抗CD47-CLDN18.2双特异性抗体的抗独特型抗体及其制备方法和应用与流程

抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.cd47也被称为整合素相关蛋白，属于免疫球蛋白超家族，广泛存在于多种正常细胞表面，也在多种肿瘤类型（血液瘤、实体瘤）的瘤组织中过表达。cd47配体包括sirpα（信号调节蛋白α）、tsp-1、整合素等，其中报道最多的是sirpα，sirpα主要表达于巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面。cd47通过与巨噬细胞表面的sirpα连接，使sirpα胞内itim发生磷酸化，并产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用，从而避免误伤正常细胞，也使得表达cd47的肿瘤细胞发生免疫逃逸。因此开发靶向cd47的药物可阻断瘤组织内cd47/sirpα介导的免疫抑制信号，从而发挥抗肿瘤作用。
3.cldn18.2属于紧密连接蛋白（cldns）家族成员，主要在机体的上皮细胞中表达，cldn蛋白异常可导致上皮细胞结构破坏及功能受损，造成细胞间黏附力下降、极性丧失，使细胞的正常分化缺失并获得侵袭性，导致多种肿瘤的发生和发展，也与肿瘤的侵袭和转移存在一定的关系。cldn18是cldn蛋白家族成员之一，包括cldn18.1和cldn18.2亚型，在人体中cldn18.1和cldn18.2的表达具有组织特异性，cldn18.1主要表达在肺组织中，cldn18.2主要表达在胃肠组织的胃粘膜、小肠上皮细胞上。在原发性胃癌及其多种转移后癌症类型中高表达cldn18.2分子，另外在胰腺癌、食管癌、结肠癌、卵巢癌中也观察到cldn18.2被激活表达，cldn18.2的肿瘤高表达特性使其成为极具潜力的肿瘤治疗靶点。wo2016165762a1公开了抗cldn18.2抗体imab362 （zolbetuximab），其在胃癌临床二期试验中表现出比标准化疗显著延长生存期（13.2对8.4个月），在cldn18.2高表达患者中优势更明显。
4.常规的靶向或免疫治疗药物只能用于抑制某一个或一类靶点，因而诞生了一些独特的联合用药方案；而“双抗”最大的特点在于，这类药物能够同时抑制两个或两类靶点，以一药之“力”，就能够达到两药联合治疗的效果。如wo2021003082a1公开了抗cldn18.2和cd47双特异性抗体，其基本不结合人红细胞。cn115991784a中公开了抗cd47-cldn18.2特异性抗体na3s-h1，该双抗与cldn18.2亲和力高，药物可以特异性结合cldn18.2阳性瘤细胞；与cd47亲和力较低，但仍可以阻断cd47/sirpα信号通路从而解除肿瘤中cd47介导的免疫抑制。在非临床研究中，该双抗在过表达cldn18.2的人胃癌、人胰腺癌以及人结肠癌小鼠肿瘤模型表现出剂量依赖性的抗肿瘤作用，且显著优于目前处于临床三期开发中的cd47单抗（hu5f9）和cldn18.2单抗（imab362）。
5.然而，抗cd47-cldn18.2双抗药物作为一种外源蛋白，注入机体后可能产生抗药抗体，降低药效，甚至引发机体产生自身免疫反应，威胁生命健康。因此，在抗体药物在投入生产和上市之前，进行动物和人体的药代动力学、免疫原性等分析就显得至关重要。在抗体药物研发及检测过程中，有一类特殊的抗体值得注意。它不仅可作为抗药抗体检测的重要参
照，用于药物的免疫原性评价，也可以作为检测试剂，检测人或动物血清中的抗体药物含量，分析抗体药物的药代动力学。这类抗体就是抗独特型抗体。
6.综上所述，开发识别抗cd47-cldn18.2双抗的抗独特型抗体，能够应用于抗cd47-cldn18.2双抗药物的定量检测，对于抗cd47-cldn18.2双抗药物的应用具有重要意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体及其制备方法和应用，本发明开发识别抗cd47-cldn18.2双抗的抗独特型抗体，能够应用于临床前研究中抗cd47-cldn18.2双抗药物的定量检测，是药代动力学（pk）和免疫原性（ada）分析的重要试剂，为临床试验的生物分析提供有力的工具。
8.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体，所述抗独特型抗体包括第一抗独特型抗体和/或第二抗独特型抗体；所述第一抗独特型抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别包括seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的序列，轻链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别包括seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示的序列；所述第二抗独特型抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别包括seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9所示的序列，轻链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别包括seq id no.10、seq id no.11和seq id no.12所示的序列。
10.本发明中针对抗cd47-cldn18.2特异性抗体na3s-h1开发能够有效识别其的抗独特型抗体，所述抗独特型抗体能够与抗cd47-cldn18.2双抗特异性结合，可用于夹心elisa法定量分析抗cd47-cldn18.2抗体，监测评估抗cd47-cldn18.2双抗的代谢过程等，为临床试验的生物分析提供有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
11.seq id no.1：gyymh。
12.seq id no.2：yincyngatsynqnfkg。
13.seq id no.3：weayygnydy。
14.seq id no.4：rasksvstsgysymh。
15.seq id no.5：lvsnles。
16.seq id no.6：qhireltr。
17.seq id no.7：sytmh。
18.seq id no.8：yinpssgytnynqkfkd。
19.seq id no.9：lhyygy。
20.seq id no.10：qsigts。
21.seq id no.11：yas。
22.seq id no.12：qqsnswpnt。
23.优选地，所述第一抗独特型抗体的重链的氨基酸序列包括seq id no.13所示的序列，轻链的氨基酸序列包括seq id no.14所示的序列；所述第二抗独特型抗体的重链的氨基酸序列包括seq id no.15所示的序列，轻链的氨基酸序列包括seq id no.16所示的序列。
24.seq id no.13：
25.evqlqqsgpelvktgasvkisckasgysftgyymhwvkqshgkslewigyincyngatsynqnfkgkatftvdtssstaymqfnsltsedsavyycarweayygnydywgqgttltvss。
26.seq id no.14：
27.divltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpsweik。
28.seq id no.15：
29.qvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftsytmhwvkqrpgqglewigyinpssgytnynqkfkdkatltadkssstaymqlssltsedsavyscatlhyygywgqgttltvss。
30.seq id no.16：
31.dilltqspailsvspgervsfscrasqsigtsthwyqqrkngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgteftlsinsvesediadyycqqsnswpntlgggtkleik。
32.本发明中，开发了两种抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体，分别命名为30d12d3b5（seq id no.13、seq id no.14）和15e5g6d1（seq id no.15、seq id no.16），30d12d3b5结合双抗的抗cd47端，15e5g6d1结合双抗的抗cldn18.2端，二者可以为单独制剂形式，亦可进行组合作为组合制剂。
33.第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体。
34.第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
35.第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子。
36.第五方面，本发明提供如第一方面所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体在制备检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的产品中的应用。
37.第六方面，本发明提供一种检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体。
38.第七方面，本发明提供如第一方面所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体在检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体中的应用。
39.第八方面，本发明提供一种检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的方法，所述方法包括：
40.基于酶联免疫吸附测定法（elisa），利用第一方面所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体进行检测。
41.优选地，所述检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的方法为夹心elisa法，具体包括：
42.将所述抗独特型抗体包被至elisa板反应孔，浓度为1~3
ꢀµ
g/ml，在20~30℃静置0.5~3 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；采用pbs将抗人cd47-cldn18.2的人源化抗体进行10倍系列稀释，在20~30℃静置0.5~3 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入待检测配对的抗独特型抗体，浓度为1.0~3
ꢀµ
g/ml，在20~30℃静置1~3 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入streptavidin-hrp，在20~30℃静置10~40 min，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入反应底物，在20~30℃避光显色10~15 min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
43.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
44.本发明筛选制备抗cd47-cldn18.2双抗的抗独特型抗体，能够特异性与抗cd47-cldn18.2双抗高效结合，且与其他igg1型抗体无交叉反应，能够确定早期试验中给予的抗体的血清水平，有助于将来治疗方法的计划并用于确定cd47-cldn18.2双抗的药代动力学（pk）和免疫原性（ada）等，为临床试验的生物分析提供有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
45.图1a为抗cd47-cdn18.2双抗cd47端的抗独特型抗体（15g11e11a12、29a1c6b10）与cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
46.图1b为抗cd47-cdn18.2双抗cd47端的抗独特型抗体（6e7c8g4、26c1e8a6）与cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
47.图1c为抗cd47-cdn18.2双抗cd47端的抗独特型抗体（19a2c8d6、9f6d6e7）与cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
48.图1d为抗cd47-cdn18.2双抗cd47端的抗独特型抗体（27a11b4b10、1e9b7a8）与cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
49.图1e为抗cd47-cdn18.2双抗cd47端的抗独特型抗体（23f4d9b2、30d12d3b5）与cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
50.图2为抗cd47-cdn18.2双抗cldn18.2端的抗独特型抗体（1g1b6f12、1d2f4b11）与cdln18.2单抗、cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
51.图3为抗cd47-cdn18.2双抗cldn18.2端的抗独特型抗体（15e5g6d1、3c3f10b5）与cdln18.2单抗、cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
52.图4为抗cd47-cdn18.2双抗cldn18.2端的抗独特型抗体（20e12e8h10）与cdln18.2单抗、cd47-cldn18.2双抗的特异性结合结果图；
53.图5为抗cd47-cdn18.2双抗cldn18.2端的抗独特型抗体的阻断活性结果图。
具体实施方式
54.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
55.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
56.实施例1
57.本实施例筛选制备抗cd47端的抗独特型抗体。
58.（1）免疫与细胞融合
59.采用5只balb/c雌鼠和5只c57雌鼠，抗cd47-cldn18.2双特异性抗体（cn115991784a中公开）经酶消化切成f(ab’)2，第0天向动物皮下注射含50 μg的f(ab’)2:完全弗氏佐剂（1:1，v:v），第14天通过皮下注射含25 μg f(ab’)2的不完全弗氏佐剂，第21
天采血并用elisa方法检测免疫动物血清，第28天通过皮下注射含25 μg f(ab’)2的不完全弗氏佐剂，第35天采血并用elisa方法检测免疫动物血清。当小鼠能够达到针对免疫原的免疫应答水平（od值》1.0，效价达到1:8,000），则无菌条件下取小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，采用电融合的方法与骨髓瘤细胞sp2/0进行2次细胞融合，每次融合的所有细胞都铺到96孔板中。
60.（2）单克隆抗体选择
61.用elisa方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对抗酶切产物f(ab’)2呈阳性的上清。在进行母克隆筛选时，采用间接elisa方法筛选所有针对cd47-cldn18.2双抗呈阳性的母克隆细胞上清，同时用人总igg和igg1同型对照抗体进行反筛。
62.（3）经有限稀释克隆杂交瘤
63.采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，以确保这些阳性母克隆分别来自于单个母克隆细胞。将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集上清。在亚克隆阶段得到10株阳性母克隆，克隆号分别为15g11e11a12、29a1c6b10、6e7c8g4、26c1e8a6、19a2c8d6、9f6d6e7、27a11b4b10、1e9b7a8、23f4d9b2、30d12d3b5，并均能稳定生长。其中23f4d9b2、30d12d3b5为非阻断非竞争型，其它为阻断型。
64.（4）抗体生产
65.将杂交瘤细胞进行扩大培养，取6周龄左右的小鼠，腹腔注射0.5 ml石蜡油，一周后腹腔注射2
×
106个杂交瘤细胞，注射后7天可见小鼠腹部明显变大，收集腹水，离心取上清，获得单克隆抗体腹水，使用蛋白质a亲和层析方法进行纯化抗独特型抗体。
66.实施例2
67.本实施例采用间接elisa方法检测抗独特型抗体与cd47-cldn18.2双抗的特异性结合。
68.克隆号为15g11e11a12、29a1c6b10、6e7c8g4、26c1e8a6、19a2c8d6、9f6d6e7、27a11b4b10、1e9b7a8、23f4d9b2和30d12d3b5的抗独特型抗体在此实验中验证。分别采用抗人cd47-cldn18.2双抗的人源化抗体、人源igg抗体和人源igg1抗体包被至elisa反应孔，每孔加量为100 μl，浓度为1.0
ꢀµ
g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；采用pbs将抗独特型抗体进行3倍系列稀释，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入过氧化物酶标山羊抗鼠igg抗体，在25℃静置30 min，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入反应底物，在25℃避光显色10-15 min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
69.由表1和图1a-图1e可知，15g11e11a12、29a1c6b10、6e7c8g4、26c1e8a6、19a2c8d6、9f6d6e7、27a11b4b10、1e9b7a8、23f4d9b2和30d12d3b5抗独特型抗体仅与抗人cd47-cldn18.2双抗的人源化抗体结合，不结合人源igg抗体和人源igg1抗体，表明抗独特型抗体可以特异性结合cd47-cldn18.2双抗。
70.表1
71.72.[0073][0074]
注：a: 抗人cd47/cldn18.2的双抗；b: human igg；c: human igg1。
[0075]
实施例3
[0076]
本实施例采用阻断elisa方法检测抗独特型抗体的阻断活性。
[0077]
15g11e11a12、29a1c6b10、6e7c8g4、26c1e8a6、19a2c8d6、9f6d6e7、27a11b4b10、1e9b7a8、23f4d9b2和30d12d3b5抗独特型抗体在此实验中验证。采用含his标签的人源cd47抗原包被至elisa反应孔，每孔加量为100 μl，浓度为0.5
ꢀµ
g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入上述抗独特型抗体，每孔加量为50 μl，浓度为10
ꢀµ
g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入抗人cd47-cldn18.2双抗的人源化抗体，每孔加量为50 μl，浓度为1000 ng/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入小鼠抗人igg fc片段酶结合物igg-hrp，在25℃静置30 min，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入反应底物，在25℃避光显色13 min，加终止液，用酶标仪检测吸光值，阻断率= (1-样品od
450
值/阻断 buffer平均od
450
值)
ꢀ×
100%。
[0078]
由表2可知，15g11e11a12、29a1c6b10、6e7c8g4、26c1e8a6、19a2c8d6、9f6d6e7、27a11b4b10、1e9b7a8、23f4d9b2和30d12d3b5抗独特型抗体阻断率分别为81.27%、93.27%、92.61%、70.76%、85.75%、92.31%、92.88%、86.81%、-6.58%和15.8%，表明15g11e11a12、29a1c6b10、6e7c8g4、26c1e8a6、19a2c8d6、9f6d6e7、27a11b4b10、1e9b7a8抗独特型抗体均可以有效阻断抗cd47-cldn18.2双抗结合到cd47抗原。
[0079]
表2
[0080]
[0081]
实施例4
[0082]
本实施例制备抗cldn18.2端的抗独特型抗体。
[0083]
（1）免疫与细胞融合
[0084]
抗cd47-cldn18.2双特异性抗体经药物酶切掉fc，酶切产物vhh偶联klh载体蛋白作为免疫原。用vhh+klh常规免疫10只小鼠，5只balb/c小鼠和5只c57 小鼠。第0天向动物皮下注射含50 μg的免疫原:完全弗氏佐剂（1:1，v:v），第14天通过皮下注射含25 μg免疫原的不完全弗氏佐剂，第21天采血并用elisa方法检测免疫动物血清，第28天通过皮下注射含25 μg 免疫原的不完全弗氏佐剂，第35天采血并用elisa方法检测免疫动物血清。当小鼠能够达到针对免疫原的免疫应答水平（od值》1.0，效价达到1:8,000），则无菌条件下取小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，采用电融合的方法与骨髓瘤细胞sp2/0进行2次细胞融合,每次融合的所有细胞都铺到96孔板中。
[0085]
（2）单克隆抗体选择
[0086]
用elisa方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对抗vhh-fc全长抗体药物呈阳性的上清。在进行母克隆筛选时，采用间接elisa方法筛选所有针对bc007双抗的阳性母克隆细胞上清，同时用人总igg和igg1同型对照抗体进行反筛。
[0087]
（3）经有限稀释克隆杂交瘤
[0088]
采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，以确保这些阳性母克隆分别来自于单个母克隆细胞。将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集上清。在亚克隆阶段得到5株阳性母克隆，克隆号分别为1g1b6f12、1d2f4b11、15e5g6d1、3c3f10b5、和20e12e8h10，并均能稳定生长。
[0089]
（4）抗体生产和配对
[0090]
将杂交瘤细胞进行扩大培养，取6周龄左右的小鼠，腹腔注射0.5 ml石蜡油，一周后腹腔注射2
×
106个杂交瘤细胞，注射后7天可见小鼠腹部明显变大，收集腹水，离心取上清，获得单克隆抗体腹水，使用蛋白质a亲和层析方法进行纯化抗独特型抗体，对抗体进行基于夹心elisa的配对实验，确认配对检测的效果。
[0091]
实施例5
[0092]
本实施例采用间接elisa方法检测抗独特型抗体与cldn18.2单抗和cd47-cldn18.2双抗的特异性结合。
[0093]
克隆号为1g1b6f12、1d2f4b11、15e5g6d1、3c3f10b5、和20e12e8h10的抗独特型抗体在此实验中验证。分别采用抗人cldn18.2单抗、抗人cd47-cldn18.2双抗的人源化抗体、人源igg抗体和人源igg1抗体包被至elisa反应孔，每孔加量为100 μl，浓度为1.0
ꢀµ
g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；采用pbs将抗独特型抗体进行3倍系列稀释，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入过氧化物酶标山羊抗鼠igg抗体，在25℃静置30 min，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入反应底物，在25℃避光显色13 min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
[0094]
由表3和图2-图4可知，1g1b6f12、1d2f4b11、15e5g6d1、3c3f10b5、和20e12e8h10抗独特型抗体仅与抗人cldn18.2单抗和抗人cd47-cldn18.2双抗结合，不结合人源igg抗体和人源igg1抗体，表明抗独特型抗体可以特异性结合cldn18.2和cd47-cldn18.2双抗。
[0095]
表3
[0096][0097][0098]
实施例6
[0099]
本实施例采用阻断facs方法检测抗独特型抗体的阻断活性。
[0100]
1g1b6f12、1d2f4b11、15e5g6d1、3c3f10b5和20e12e8h10抗独特型抗体在此实验中
验证。分别采用融合血清作为阳性对照、鼠igg作为同型对照、pbs作为阴性对照、样品孔加入相应的抗独特性抗体；药物采用抗cldn18.2抗体（工作浓度为0.1 ug/ml）。25
ꢀµ
l抗独特型抗体与25
ꢀµ
l药物在4℃孵育40 min，离心，弃去孔内液体后，用150
ꢀµ
l pbs润洗，300 g离心3 min，重复2次。采用过表达cldn18.2-hek293细胞作为检测细胞系，随后每管加入检测细胞孵育40 min，1
×
105个/50
ꢀµ
l/管。孵育完成用150
ꢀµ
l pbs润洗，300 g离心3 min，重复2次。加入alexa fluor
®ꢀ
647 标记的山羊抗人igg作为二抗，4℃孵育40 min，上机检测。
[0101]
结果如图5所示，1g1b6f12、1d2f4b11、15e5g6d1、3c3f10b5、和20e12e8h10抗独特型抗体可阻断抗cldn18.2抗体与过表达cldn18.2-hek293细胞结合。
[0102]
实施例7
[0103]
本实施例利用夹心elisa方法检测抗独特型抗体的配对。
[0104]
取来源于实施例1和4的独特型抗体，在此实验中验证。上述一种抗独特型抗体包被至elisa反应孔，浓度为2.0
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g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；采用pbs将抗人cd47-cldn18.2的人源化抗体进行10倍系列稀释，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入另一端的抗独特性抗体，浓度为1.0
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g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入streptavidin-hrp，在25℃静置30 min，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入反应底物，在25℃避光显色14 min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
[0105]
由表4和表5的配对结果显示可知15e5g6d1和1g1b6f12为最佳配对抗独特型抗体。30d12d3b5和15e5g6d1为非竞争包被的一组，可用来检总药含量。
[0106]
抗独特型抗体包被至elisa反应孔，浓度为2.0
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g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；采用pbs将抗人cd47-cldn18.2的人源化抗体进行10倍系列稀释，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入实施例6中获得的抗cd47-cldn18.2双抗的cldn18.2端的抗独特性抗体，浓度为1.0
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g/ml，在25℃静置1 h，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入streptavidin-hrp，在25℃静置30 min，弃去孔内液体后，用pbs进行清洗；加入反应底物，在25℃避光显色12 min，加终止液，用酶标仪检测吸光值。
[0107]
由表4（包被cd47端独特型抗体）和表5（包被cldn18.2端独特型抗体）的配对结果显示可知多株独特型抗体的组合均具有优良的特异性和灵敏度，涉及cd47端独特型抗体包括1e9b7a8、15g11e11a12、30d12d3b5，涉及的cldn18.2端独特型抗体包括1g1b6f12、15e5g6d1，其中30d12d3b5和15e5g6d1为非竞争包被的一组，可在药代研究中用来检测血液中药物含量，且不受游离抗原影响，该组合进行后续测序。
[0108]
表4
[0109]
[0110][0111]
表5
[0112]
[0113][0114]
综上所述，本发明中针对抗cd47-cldn18.2特异性抗体na3s-h1开发能够有效识别其的抗独特型抗体，所述抗独特型抗体能够与抗cd47-cldn18.2双抗特异性结合，可用于夹心elisa法定量分析抗cd47-cldn18.2抗体，监测评估抗cd47-cldn18.2双抗的代谢过程等，为临床试验的生物分析提供有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
[0115]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体，其特征在于，所述抗独特型抗体包括第一抗独特型抗体和/或第二抗独特型抗体；所述第一抗独特型抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示，轻链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示；所述第二抗独特型抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9所示，轻链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.10、seq id no.11和seq id no.12所示。2.根据权利要求1所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体，其特征在于，所述第一抗独特型抗体的重链的氨基酸序列包括seq id no.13所示的序列，轻链的氨基酸序列包括seq id no.14所示的序列；所述第二抗独特型抗体的重链的氨基酸序列包括seq id no.15所示的序列，轻链的氨基酸序列包括seq id no.16所示的序列。3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的核酸分子。5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的核酸分子。6.如权利要求1或2所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体在制备检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的产品中的应用。7.一种检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体。8.如权利要求1或2所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体在检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体中的应用。9.一种检测抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：基于酶联免疫吸附测定法，利用权利要求1或2所述的抗cd47-cldn18.2双特异性抗体的抗独特型抗体进行检测。

技术总结
本发明公开了抗CD47-CLDN18.2双特异性抗体的抗独特型抗体及其制备方法和应用。本发明开发识别抗CD47-CLDN18.2双抗的抗独特型抗体，能够应用于临床前研究中抗CD47-CLDN18.2双抗药物的定量检测，是药代动力学（PK）和免疫原性（ADA）分析的重要试剂。为临床试验的生物分析提供有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。大的市场价值。大的市场价值。


技术研发人员：张瑞霞 金蕊 冯伟民
受保护的技术使用者：宝船生物医药科技（上海）有限公司
技术研发日：2023.08.25
技术公布日：2023/10/8