一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法与流程

1.本发明涉及培养基技术领域，特别涉及一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是来源于中胚层的一类多能干细胞，最早从骨髓中分离得到，因其易于在体外扩增，无致瘤性，在免疫调节及组织再生方面显示出强大的临床应用前景。mscs主要有两个特征：自我更新和分化潜能；同时它还可分泌一些重要的细胞因子，表达特异性受体，能够被基因修饰，从而改变其自然行为的分子易感性。因此，mscs日益受到人们的关注。许多学者先后从人脐带华通氏胶、脐带血管周围组织中通过不同方法分别分离获得类似细胞。
3.目前的间充质干细胞培养基配方中含有人血清或者动物血清，血清中未知成分较多，甚至有可能包括一些未知的过敏源和病原体，一方面会干扰实验结果，另一方面是无法保证其所培养的细胞的安全性，无法应用于临床研究。现有的无血清培养基成分过于复杂，且细胞扩增效果并不理想，难以实现大规模体外扩增。
4.因此，成分确定、质量可控且适合进行间充质干细胞原代培养的无血清培养基是临床应用msc培养的必然选择。本发明的目的是提供一种扩增效果显著，安全性高，适合培养临床应用的间充质干细胞的无血清培养基。


技术实现要素：

5.针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法。所述无血清培养基成分确定，可避免血清对细胞培养的干扰，且可有效促进间充质干细胞的体外扩增，凸显本发明所述无血清培养基具备突出培养优势。
6.具体而言，本发明首先提供了一种无血清培养基，其特征在于，包含：scf、epo、gm-csf、mcp-1、il-3、il-4、il-6、l-谷氨酰胺和基础培养基。
7.优选地，所述scf的浓度为20-50ng/ml。
8.优选地，所述epo的浓度为10-20ng/ml。
9.优选地，所述gm-csf的浓度为20-30ng/ml。
10.优选地，所述mcp-1的浓度为20-40ng/ml。
11.优选地，所述il-3的浓度为1-20ng/ml。
12.优选地，所述il-4的浓度为1-20ng/ml。
13.优选地，所述il-6的浓度为1-20ng/ml
14.优选地，所述l-谷氨酰胺5-10mm。
15.优选地，所述基础培养基为低糖dmem-f12。
16.本发明另一方面提供了一种无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
f12基础培养基，并配置为1l待用。
37.无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
38.1)以dmem-f12作为基础培养基；
39.2)按照配方依次称取scf、epo、gm-csf、mcp-1、il-3、il-4、il-6和l-谷氨酰胺，加入步骤1)dmem-f12培养基中，混合均匀直至无明显沉淀为止；
40.3)将步骤2)得到的混合液通过微孔滤膜过滤除菌，即可得到无血清培养基，并置于4℃保存。
41.实施例3
42.一种无血清培养基，其配方包括50ng/ml scf、20ng/ml epo、30ng/ml gm-csf、40ng/ml mcp-1、20ng/ml il-3、20ng/ml il-4、20ng/ml il-6、10mm l-谷氨酰胺，余量为dmem-f12基础培养基，并配置为1l待用。
43.制备方法包括如下步骤：
44.1)以dmem-f12作为基础培养基；
45.2)按照配方依次称取scf、epo、gm-csf、mcp-1、il-3、il-4、il-6和l-谷氨酰胺，加入步骤1)dmem-f12培养基中，混合均匀直至无明显沉淀为止；
46.3)将步骤2)得到的混合液通过微孔滤膜过滤除菌，即可得到无血清培养基，并置于4℃保存。
47.对比例1
48.一种无血清培养基，其配方与实施例2不同地方在于，其细胞因子是由50ng/ml scf、20ng/ml epo、30ng/ml gm-csf、40ng/ml mcp-1组成。
49.对比例2
50.一种无血清培养基，其配方与实施例2不同地方在于，其细胞因子是由20ng/ml il-3、20ng/ml il-4、20ng/ml il-6组成。
51.对比例3
52.一种无血清培养基，其配方与实施例2不同地方在于，其基础培养基中仅有10mm l-谷氨酰胺组成。
53.对比例4
54.一种无血清培养基，其配方与对比例1不同地方在于，其还含有10mm l-谷氨酰胺组成。
55.对比例5
56.一种无血清培养基，其配方与对比例2不同地方在于，其还含有10mm l-谷氨酰胺组成。
57.测试例1
58.在24孔板中逐一2ml上述实施例与对比例无血清培养基，每个处理重复3次。然后取脐带血间充质干细胞，经pbs清洗后调整细胞密度为5
×
104ce l l/ml，轻轻吹打均匀后分别取100μl接种于对应含有无血清培养基的孔板中，于37℃、5％co2的培养箱中培养。培养开始及第7天、14天、21天分别计算细胞扩增倍数。
59.统计结果如下表1所示：在本发明实施例2和3中，经过连续7天的培养，脐带血间充质干细胞的扩增倍数最高可达到1562.8倍，相比于其他对比例而言，本发明的无血清培养
基具备优越的细胞扩增能力。尤其是当细胞培养时间增加至21天后，脐带血间充质干细胞的扩增倍数最高可达到9956.2倍。充分证明本发明无血清培养基的扩增效果最好。
60.表1.脐带血间充质干细胞在无血清培养基中的细胞扩增倍数
61.组别7天14天21天实施例21562.8
±
100.27894.5
±
90.69956.2
±
151.4实施例31326.5
±
44.65643.2
±
120.78475.3
±
203.8对比例1152.3
±
50.5654.2
±
40.2842.1
±
56.7对比例230.2
±
9.557.9
±
10.2100.5
±
7.6对比例3359.5
±
21.5947.6
±
56.61000.1
±
84.4对比例4100.4
±
12.7356.2
±
25.5663.5
±
36.6对比例516.2
±
8.124.3
±
9.621.2
±
5.4
62.脐带血间充质干细胞在上述无血清培养基中的凋亡率分析，结果如表2所示：本发明实施例2和3中，脐带血间充质干细胞的凋亡率明显低于其他无血清培养基，且在连续21天的培养后凋亡率仅为8.2左右％，进一步证实本发明所述无血清培养基具备突出培养优势。
63.表2.脐带血间充质干细胞在无血清培养基中的凋亡情况(％)
64.组别7天14天21天实施例25.26.58.2实施例35.47.18.3对比例16.59.215.3对比例28.812.320.5对比例36.28.210.3对比例46.511.518.2对比例56.538.757.8
65.除上述脐带血间充质干细胞外，发明人还针对骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞进行了同样的细胞扩增倍数和凋亡率检测分析，结果与针对脐带间充质干细胞的试验分析结果相同。均证实本发明所述无血清培养基具备良好的扩增活性，可满足间充质干细胞的大批量生产和制备，提高间充质干细胞的临床利用效率。
66.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种无血清培养基，其特征在于，包含：scf、epo、gm-csf、mcp-1、il-3、il-4、il-6、l-谷氨酰胺和基础培养基。2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述scf的浓度为20-50ng/ml、所述epo的浓度为10-20ng/ml、所述gm-csf的浓度为20-30ng/ml、所述mcp-1的浓度为20-40ng/ml。3.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述il-3的浓度为1-20ng/ml、所述il-4的浓度为1-20ng/ml、所述il-6的浓度为1-20ng/ml、所述l-谷氨酰胺5-10mm。4.如权利要求1-3任一项所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为低糖dmem-f12。5.权利要求1-4任一项所述无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)以dmem-f12作为基础培养基；2)按照配方依次称取scf、epo、gm-csf、mcp-1、il-3、il-4、il-6和l-谷氨酰胺，加入步骤1)dmem-f12培养基中，混合均匀直至无明显沉淀为止；3)将步骤2)得到的混合液通过微孔滤膜过滤除菌，即可得到无血清培养基，并置于4℃保存。6.一种培养间充质干细胞的方法，其特征在于，将间充质干细胞接种于权利要求1-4任一项所述的无血清培养基中进行培养。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，培养的条件为37℃、5％co2。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，接种的细胞密度为1
×
10
4-1
×
105个/ml。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。10.权利要求1-4任一项所述无血清培养基在制备间充质干细胞产品中的用途。

技术总结
本发明提供了一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法。本发明提供的无血清培养基成分确定，可避免血清对细胞培养的干扰，减少过敏源；经证实，本发明的无血清培养基可有效促进间充质干细胞的体外扩增效率，提高其扩增倍数，同时间充质干细胞培养阶段的细胞凋亡率较低，有效提高了间充质干细胞的体外扩增成活率，充分证实本发明所述无血清培养基具备突出培养优势。出培养优势。


技术研发人员：肖碧波 杨安平 魏晓滨 陈鑫 肖景棠 杨海健 朱锐生
受保护的技术使用者：佛山市生物医学工程学会
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/8