也可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液剂。对于口服片剂，常用的载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要口服水性混悬剂时，将活性成分，即如上限定的本发明的转运蛋白货物缀合物分子，与乳化剂和助悬剂混合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
[0284]
本发明的药物组合物也可以局部施用，特别是当治疗目标包括通过局部施用容易接近的区域或器官，例如包括可接近的上皮组织的疾病时。针对这些区域或器官中的每一个容易制备合适的局部制剂。对于局部施用，可以将本发明的药物组合物配制成合适的软膏剂，该软膏剂包含本发明的药物组合物，特别地，如上限定的其组分悬浮或溶解在一种或多于一种载剂中。局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇，、氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。替代地，可以将本发明的药物组合物配制成合适的洗剂或霜剂。在本发明的上下文中，合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、合成鲸蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苄醇和水。
[0285]
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。特别地，药物组合物可以以单剂量产品的形式提供。在一些实施方案中，药物组合物中抗体的量——特别是如果作为单剂量产品提供——不超过200mg，例如不超过100mg或50mg。
[0286]
对于单剂量，例如每日、每周或每月剂量，根据本发明的药物组合物中抗体的量可以不超过1g或500mg。在一些实施方案中，对于单剂量，根据本发明的药物组合物中抗体的量可以不超过200mg或100mg。例如，对于单剂量，根据本发明的药物组合物中抗体的量不能超过50mg。
[0287]
药物组合物通常包含“有效”量的本发明的一种或多于一种抗体，即足以治疗、改善、减轻、减少或预防所需疾病或病症或表现出可检测的治疗作用的量。治疗效果还包括减
少或减轻致病效力或身体症状。对于任何特定对象的确切有效量将取决于他们的大小、体重和健康状况、疾病的性质和程度以及选择施用的治疗方法或治疗方法的组合。对于给定情况的有效量通过常规实验确定，并且在临床医生的判断之内。出于本发明的目的，有效剂量通常可为约0.005mg/kg至约100mig/kg，例如约0.0075mg/kg至约50mg/kg或约0.01mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，相对于施用本发明抗体的个体的体重(例如，以kg计)，本发明抗体的有效剂量将为约0.02mg/kg至约5mg/kg(例如，药物组合物中抗体的量)。
[0288]
此外，根据本发明的药物组合物还可以包含附加活性成分，其可以是其他抗体或不是抗体的成分。因此，根据本发明的药物组合物可以包含一种或多于一种附加活性成分。
[0289]
根据本发明的抗体可以存在于与附加活性成分相同的药物组合物中，或者，根据本发明的抗体包含在第一药物组合物中，而附加活性成分包含在不同于第一药物组合物的第二药物组合物中。因此，如果设想一种以上的额外活性成分，则每种额外活性成分和根据本发明的抗体可以包含在不同的药物组合物中。可以将这些不同的药物组合物组合/同时地或在分开的时间或在分开的位置(例如身体的分开的部分)施用。
[0290]
根据本发明的抗体和额外的活性成分可以提供加和的治疗效果，例如协同治疗效果。术语“协同”用于描述两种或多于两种活性剂的联合效果，其大于每种相应活性剂的各个效果之和。因此，在两种或多于两种试剂的联合效果导致对活性或过程的“协同抑制”的情况下，该活性或过程的抑制大于每种各自活性剂的抑制效果的总和。术语“协同治疗效果”是指用两种或多于两种治疗方法的组合观察到的治疗效果，其中治疗效果(如许多参数中的任何一个所测量的)大于用相应的单独治疗方法观察到的单独治疗效果的总和。
[0291]
在其他实施方案中，根据本发明的药物组合物可以不包含额外的活性成分(除了本发明的抗体或如上所述的相应核酸、载体或细胞之外)。
[0292]
在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含本发明的抗体，其中所述抗体可以占组合物中总蛋白的至少50重量％(例如60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％)。在本发明的组合物中，抗体可以是纯化的形式。
[0293]
本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂混合。
[0294]
在其他实施方案中，制备药物组合物的方法包括以下步骤：将抗体与一种或多于一种药学上可接受的载剂混合，其中该抗体是获自发明的转化的b细胞或培养的浆细胞的单克隆抗体。
[0295]
作为用于治疗目的递送抗体或b细胞的替代，可以将编码衍生自b细胞或培养的浆细胞的目的单克隆抗体的核酸(通常为dna)递送给对象从而使核酸可以在对象中原位表达以提供所需的治疗效果。合适的基因疗法和核酸递送载体是本领域已知的。
[0296]
特别地，如果以多剂量形式包装，则药物组合物可以包含抗微生物剂。它们可以包含洗涤剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，例如吐温80。表面活性剂通常以低水平存在，例如小于0.01％。组合物还可包含钠盐(例如氯化钠)以产生张力。例如，典型的nacl浓度为10
±
2mg/ml。
[0297]
此外，特别地，如果药物组合物要冻干或者如果药物组合物包括已经从冻干材料复溶的材料，则药物组合物可以包含例如约15mg/ml至30mg/ml(例如25mg/ml)的糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)。冻干前，可将用于冻干的组合物的ph调节至5至8、或
5.5至7、或约6.1。
[0298]
本发明的组合物还可包含一种或多于一种免疫调节剂。在一些实施方案中，一种或多于一种免疫调节剂包括佐剂。
[0299]
抗体的组合
[0300]
在另一方面，本发明还提供了与mpv f蛋白结合(并中和mpv)的不同抗体或其抗原结合片段的组合。特别地，这种组合的抗体可以结合mpv f蛋白的不同表位。抗体是否结合相同或不同的表位可以通过例如技术人员已知的竞争研究来确定(如以下实施例所述)。
[0301]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的组合包含：
[0302]-如上所述的根据本发明的抗体或其抗原结合片段；和
[0303]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0304]
因此，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0305]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；和
[0306]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0307]
例如，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0308]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpf5(mpf5_vh117d)或其序列变体的重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3；和
[0309]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0310]
更具体地，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0311]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpf5(mpf5_vh117d)或其序列变体的vh和vl序列；和
[0312]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0313]
此外，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0314]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含(i)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；和
[0315]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0316]
例如，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0317]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpe33或其序列变体的重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3；和
[0318]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0319]
更具体地，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0320]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpe33或其序列变体的vh和vl序列；和
[0321]-结合mpv f蛋白(的独特表位)的抗体或其抗原结合片段。
[0322]
具体而言，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含本文所述的本发明的两种不同的抗体或其抗原结合片段。本发明的这种抗体或其抗原结合片段可以结合mpv f蛋白的不同表位。
[0323]
因此，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0324]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；和
[0325]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0326]
例如，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0327]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpf5(mpf5_vh117d)或其序列变体的重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3；和
[0328]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpe33或其序列变体的重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3。
[0329]
更具体地，抗体或其抗原结合片段的组合可以包含：
[0330]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpf5(mpf5_vh117d)或其序列变体的vh和vl序列；和
[0331]-如上所述的抗体或其抗原结合片段，包含如本文所述的抗体mpe33或其序列变体的vh和vl序列。
[0332]
例如，包含根据seq id no：1的重链cdr1、根据seq id no：2的重链cdr2和根据seq id no：3或10的重链cdr3；以及根据seq id no：4的轻链cdr1，根据seq id no：5或6的轻链cdr2，和根据seq id no：7的轻链cdr3的抗体或其抗原结合片段，可与包含根据seq id no：12、21、23、25、27、29、31或33中任一项的重链cdr1、根据seq id no：13的重链cdr2和根据seq id no：14的重链cdr3；以及根据seq id no：15的轻链cdr1，根据seq id no：16或17的轻链cdr2，和根据seq id no：18的轻链cdr3的抗体或其抗原结合片段组合。
[0333]
更具体地，包含根据seq id no：8或11的vh和根据seq id no：9的vl的抗体或其抗原结合片段，可以与包含根据seq id no：19、22、24、26、28、30、32或34的vh和根据seq id no：20的vl的抗体或其抗原结合片段组合。
[0334]
在本发明的抗体或其抗原结合片段的组合中，抗体或其抗原结合片段可以以如上所述的任何形式提供，例如蛋白质(抗体)、核酸(编码所述抗体)、载体(包含所述核酸)、细胞(表达所述抗体或包含所述载体)。因此，本发明提供了一种组合，包含
[0335]
(i)本发明的两种不同的抗体，或其抗原结合片段；
[0336]
(ii)本发明的两种不同的核酸(或核酸的组合)；
[0337]
(iii)本发明的两种不同载体(或载体的组合)；或者
[0338]
(iv)表达根据本发明的两种不同抗体或包含根据本发明的两种不同载体的两种不同细胞。
[0339]
应当理解，本发明的抗体或其抗原结合片段的组合(以如上所述的任何形式，例如抗体(蛋白质))可以包含在相同的组合物或不同的组合物中，例如如上所述的药物组合物。因此，本发明还提供了药物组合物，其包含两种不同的抗体，或如上所述的本发明的抗原结合片段。
[0340]
医疗和其他用途
[0341]
在另一方面，本发明提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸分子(或核酸分子的组合)、根据本发明的载体(或载体的组合)、根据本发明的细胞或根据本发明的药物组合物作为药物的用途。特别地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸分子(或核酸分子的组合)、根据本发明的载体(或载体的组合)、根据本发明的细胞、根据本发明的药物组合物或根据本发明的抗体的组合或其抗原结合片段可用于预防和/或治疗mpv感染；或(ii)mpv感染的诊断。
[0342]
因此，本发明还提供了改善或减少mpv感染或降低mpv感染风险的方法，包括：向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合片段、本发明核酸分子(或核酸分子组合)、本发明载体(或载体组合)、本发明细胞或本发明药物组合物。此外，本发明还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸分子(或核酸分子的组合)、根据本发明的载体(或载体的组合)、根据本发明的细胞、根据本发明的药物组合物或根据本发明的抗体或其抗原结合片段的组合在制备用于预防、治疗或减弱mpv感染的药物中的用途。
[0343]
mpv感染的预防尤其指预防性环境，其中对象未被诊断患有mpv(未进行诊断或诊断结果为阴性)和/或对象未显示mpv感染的症状。相反，在治疗环境中，对象通常被诊断患有mpv感染和/或表现出mpv感染的症状。值得注意的是，术语mpv感染的“治疗”和“疗法”/“治疗性”包括(完全)治愈以及减弱/减少mpv感染和/或相关症状。
[0344]
在一些实施方案中，对象可能是人。检查治疗效果的一种方法包括在施用本发明的组合物后监测疾病症状。治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。在一个实施方案中，将根据本发明的抗体、抗体片段、核酸、载体、细胞或组合物给予需要这种治疗的对象。本发明中描述的抗体及其片段也可用于mpv感染的诊断。
[0345]
本发明中描述的抗体及其片段也可用于mpv感染的诊断。诊断方法可以包括将抗体与样品接触。这种样品可以从对象中分离，例如从例如鼻腔、窦腔、唾液腺、肺、肝、胰腺、
肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑、皮肤或血液，诸如血浆或血清中提取的分离组织样品。例如，抗体或其抗原结合片段可以与(分离的)血液样品(例如全血、血浆或血清)接触。诊断方法还可以包括抗原/抗体复合物的检测，特别是在抗体与样品接触之后。这种检测步骤通常在工作台上进行，即不与人体或动物体产生任何接触。检测方法的实例是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如elisa(酶联免疫吸附测定)。因此，可以在体外进行诊断，例如通过使用如上所述的分离样品(以及抗原/抗体复合物的体外检测步骤)。因此，该抗体或其抗原结合片段可用于mpv感染的(体外)诊断。
[0346]
因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于检测mpv抗原的(体外)方法中。同样，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于结合mpv靶蛋白/抗原的(体外)方法，例如mpv f蛋白或其抗原片段或变体。由于具有特异性，本发明的抗体或其抗原结合片段识别mpv f蛋白，特别是其融合前构象。为了检测mpv抗原，可以将抗体与(分离的)样品(即待检测抗原存在的样品)接触。通过抗体与其抗原(mpv f蛋白)的特异性结合，形成抗体/抗原复合物，该复合物可以通过本领域已知的方法容易地检测到。
[0347]
这种检测方法可用于(体外)诊断(使用从人体或动物体分离的样品)，也可用于测试其他(例如生产/制造)样品，如疫苗样品。因此，如本发明所述的抗体、抗体片段或其变体也可用于非治疗性/非诊断性环境中，例如用于疫苗开发或生产中。因此，本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段用于测试疫苗的用途，特别是抗原(即疫苗中包含的所需抗原)是否被正确产生和/或折叠(和/或处于正确的构象)。因此，抗体可用于监控具有所需免疫原性的疫苗生产。为此，可以使抗体与疫苗接触，例如如上所述。因此，本发明还提供了测试抗mpv疫苗的方法，其中将疫苗与抗体或其抗原结合片段接触，并且任选地，确定抗体/抗原复合物的存在。此外，本发明还包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段，通过检查疫苗是否含有所需抗原，例如mpv的f蛋白(例如融合前构象)，或其片段或变体，来监测抗mpv疫苗的质量。更具体地，抗体可用于检查疫苗中抗原或其表位的构象。由于本发明的抗体特异性结合融合前f蛋白，在样品中检测到大量的抗体/抗原复合物可能意味着样品中含有主要处于融合前构象的mpv f蛋白。此外，抗原的修饰形式也可以用本发明的抗体进行测试，例如mpv f蛋白的片段和变体，其可以用于疫苗中。
[0348]
附图简要说明
[0349]
在下文中，将给出附图的简要描述。这些附图旨在更详细地说明本发明。然而，它们无意以任何方式限制本发明的主题。
[0350]
图1显示了实施例1中mpe33和mpf5抗体与融合前和融合后构象的hmpv f蛋白的结合特性，与参考抗体mpe8进行了比较。
[0351]
图2显示了实施例2中与参照抗体mpe8v3相比，用抗体mpe33和mpf5对四种不同的hmpv毒株a1/6621(mpv a1)、a2/vr8938(mpv a2)、b1/vr4702(mpv b1)和b2/3817(mpv b2)的中和作用。
[0352]
图3总结了实施例2与参照抗体mpe8v3相比，用抗体mpe33和mpf5中和四种不同的hmpv毒株a1/6621(mpv a1)、a2/vr8938(mpv a2)、b1/vr4702(mpv b1)和b2/3817(mpv b2)所需的ec50。
[0353]
图4显示了实施例3中抗体mpf5_vh117d(mpf5)、mpf5_vh117h、mpe33和对比抗体mpe8v3对mpv融合前f蛋白的结合亲和力和ec50值。
[0354]
图5显示了抗体mpf5_vh117d(mpf5)和mpf5_vh117h的vh和vl(“vk”)序列。正方形表示氨基酸位置vh117的替换位置。
[0355]
图6显示了实施例4的抗体mpe33及其变体mpe33_s36a、mpe33_n34q、mpe33_n34s、mpe33_c38s、mpe33_c38a、mpe33_c38y和mpe33_n34s_c38y对mpv融合前f蛋白的结合亲和力和ec50值。
[0356]
图7显示了抗体mpe33的vh和vl(“vk”)序列。正方形表示氨基酸位置n34、s36和c38的替换位置。
[0357]
图8显示了实施例5中抗体mpe33、mpe33_s36a、mpe33_n34q、mpe33_n34s、mpe33_c38s、mpe33_c38a、mpe33_c38y、mpe33_n34s_c38y、mpf5_vh117d(mpf5)、mpf5_vh117h和比较抗体mpe8与hmpv毒株mpv_nl/1/99_f0-tm(上行)和hmpv_yokohama/jpn(p8527)2016(中行)的细胞相关f抗原的结合。在下行中，显示了模拟转染(对照)。
[0358]
图9显示了实施例6中抗体mpf5、mpe33和mpe8与mpv f蛋白结合的竞争研究结果。数据显示了相同抗体之间的竞争(mpf5对mpf5；mpe33对mpe 33；mpe8对mpe8)，与预期一致。此外，图mpf5对mpe8和mpe8对mpf5显示了mpf5和mpe8之间的竞争。然而，在mpe33和mpe8或mpe33和mpf5之间没有发现竞争。
实施例
[0359]
在下文中，呈现了示出本发明的各种实施方案和方面的特定实施例。但是，本发明的范围不应受到本文所述的具体实施方案的限制。给出以下制备和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。然而，本发明的范围不受示例性实施方案的限制，这些示例性实施方案仅意在作为本发明的单个方面的说明，并且功能上等效的方法在本发明的范围内。实际上，根据本文的前述描述，附图和以下实施例，除本文所述的内容外，本发明的各种修饰形式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。
[0360]
实施例1：人单克隆抗体mpf5和mpe33的鉴定和特性分析
[0361]
从人类患者中分离出抗mpv的人单克隆抗体mpf5(也称为“mpf5_vh117d”)和mpe33(参见traggiai e.等人，2004，nat med 10(8)：871-5)。抗体的特征在于确定其可变区的核苷酸和氨基酸序列(mpf5vh：seq id no：8，mpf5vl：seq id no：9；mpe33_vh：seq id no：19，mpe33vl：seq id no：20)和其中的互补决定区(crd)(mpf5：seq id no分别为1至5和7，或1至4、6和7；mpe33：seq id no分别为12至16和18，或12至15、17和18)。将mpf5和mpe33的vh和vl基因克隆到igg1表达载体中，并通过瞬时转染293freestyle细胞(293f)产生重组抗体。收集转染细胞的上清液，通过蛋白a层析亲和纯化igg。因此，mpf5和mpe33是igg1型完全人单克隆抗体，具有本文所述的cdr、vh和vl序列。
[0362]
为了测试mpf5和mpe33与hmpv f蛋白的结合，基本上如wo 2016/103238 a1所述进行elisa测定，用于测试抗体与融合前与融合后构象的hmpv f蛋白的结合亲和力。作为比较，现有技术抗体mpe8(corti等人，2013，cross-neutralization of four paramyxoviruses by a human monoclonal antibody.nature 501：439-443)也在这个实验中进行了测试。
[0363]
简而言之，用构象稳定的融合前和融合后f蛋白抗原(来自can97-83mpv毒株的f蛋
白，1μg/ml，25μl/孔，在pbs ph7中)包被maxisorp elisa板过夜。用pbs/吐温0.01％(pbst)洗涤3次后，加入测试抗体，起始浓度为10μg/ml，用滴定法测量至3分之一的浓度，通过11个点，并在室温下孵育2小时。然后将平板在pbst中洗涤4次，并加入碱性磷酸酶标记的山羊抗人igg多克隆抗体(southernbiotech，2μg/ml，25μl/孔)，并在室温下进一步孵育1小时。用pbst洗涤4次后，通过在碳酸盐缓冲液中加入50μl/孔的ap底物(pnpp，sigma)使平板显影，并在45分钟后在405nm处读取。
[0364]
结果示于图1。所有测试的抗体(mpf5、mpe33和mpe8)显示出对mpv融合前f蛋白的高结合亲和力，但对mpv融合后f蛋白不显示高结合亲和力。因此，抗体mpf5、mpe33和mpe8对mpv融合前f蛋白具有特异性。与现有技术的抗体mpe8相比，本发明的抗体mpf5和mpe33显示出甚至更低的ec50值，因此对mpv融合前f蛋白具有更高的结合亲和力。
[0365]
实施例2：mpf5和mpe33有效地中和了各种mpv毒株
[0366]
接下来，用本发明的抗体mpf5和mpe33以及比较抗体mpe8v3评估mpv的各种不同毒株的中和作用，比较抗体mpe8v3不同于实施例1中使用的对照抗体mpe8，因为它在重链可变区包含n113s突变以去除糖基化位点。
[0367]
简而言之，基于hmpv毒株a1/6621、a2/vr8938、b1/vr4702和b2/3817对llc-mk2细胞的感染，使用微中和试验来分析含有抗体的培养物上清液。将纯上清液分别与0.239*106tcid50/ml(a1/6621)、0.0959*106tcid50/ml(a2/vr8938)、0.33*106tcid50/ml(b1/vr4702)和0.0959*106tcid50/ml(b2/3817)的病毒在室温下孵育1小时，然后加入llc-mk2靶细胞，分别孵育14天。使用wst-1试剂(roche)检测活细胞。使用上文所述的微中和试验用100tcid
50
的病毒测定ec50，并在第6或7天使用automated pathway 855分析仪(bd)通过间接免疫荧光测定病毒感染。ec50值是通过用具有可变斜率的4参数非线性回归拟合的中和曲线的内插法计算的。
[0368]
结果如图2和图3所示。所有抗体都有效中和了测试的四种不同的mpv毒株。具体而言，当与参照mab mpe8v3相比时，mpe33和mpf5显示出对mpvb2毒株明显更好的中和效力。
[0369]
实施例3：mpf5的cdrh3突变体显示出与mpv融合前f蛋白相似的高结合亲和力
[0370]
接下来，产生mpf5的变体抗体mpf5_vh117h，其与mpf5的不同之处在于其cdrh3序列是根据seq id no：10的，它的vh序列是根据seq id no：11的。mpf5的重链序列和cdrh3的差异如图5所示。
[0371]
抗体mpf5_vh117d(mpf5)、mpf5_vh117h、mpe8v3和mpe33对mpv融合前f蛋白的结合亲和力在实施例1所述的elisa试验中进行测试。
[0372]
结果示于图4。虽然所有测试的抗体都特异性结合mpv融合前f蛋白，但是本发明的抗体mpf5_vh117d(mpf5)、mpf5_vh117h和mpe33的结合亲和力显著高于对比抗体mpe8v3的结合亲和力。抗体mpf5_vh117d(mpf5)和mpf5_vh117h的结合亲和力类似地高，表明cdrh3突变没有削弱mpf5与mpv融合前f蛋白的结合亲和力。
[0373]
实施例4：mpe33的cdrh1突变体显示出与mpv融合前f蛋白相似的高结合亲和力
[0374]
接下来，产生了mpe33的下列变体抗体，其与mpe33的不同之处仅在于所示的cdrh1序列：
[0375]
抗体cdrh1(seq id no)vh(seq id no)mpe331219
mpe33_s36a2122mpe33_n34q2324mpe33_n3452526mpe33_c38s2728mpe33_c38a2930mpe33_c38y3132mpf33_n34s_c38y3334
[0376]
(表3)
[0377]
突变氨基酸在mpe33重链序列和cdrh3中的位置如图7所示。
[0378]
如实施例1所述，在elisa试验中测试了抗体mpe33及其上述变体抗体对mpv融合前f蛋白的结合亲和力。
[0379]
结果示于图6。所有测试的抗体mpe33、mpe33_s36a、mpe33_n34q、mpe33_n34s、mpe33_c38s、mpe33_c38a、mpe33_c38y和mpe33_n34s_c38y以相似的高结合亲和力特异性结合mpv融合前f蛋白。所有变体抗体的结合亲和力甚至略高于mpe33对mpv融合前f蛋白的结合亲和力，表明各种cdrh1突变没有削弱mpe33对mpv融合前f蛋白的结合亲和力。
[0380]
实施例5：与细胞相关f抗原结合
[0381]
接下来，测试上述实施例中描述的本发明的所有示例性抗体以及对比抗体mpe8的结合。
[0382]
为此，用mpv f蛋白(mpv_nl/1/99_f0-tm(ay304361)和hmpv_yokohama/jpn(p8527)2016)转染expi293细胞。hmpv_yokohama/jpn(p8527)2016携带d280n突变。简言之，将10μg质粒dna稀释在0.5ml opti-mem i培养基(gibco，目录号31985-047)，加入到含有30μl pei max转染试剂(40kd，目录号pol24765-1，polysciences)的0.5ml opti-mem中，并在室温(rt)下孵育20分钟。然后将转染混合物加入到含有生长的expi293细胞的80ml表达培养基(gibco，目录号a14351-02)的培养瓶中(3x106个细胞/ml)，并在37℃搅拌下进一步孵育3天。然后收获细胞，在冰上用4％甲醛固定20分钟，在冰上用含0.5％皂角苷、i％fbs的pbs透化20分钟，并用抗体mpe33、mpe33_s36a、mpe33_n34q、mpe33_n34s、mpe33_c38s、mpe33_c38a、mpe33_c38y和mpe33_n34s_c38y、mpf5_vh117d(mpf5)、mpf5_vh117h和比较抗体mpe8(5μg/ml，在4℃下在透化缓冲液中60分钟)染色。通过用af 647山羊抗人igg、fcγ片段特异性二抗(jackson，109-606-098，1μg/ml，冰上30分钟)对细胞进行染色，以及通过用流式细胞仪获取细胞，来显示结合。
[0383]
结果显示在图8中，mpv_nl/1/99_f0-tm在上面一行，hmpv_yokohama/jpn(p8527)2016在中间一行，模拟转染在下面一行。这些数据表明，mpe33和mpf5以及它们的所有变体与b1(nl1/1/99)和b2(yokohama)hmpv毒株的f蛋白结合得同样好，而b2毒株(携带d280n突变)的结果是mpe8抗体的病毒逃逸变体。
[0384]
实施例6：抗体mpe33、mpf5和mpe8的竞争研究
[0385]
为了鉴定抗体mpe33和mpf5是否与比较抗体mpe8结合mpv f-蛋白上相同或不同的表位，进行了结合/竞争研究。
[0386]
为此，使用octet red96(fortebio)通过生物层干涉测量法评估了抗体mpe33、mpf5和mpe8的竞争。简而言之，aps传感器用pbs中5μg/ml的mpv f蛋白加载/包被10分钟。使
用含1mg/ml bsa的pbs(封闭缓冲液)连续封闭传感器5分钟。通过将传感器移动到两个连续的孔(每个孔7分钟)中进行mab的结合，两个连续的孔分别含有在封闭缓冲液中的30ug/ml的第一和第二单克隆抗体。所有步骤都在30℃下以1000转每分钟的速度恒定混合下进行。
[0387]
结果示于图9。数据表明mpf5与mpe8竞争，表明两种抗体结合mpv f蛋白上的相同或重叠表位。然而，mpe33既不与mpf5也不与mpe8竞争，表明与mpf5和mpe8相比，mpe33与mpv f蛋白上的独特表位结合。
[0388]
序列和seq id编号表(序列表)：
[0389]
[0390]
[0391]
[0392]

技术特征：
1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合偏肺病毒(mpv)f蛋白。2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段结合mpv融合前f蛋白。4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中50％抗体结合mpv融合后f蛋白所需的抗体或其抗原结合片段的浓度是50％抗体结合mpv融合前f蛋白所需的浓度的至少100倍。5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段中和mpv的感染。6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段特异性结合mpv亚群a1、a2、b1和b2的f蛋白。7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段中和mpv亚群a1、a2、b1和b2的感染。8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：4、seq id no：6和seq id no：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：16和seq id no：18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别与seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别与seq id no：15、seq id no：17和seq id no：18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：1的重链cdr1序列；-根据seq id no：2的重链cdr2序列；-与seq id no：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链cdr3序列；-根据seq id no：4的轻链cdr1序列；-根据seq id no：5或6的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：7的轻链cdr3序列。11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中seq id no：3中的c-末端asp残基被替换；任选地被另一种极性氨基酸替换。12.根据权利要求10或11所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含根据seq id no：3或10的重链cdr3序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：1的重链cdr1序列；-根据seq id no：2的重链cdr2序列；-根据seq id no：3的重链cdr3序列；-根据seq id no：4的轻链cdr1序列；-根据seq id no：5或6的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：7的轻链cdr3序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：1的重链cdr1序列；-根据seq id no：2的重链cdr2序列；-根据seq id no：10的重链cdr3序列；-根据seq id no：4的轻链cdr1序列；
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根据seq id no：5或6的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：7的轻链cdr3序列。15.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括：-与seq id no：12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区氨基酸残基n34、s36和c38(分别对应于seq id no：12中的n6、s8和c10)中的一个或多于一个被替换。17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中-n34(对应于seq id no：12中的n6)被gln(q)或ser(s)替换；-s36(对应于seq id no：12中的s8)被ala(a)替换；和/或-c38(对应于seq id no：12中的c10)被ser(s)、ala(a)或tyr(y)替换。18.根据权利要求15至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中重链cdr1序列与seq id no：12的不同之处在于单个或恰好两个氨基酸替换。19.根据权利要求15至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含根据seq id no 12、21、23、25、27、29、31和33中任一项的重链cdr1序列。20.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：12的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。21.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：21的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。22.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：23的重链cdr1序列；
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根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。23.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：25的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。24.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：27的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。25.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：29的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。26.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：-根据seq id no：31的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。27.根据权利要求15至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：
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根据seq id no：33的重链cdr1序列；-根据seq id no：13的重链cdr2序列；-根据seq id no：14的重链cdr3序列；-根据seq id no：15的轻链cdr1序列；-根据seq id no：16或17的轻链cdr2序列；以及-根据seq id no：18的轻链cdr3序列。28.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8具有至少70％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9具有至少70％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)含有与seq id no：19具有至少70％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20具有至少70％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。29.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8具有至少75％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9具有至少75％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)含有与seq id no：19具有至少75％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20具有至少75％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。30.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)含有与seq id no：19具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。31.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)含有与seq id no：19具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。32.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)含有与seq id no：19具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。33.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含(i)含有与seq id no：8具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：9具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)含有与seq id no：19具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no：20具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。34.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：8的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：9的轻链可变区。
35.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：11的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：9的轻链可变区。36.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：19的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。37.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：22的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。38.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：24的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。39.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：26的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。40.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：28的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。41.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：30的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。42.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：32的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。43.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含含有根据seq id no：34的氨基酸序列的重链可变区和根据seq id no：20的轻链可变区。44.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人抗体。45.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。46.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中抗体包含fc部分。47.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中抗体为igg型。48.根据权利要求47所述的抗体，其中抗体为igg1型。49.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是纯化的。50.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是单链抗体。51.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结
合片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。52.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用作药物。53.根据权利要求52所述之用途的抗体或其抗原结合片段，用于预防或治疗mpv感染。54.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。55.根据权利要求54所述的核酸分子，其中编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸是密码子优化的。56.根据权利要求54或55所述的核酸分子，其包含如seq id no 38至55中任一项所示的核酸序列；或其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列变体。57.一种第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中第一核酸分子包含编码根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸；第二核酸分子包含编码相同抗体的相应轻链或其相同抗原结合片段的多核苷酸。58.根据权利要求57所述的核酸分子的组合，其中编码抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的一个或两个多核苷酸是密码子优化的。59.根据权利要求57或58所述的核酸分子的组合，其包含如seq id no 38至55中任一项所示的核酸序列；或其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列变体。60.一种第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中(i)第一核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸，多核苷酸包含：(a)根据seq id no 38、39和40的核苷酸序列；或(b)根据seq id no 47、48和49的核苷酸序列；和(ii)第二核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸，多核苷酸包含：(c)根据seq id no 41、42(或43)和44的核苷酸序列；或(d)根据seq id no 50、51(或52)和53的核苷酸序列。61.一种载体，其包含根据权利要求54至56中任一项所述的核酸分子或根据权利要求57至60中任一项所述的核酸分子的组合。62.一种第一载体和第二载体的组合，其中第一载体包含如权利要求57至60中任一项所限定的第一核酸分子，第二载体包含如权利要求57至60中任一项所限定的相应第二核酸分子。63.一种细胞，其表达根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含根据权利要求61所述的载体或根据权利要求62所述的载体的组合。64.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求54至56中任一项所述的核酸、根据权利要求57至60中任一项所述的核酸的组合、根据权利要求61所述的载体、根据权利要求62所述的载体的组合或根据权利要求63所述的细胞，以及任选的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。65.根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求54至56中任一项所述的核酸、根据权利要求57至60中任一项所述的核酸的组合、根据权利要求61
所述的载体、根据权利要求62所述的载体的组合、根据权利要求63所述的细胞或根据权利要求64所述的药物组合物，用作药物；任选地用于预防或治疗mpv感染。66.根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在mpv感染的(体外)诊断中的用途。67.根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在用于检测mpv抗原的方法中的用途。68.根据权利要求1到51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于通过检查抗mpv疫苗的抗原来监测所述疫苗的质量的用途。69.根据权利要求68所述的用途，其中检查所述疫苗的抗原或其表位的构象。70.根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求54至56中任一项所述的核酸、根据权利要求57至60中任一项所述的核酸的组合、根据权利要求61所述的载体、根据权利要求62所述的载体的组合、根据权利要求63所述的细胞或根据权利要求64所述的药物组合物在制备用于预防、治疗或减弱mpv感染的药物中的用途。71.一种减少mpv感染或降低mpv感染风险的方法，包括：向有需要的对象施用治疗有效量的根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求54至56中任一项所述的核酸、根据权利要求57至60中任一项所述的核酸的组合、根据权利要求61所述的载体、根据权利要求62所述的载体的组合、根据权利要求63所述的细胞或根据权利要求64所述的药物组合物。72.一种用于测试抗mpv疫苗的方法，其中将疫苗与根据权利要求1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，并且任选地，确定抗体/抗原复合物的存在。

技术总结
本发明涉及与偏肺病毒(MPV)的F蛋白(融合蛋白)结合的抗体及其抗原结合片段。抗体及其抗原结合片段中和MPV的感染。本发明还涉及编码这种抗体和抗体片段的核酸，以及表达这种抗体和抗体片段的细胞。此外，本发明涉及抗体和抗体片段在用于检测和检查MPV抗原的方法中以及在MPV感染的诊断、治疗和预防中的用途。治疗和预防中的用途。治疗和预防中的用途。


技术研发人员：法比奥
受保护的技术使用者：胡默波斯生物医学公司
技术研发日：2021.12.07
技术公布日：2023/10/8