一种大环内酯化合物清除衰老细胞增强抗肿瘤药物疗效的应用的制作方法

1.本发明涉及一种大环内酯化合物清除衰老细胞增强化疗药物抗肿瘤疗效的应用，属于药物新用途技术领域。


背景技术：

2.式（ⅰ）所示的大环内酯化合物，分子式为c
28h38
n2o6，英文名为conglebatin（本技术简称为fw)。式（ⅰ）1979年报道，fw是由链霉菌streptomyces conglobatus atcc 31005产生的化合物，它无抗真菌、抗细菌、抗原虫、抗肿瘤活性，是一个低毒性药物，按小鼠1g/kg给药，未发现毒性作用[ j antibiotics, 1979, 32 (9):874-877.]。近年报道该化合物具有抑制热休克90蛋白功能的抗肿瘤作用[mol cancer,13(2014)150.]，但未见本专利所述应用的文献报道。
[0003]
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命的全身性疾病，肿瘤复发与远处转移是致死的主要原因。放、化疗是肿瘤患者最常用的治疗手段，国际最新研究发现，放、化疗等常规的肿瘤治疗均可诱导肿瘤细胞形成衰老细胞（senescent cells，snc），snc通过衰老相关的分泌表型（sasp）向其微环境分泌炎性细胞因子、生长因子等，塑造促进肿瘤复发、转移微环境，并通过激活衰老细胞的抗凋亡途径（scaps）对放、化疗产生抵抗，因此衰老细胞是构成了肿瘤耐药、复发、转移的根源。2022年1月国际顶级刊物cancer discovery的封面综述，将细胞衰老被纳入新的癌症特征（cancer discovery, 2022;12(1):31-46），清除衰老细胞（senolytic effect）成为提高肿瘤治疗效果的新策略（j natl cancer inst ,2021; 113(10): djab064），衰老细胞清除剂（senolytic）与放、化疗联合可清除衰老细胞，抑制衰老细胞的促肿瘤增殖、转移作用，提高放、化疗的治疗效果。
[0004]
本发明首次发现，fw具有清除衰老细胞的作用，fw是新的衰老细胞清除剂（senolytic），可以清除吉西他滨等化疗药诱导产生的、对化疗药耐药的衰老细胞，有效去除肿瘤复发、转移的根源，可望在一定程度上解决肿瘤常规治疗尚无法满足的肿瘤耐药、复发、转移等临床需求。
[0005]
以化疗药吉西他滨（gemcitabine，gem）体外诱导的人胰腺癌细胞衰老，制备衰老的细胞模型，该模型可见衰老细胞的β半乳糖苷酶（sa-β-gal）染色呈阳性。fw可以浓度依赖性地降低sa-β-gal染色阳性的衰老细胞的数量，下调衰老细胞的衰老标志物p16
ink4a
、p21
cip1 / waf1
等的水平，并可通过诱导衰老细胞凋亡，清除衰老细胞。fw还抑制衰老细胞的sasp，有效降低衰老细胞分泌的il-6、il-13等因子水平，进而抑制衰老细胞的促进肿瘤生
长、转移的作用。基于衰老细胞的生物学特征和fw的上述作用，fw与吉西他滨等化疗药合用，通过清除衰老细胞、抑制衰老细胞的促增殖、促转移作用，增强抗肿瘤药物的作用。
[0006]
根据衰老细胞清除剂的特点，美国国立癌症研究院在2020年8月的专题研讨会上提出“one-two punch”的癌症组合拳治疗理念，即对癌症患者首先应用放射或化疗药物等常规疗法作为第一拳（first punch）打击，旨在大量杀伤快增殖肿瘤细胞的同时，诱导产生大量衰老肿瘤细胞，接着给予衰老细胞清除剂的第二拳（second punch）打击，针对性清除由放化疗产生的、对放化疗药无效、并可成为肿瘤复发、转移根源的衰老细胞，增强化疗药的治疗效果（j natl cancer inst ,2021; 113(10): djab064）。


技术实现要素：

[0007]
本发明公开的大环内酯化合物fw在清除衰老细胞，增强抗肿瘤药物疗效方面的应用，该化合物对化疗药物诱导的衰老细胞具有清除作用，可抑制衰老细胞的衰老相关分泌表型（sasp），进而抑制衰老细胞的促癌细胞生长、转移的作用，与化疗药物联合应用具有增强疗效的作用。以该化合物效剂量与有效剂量的抗肿瘤药物联合具有协同抗肿瘤作用。
[0008]
将具有清除衰老细胞的有效剂量的fw与有效剂量的抗肿瘤药物联合应用，制备成药学上可接受的复方制剂，可用于提高化疗药对肿瘤的治疗效果。
[0009]
式（ⅰ）所示的大环内酯化合物，具有清除衰老细胞、增强化疗药物抗肿瘤疗效的用途。式（ⅰ） 有效剂量范围是5mg/kg~200mg/kg。
附图说明
[0010]
图1 衰老细胞模型制备：以化疗药吉西他滨（gemcitabine，gem）诱导人胰腺癌细胞mia-paca-2、panc-1细胞衰老；图1a 衰老细胞的sa-β-gal染色阳性；图1b 吉西他滨诱导的衰老细胞sa-β-gal染色阳性的比例（%）提高；图1c 免疫印迹观察衰老细胞的衰老标志物的蛋白表达升高；说明gem可以成功诱导人胰腺癌细胞mia-paca-2、panc-1细胞衰老，制备衰老细胞模型。
[0011]
图2 fw对衰老细胞的清除作用；图2a fw减少sa-β-gal染色阳性的衰老细胞；图2b fw降低sa-β-gal染色阳性的衰老细胞的比例；图2c fw抑制衰老细胞的量效曲线；图2d fw抑制衰老细胞衰老标志物的蛋白表达。
[0012]
说明fw清除gem诱导的衰老细胞。
[0013]
图3 fw诱导衰老细胞凋亡；说明fw通过诱导细胞凋亡，清除衰老细胞。
[0014]
图4fw抑制衰老细胞的衰老相关分泌表型（sasp）
具体实施方式
下列结合附图和实例对本发明进行详细说明实施例gem诱导人胰腺癌mia-paca-2、panc-1细胞衰老，化合物fw对衰老胰腺癌的清除作用并抑制衰老细胞的sasp
[0015]
肿瘤细胞株：人胰腺癌细胞株mia-paca-2、panc-1细胞购自上海富衡生物科技有限公司。panc-1细胞培养于含10%胎牛血清的dmem培养液中，mia-paca-2细胞培养于含10%胎牛血清，2%马血清的dmem培养液；置于37℃，5%co2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0016]
β-半乳糖苷酶染色：取对数生长期人胰腺癌细胞mia-paca-2、panc-1接种在6孔板中，培养24h后，加入0.5μm吉西他滨（gemcitabine，gem），作用48h，随后用pbs洗涤一次，加入β-半乳糖苷酶染色试剂盒中的固定液1ml，室温条件下固定15min，吸出固定液后，用pbs清洗3次，每次3min，吸出pbs后，在每个孔加入1ml染色工作液，在无二氧化碳的培养箱中37℃孵育过夜，在普通光学显微镜下拍照并计数β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数。
[0017]
衰老标志物的检测：取对数生长期的mia-paca-2、panc-1肿瘤细胞，调整细胞最终浓度为7
×
104个/ml，2ml/组，接种到6孔板中，待细胞贴壁后，加入gem诱导48h,弃去培养基，加入不同浓度的药物处理48h。提取细胞蛋白，用免疫印迹法检测衰老标志物γ-h2ax，p21和p53的表达。
[0018]
细胞凋亡检测：用annexin-v-apc/pi双染法流式细胞仪检测。取对数生长期mia-paca-2、panc-1肿瘤细胞，按1.5
×
105/ml接种在6孔培养板中，每孔1.8ml。实验组分别加入不同浓度的药物200μl，对照组不加药。37℃，5%co2的培养箱培养48h后，用不含edta的胰酶消化收集细胞，并用预冷的pbs洗两遍，重悬于1
×
loadingbuffer中，加入5μlannexinv-apc和5-10μlpi，轻轻混匀，室温避光孵育15min。采用流式细胞仪进行上机检测。活细胞不被annexinv-apc和pi染色；凋亡早期的细胞仅被annexinv-apc染色，pi染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被annexinv-apc和pi双重染色，可用流式细胞仪测定凋亡早期细胞、坏死细胞和凋亡晚期的细胞的比例。
[0019]
炎症因子水平的检测：取对数生长期的人胰腺癌衰老细胞mia-paca-2、panc-1以7.5
×
105个/ml的密度接种于6孔板中，分别设置为对照组、吉西他滨诱导的衰老组和吉西他滨诱导组加fw作用组，收集各组细胞培养液上清液，300g离心10min。取上清液保存再-80℃保存。采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测细胞培养液上清液和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的炎症因子与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-hrp)。洗涤后，加入显色底物tmb，避光显色。颜色反应的深浅与样本中炎症因子的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450nm波长测定吸光度值。
[0020]
成功制备衰老细胞模型：使用0.5μmgem诱导panc-1、mia-paca-2诱导48h,从β-半乳糖苷酶染色结果中可以观察到：gem成功诱导panc-1、mia-paca-2细胞衰老，衰老细胞被染成蓝绿色，细胞形态与对照组相比，衰老细胞出现变大，变圆，并且出现增长缓慢等情
况（附图1a），且β-半乳糖苷酶染色阳性的衰老细胞比例显著升高（附图1b）。为了进一步验证gem诱导胰腺癌细胞转化成衰老细胞，用免疫印迹法检测衰老标志物γ-h2ax，p21和p53的表达，与对照组相比，吉西他滨诱导的衰老肿瘤细胞，其衰老标志物的表达均明显增加（附图1c）。实验结果表明，用0.5μm吉西他滨作用48h，可以诱导正常胰腺癌细胞mia-paca-2、panc-1转化成衰老状态的胰腺癌细胞。
[0021]
fw有效减少衰老细胞的数量、抑制衰老标志物表达：使用0.5μm吉西他滨诱导人胰腺癌细胞mia-paca-2、panc-1 48h后，我们用不同浓度fw作用48h，β-半乳糖苷酶实验结果表明，与单纯吉西他滨诱导的衰老细胞相比，fw作用后的衰老细胞数目明显减少（附图2a,b）。fw对衰老的mia-paca-2、panc-1细胞的ic50分别为19.07
ꢀ±ꢀ
4.47，52.11
ꢀ±ꢀ
4.06。fw对人胰腺癌衰老细胞具有细胞毒作用（附图2c）。免疫印迹结果表明gem诱导的衰老细胞中的衰老细胞标志蛋白γ-h2ax、p21表达升高，fw作用后与单纯gem诱导的衰老细胞相比，衰老细胞标志蛋白表达呈浓度依赖性减少（附图2d）。上述实验结果表明，fw可以清除人胰腺癌衰老细胞。
[0022]
fw诱导衰老细胞凋亡：使用annexin v-apc/pi双染法研究fw对吉西他滨诱导的人胰腺癌衰老细胞mia-paca-2和panc-1凋亡的影响，单独吉西他滨对mia-paca-2和panc-1的凋亡率分别为：17.16
ꢀ±ꢀ
3.43, 15.32
ꢀ±ꢀ
3.58；吉西他滨加25, 50 μm的fw对mia-paca-2和panc-1的凋亡率分别为： 23.88
ꢀ±ꢀ
5.13, 35.40
ꢀ±ꢀ
5.22；17.08
ꢀ±ꢀ
6.51，37.16
ꢀ±ꢀ
5.77。高浓度的fw-04-806对吉西他滨诱导的衰老胰腺癌细胞的凋亡率显著高于单纯吉西他滨诱导组（附图3）。
[0023]
fw抑制衰老细胞的sasp：采用eliasa检测了吉西他滨诱导的人胰腺癌衰老细胞以及fw处理后的衰老细胞sasp相关细胞因子的表达量，结果发现，il-13、在吉西他滨诱导的衰老细胞mia-paca-2中表达有提高，fw处理之后降低；il-6在吉西他滨诱导的衰老细胞panc-1中表达提高，fw处理之后降低。实验结果提示fw可能抑制吉西他滨诱导的衰老细胞的sasp，从而减轻衰老细胞带来的促癌等不良作用（附图4）。

技术特征：
1.式（ⅰ）所示的大环内酯化合物，清除衰老细胞，增强抗肿瘤药物疗效的用途。式（ⅰ）。2.权利要求1所述的用途，其特征在于，通过诱导衰老细胞凋亡，清除化疗药物诱导的衰老细胞。3.权利要求1所述的用途，其特征在于，通过抑制衰老细胞的衰老相关的分泌表型，抑制衰老肿瘤产生的促肿瘤增殖、转移等不良影响，增强抗肿瘤药物疗效。4.权利要求1所述的用途，其特征在于，有效剂量范围是5mg/kg~200mg/kg。5.一种复方抗肿瘤制剂，包括有效剂量的权利要求1所述的大环内酯化合物，以及有效剂量的抗肿瘤药物。

技术总结
本发明涉及一种大环内酯化合物在清除衰老细胞增强抗肿瘤药物疗效的应用，该化合物对化疗药物诱导的衰老细胞具有清除作用，可抑制衰老细胞的衰老相关分泌表型（SASP），进而抑制衰老细胞的促癌细胞生长、转移的作用，与化疗药物联合应用具有增强疗效的作用。以效剂量的该化合物与有效剂量的抗肿瘤药物联合或者与有效剂量的抗肿瘤药物混合制备成药学上可接受的复方制剂，在肿瘤治疗方面的应用。在肿瘤治疗方面的应用。在肿瘤治疗方面的应用。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：福州首创生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.08.27
技术公布日：2023/10/8