一种文蛤源抗氧化肽及其筛选方法和应用

1.本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一种文蛤源抗氧化肽及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.自由基失衡导致的氧化应激，与炎症、癌症、心血管病、神经退行性疾病和衰老等多种慢性疾病的发生发展密切相关。文蛤是我国重要的药食两用原料，文蛤多肽具有抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂和免疫调节等多种功效，可以通过调控氧化应激延缓多种慢性疾病的发生。目前制备文蛤多肽多采用酶解方式，采用模拟胃肠消化制备得到的文蛤多肽，具有更高的安全性和生物可及性，然而目前上尚没有这方面研究。
3.生物信息学工具辅助筛选活性肽，是基于活性肽中已知的氨基酸序列，利用数据库搜索和软件分析，对肽段可能的生物活性、安全性及生物可及性等性质进行预测，选取目标肽段化学合成并对其相关性质进行验证。通过生物信息学工具能节省大量的时间成本和实验成本，但是目前尚没有研究利用生物信息学工具筛选文蛤抗氧化肽。
4.抗氧化肽活性评价方法有很多，目前应用对广泛的是dpph法(gb/t39100-2020第一法)、abts法(gb/t 39100-2020第二法)和orac法(国际通用方法)，也有研究通过细胞氧化应激损伤模型评价抗氧化肽的生物学活性。
5.生物活性肽是蛋白质水解释放或由生物工程等方法制得的2-20个氨基酸组成的多肽类物质，相对分子质量小于6000da。在加工、酶解、发酵或胃肠消化过程中，食物可以释放生物活性肽。食源性活性肽具有多种生理功能，如抗疲劳、降血压、提高免疫力、降血脂、抗菌、激素调节等。食源性活性肽易被人体消化吸收，溶解性好，食用安全性高，是目前热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。
6.目前化工领域常用抗氧化剂多为化学合成物，而临床还原型谷胱甘肽的产业化壁垒较高，现在国内制药企业所用的谷胱甘肽制药原料还不能摆脱进口，谷胱甘肽价格一直居高不下。可见，活性佳、易合成、产量高的新型抗氧化肽已在医疗、食品、化妆品等领域中亟待开发。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一在于提供一种文蛤源抗氧化肽。
8.本发明的目的之二在于提供上述文蛤源抗氧化肽的筛选方法。
9.本发明的目的之三在于提供上述文蛤源抗氧化肽的应用。
10.为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
11.一种文蛤源抗氧化肽，所述抗氧化肽的序列为wlv(trp-leu-val)，该抗氧化肽由3个氨基酸组成，分子量为416.24236da。该肽具有较高的抗氧化活性，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当。
12.上述文蛤源抗氧化肽的筛选方法，包括如下步骤：
13.(1)文蛤肉匀浆液的制备：取一定量文蛤肉洗净擦干，于高速组织捣碎机匀浆3次，每次30s，获得匀浆液；
14.(2)infogest体外静态模拟消化模型：首先，按体积比1∶1的比例加入模拟唾液，在37℃100rpm恒温振荡器里消化2min，模拟口腔消化；然后，利用1mol/l的盐酸溶液调节ph至3.0，终止口腔消化过程，按体积比1∶1的比例加入模拟胃液，混合均匀，恒温振荡消化2h，模拟胃消化，实验过程中，以1mol/l盐酸溶液控制消化液ph在3.0；最后，利用碳酸氢钠溶液调节ph至6.0，终止胃消化过程，按体积比1∶1的比例加入模拟肠液，混合均匀，再利用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.0，恒温振荡消化2h，模拟肠消化；
15.(3)文蛤蛋白肽序列鉴定：通过赛默飞easy-nlc1200 q exactive液质联用系统对文蛤蛋白模拟消化产物进行肽谱鉴定；
16.(4)生物信息学工具辅助文蛤抗氧化肽的筛选：通过peptide ranker工具进行肽的生物活性进行预测，得分超过0.5的序列认为存在潜在活性，通过biopep数据库对肽的新颖性进行查询，通过peptide cutter工具和cpp pred工具对肽的耐消化特性和细胞膜穿透性进行预测，得分超过0.5的序列，认为具有完整跨膜吸收的潜力，通过aller top v.2.0工具对肽的潜在过敏性进行预测，通过toxin pred工具对肽的潜在毒性和理化性质进行预测，不存在潜在过敏性和毒性的序列进行后续的合成和验证；
17.(5)抗氧化活性的测定：进行体外抗氧化活性检测，包括dpph法、abts法、orac法及h2o2诱导raw 264.7细胞氧化损伤模型，找到抗氧化活性最强的肽段。
18.其中，所述模拟唾液为：α-淀粉酶ec 232-565-6，终浓度150u/ml；所述模拟胃液为：胃蛋白酶ec 3.4.23.1和胃脂肪酶ec 3.1.1.3，终浓度分别为4000u/ml和120u/ml；所述模拟肠液为：胰酶ec 3.4.21.4终浓度200u/ml，牛胆盐终浓度20mmol/ml。
19.优选地，步骤(1)对文蛤肉匀浆后需要将匀浆液置于实验冷柜中或立即进行后续实验，避免长期放在室温下导致蛋白及多肽类组分降解。
20.优选地，步骤(3)具体为：利用nano-hplc液相系统easy-nlc 1200分离后用q-exactive质谱仪对步骤(2)中获得的组分进行质谱分析；获得的质谱数据使用软件maxquant进行分析，并将所得多肽序列与uniprot数据库进行对比获取肽序列的蛋白来源。
21.本发明的文蛤源抗氧化肽，可通过固相合成方法合成和生产，包括但不限于fmoc-spps方式、boc-spps方式、片段缩合连接方式，可以利用一切可以合成的方法进行，从而更高效的获得文蛤源抗氧化肽，为该条多肽的进一步利用提供材料。
22.本发明的文蛤源抗氧化肽，可以应用在抗氧化药物、食品及化妆品中。所述的药物是以有效量的文蛤源抗氧化肽为活性成分，加上医学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
23.本发明的优点：
24.本发明基于infogest体外静态模拟消化模型及生物信息学工具，在文蛤中筛选到一个抗氧化肽，具有较强的抗氧化活性，并且其肽段由3个氨基酸组成，肽段较短，易于消化吸收，对新型抗氧化产品的开发具有重要的意义。
25.本发明还公开了一种新的抗氧化肽的筛选方法，主要经历模拟消化、lc-ms/ms质谱鉴定、生物信息学工具分析预测、多肽合成及活性验证筛选得到。通过肽谱鉴定从文蛤模拟消化产物中共得到105条序列，其中有18条活性序列已报到，其余87条未报道序列中有17
条peptide ranker评分超过0.5。综合考虑潜在活性、安全性及生物可及性后筛选序列进行验证。经过体外抗氧化实验和细胞氧化应激损伤实验证明，多肽wlv的抗氧化活性最佳，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当，通过本发明的筛选方法，可以保证从食源性蛋白中制备活性多肽的安全性及有效性，可作为抗氧化剂添加至食品、药品和化妆品等功能性产品中。
附图说明
26.图1为本发明实施例中文蛤抗氧化肽的制备技术路线图；
27.图2为本发明实施例中多肽wlv的液相检测结果图；
28.图3为本发明实施例中多肽wlv的质谱检测结果图；
29.图4为本发明实施例中多肽wlv清除dpph自由基活性结果图(还原型谷胱甘肽为对照)；
30.图5为本发明实施例中多肽wlv清除abts自由基活性结果图(还原型谷胱甘肽为对照)；
31.图6为本发明实施例中多肽wlv的orac活力结果图；
32.图7为还原型谷胱甘肽的orac活力结果图；
33.图8为本发明实施例中多肽wlv缓解h2o2诱导raw 264.7细胞氧化应激损伤结果图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
35.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
36.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
37.实施例1文蛤源抗氧化肽的筛选方法
38.制备技术路线如图1所示，其中文蛤体外模拟消化表示利用infogest体外静态模拟消化模型消化文蛤肉。具体步骤为：
39.(1)基于infogest体外静态模拟消化模型消化文蛤肉：首先，取一定量文蛤肉洗净擦干，于高速组织捣碎机匀浆3次，每次30s，获得匀浆液。其次，按体积比1：1的比例加入的模拟唾液(α-淀粉酶ec 232-565-6终浓度150u/ml)，在37℃100rpm恒温振荡器里消化2min，模拟口腔消化；然后，利用1mol/l的盐酸溶液调节ph至3.0，终止口腔消化过程，按体积比1：1的比例加入模拟胃液(胃蛋白酶ec 3.4.23.1和胃脂肪酶ec 3.1.1.3终浓度分别为4000u/ml和120u/ml)混合均匀，恒温振荡消化2h，模拟胃消化(实验过程中，以1mol/l盐酸溶液控制消化液ph在3.0左右)；最后，利用碳酸氢钠溶液调节ph至6.0，终止胃消化过程，按体积比1：1的比例加入模拟肠液(胰酶ec 3.4.21.4终浓度200u/ml，牛胆盐终浓度20mmol/ml)混合
均匀，再利用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.0，恒温振荡消化2h，模拟肠消化(实验过程中，注意控制消化液ph在7.0左右)。
40.(2)lc-ms/ms鉴定多肽序列：质谱数据采集使用的是nano-hplc液相系统easy-nlc 1200(thermo fisher scientific)分离后用q-exactive质谱仪(thermo fisher scientific)。c
18
捕获柱(内径100μm，长度2cm，5-μm c18；sc001，thermo fisher scientific)和c
18
分析柱(内径75μm，长度10cm，3-μm c18；sc2003，thermo fisher scientific)上进行分析。两个流动相是缓冲液a(0.1％甲酸/99.9％水)和缓冲液b(80％乙腈/1％甲酸/19％水)，90min时间缓冲液b的比例从4％上升至100％，流速为250nl/min。以70000的分辨率在m/z 200处进行扫描，扫描范围设置为400至1700m/z，选取了10个最丰富的ms1特征，以17500的分辨率在m/z 200处进行高能碰撞解离破碎。离子注入时间和离子目标值分别设置为20ms和3e6(测量扫描)和60ms和5e5(质谱/质谱扫描)。使用xcalibur软件(thermo scientific)获取数据。
41.(3)生物信息学工具辅助筛选文蛤抗氧化肽：
42.首先通过peptide ranker工具进行肽的生物活性进行预测，得分超过0.5的序列认为存在潜在活性；通过biopep数据库对肽的新颖性进行查询，已有活性报道的序列不再进行后续合成和验证；通过peptide cutter工具对肽的耐消化特性进行预测，如果序列中不存在能够被胃蛋白酶(pepsinph 1.3和ph》2.0，ec 3.4.23.1)、胰蛋白酶(trypsin，ec 3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin，ec 3.4.21.1)切割的位点，则认为该序列具有抗胃肠道消化的潜力；通过cpp pred工具对肽的细胞膜穿透性进行预测，得分超过0.5的序列，认为具有完整跨膜吸收的潜力；通过aller top v.2.0工具对肽的潜在过敏性进行预测，通过toxin pred工具对肽的潜在毒性和理化性质进行预测，认为不存在潜在过敏性和毒性的序列方可进行后续的合成和验证，文蛤infogest模拟消化产物肽谱见表1，筛选到的潜在文蛤抗氧化肽序列见表2。
43.表1文蛤infogest模拟消化产物肽谱
44.45.46.47.[0048][0049]
表2筛选到的潜在文蛤抗氧化肽序列及其性质预测
[0050]
[0051][0052]
选取上述序列进行合成，通过dpph法、abts法及orac法对多肽活性进行初步验证，发现仅wlv序列表现出良好的抗氧化活性。
[0053]
实施例2活性序列的化学合成及活性验证
[0054]
按照实施例1中的质谱测序结果，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行化学合成，合成多肽的液相检测结果和质谱检测结果分别如图2、图3所示。
[0055]
分别选用dpph法、abts法、orac法及h2o2诱导raw 264.7细胞氧化应激损伤模型对wlv的抗氧化活性进行验证，以同浓度的还原型谷胱甘肽作为对照。
[0056]
(1)wlv清除dpph自由基的能力
[0057]
参考国标gb/t 39100-2020多肽抗氧化性测定第一法dpph法测定文蛤抗氧化肽wlv清除dpph自由基的能力，结果如图4所示，wlv清除dpph自由基的能力逊于同浓度还原型谷胱甘肽。
[0058]
(2)wlv清除abts自由基的能力
[0059]
参考国标gb/t 39100-2020多肽抗氧化性测定第二法abts法测定文蛤抗氧化肽wlv清除abts自由基的能力，结果如图5所示，wlv清除abts自由基的能力基本与同浓度还原型谷胱甘肽相当。
[0060]
(3)wlv的orac活力
[0061]
分别配置75mmol/l ph 7.4的磷酸盐缓冲液、40mmol/l的aaph(2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)溶液、117nm的fl(荧光素钠)稀释液以及20mm的trolox(水溶性维生素e类似物)储备液。
[0062]
吸取fl溶液120μl于96空荧光板中，随后加入不同浓度的文蛤抗氧化肽wlv、还原型谷胱甘肽溶液或trolox溶液20μl震荡5min，37℃孵育15min后迅速加入aaph溶液60μl启动反应，以激发波长485nm，发射波长520nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔1.5min测定一次荧光值(记为fn)。以测定时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制不同浓度受试物荧光衰变曲线。
[0063]
测定结果以orac值表示，计算公式为：
[0064]
orac(μmol te/mg)＝[(aucs-auc
+aaph
)/(auc
t-auc-apph
)]
×mt
/ms[0065]
其中auc表示每组荧光曲线下面积，m
t
和ms分别为trolox与待测样品溶液的浓度(trolox-μmol/ml，样品mg/ml)。
[0066]
文蛤抗氧化肽wlv及还原型谷胱甘肽的荧光衰变曲线分别如图6、图7所示，可见wlv的orac活力明显优于还原型谷胱甘肽，经计算wlv与还原型谷胱甘肽的orac值分别为
604.83
±
22.04μmol te/mg和125.80
±
2.33μmol te/mg。
[0067]
注：由于文蛤抗氧化肽wlv的orac活性较高，为了数据的准确性，此处文蛤抗氧化肽wlv的作用浓度选择0.0025mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml和0.02mg/ml，还原型谷胱甘肽作用浓度选择0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml和0.04mg/ml。
[0068]
(4)wlv缓解h2o2诱导raw 264.7细胞氧化应激损伤的能力
[0069]
建立h2o2诱导raw 264.7细胞氧化损伤模型，通过不同浓度的文蛤抗氧化肽wlv和还原型谷胱甘肽干预发现，二者对于氧化应激导致的raw 264.7细胞存活率的降低(模型组细胞存活率约为50％)均有一定的恢复作用，且wlv缓解细胞氧化损伤的能力与同浓度还原型谷胱甘肽相当，结果如图8所示。
[0070]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

技术特征：
1.一种文蛤源抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽的序列为trp-leu-val。2.如权利要求1所述的文蛤源抗氧化肽，其特征在于，该抗氧化肽的分子量为416.24236da。3.如权利要求1所述的文蛤源抗氧化肽作为抗氧化剂的应用。4.如权利要求1所述的文蛤源抗氧化肽在制备抗氧化药物、食品及化妆品中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物是以有效量的文蛤源抗氧化肽为活性成分，加上医学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。6.一种权利要求1所述的文蛤源抗氧化肽的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)文蛤肉匀浆液的制备：取一定量文蛤肉洗净擦干，于高速组织捣碎机匀浆3次，每次30s，获得匀浆液；(2)infogest体外静态模拟消化模型：首先，按体积比1∶1的比例加入模拟唾液，在37℃100rpm恒温振荡器里消化2min，模拟口腔消化；然后，利用1mol/l的盐酸溶液调节ph至3.0，终止口腔消化过程，按体积比1∶1的比例加入模拟胃液，混合均匀，恒温振荡消化2h，模拟胃消化，实验过程中，以1mol/l盐酸溶液控制消化液ph在3.o；最后，利用碳酸氢钠溶液调节ph至6.0，终止胃消化过程，按体积比1∶1的比例加入模拟肠液，混合均匀，再利用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.0，恒温振荡消化2h，模拟肠消化；(3)文蛤蛋白肽序列鉴定：通过赛默飞easy-nlc1200 q exactive液质联用系统对文蛤蛋白模拟消化产物进行肽谱鉴定；(4)生物信息学工具辅助文蛤抗氧化肽的筛选：通过peptide ranker工具进行肽的生物活性进行预测，得分超过0.5的序列认为存在潜在活性，通过biopep数据库对肽的新颖性进行查询，通过peptide cutter工具和cpp pred工具对肽的耐消化特性和细胞膜穿透性进行预测，得分超过0.5的序列，认为具有完整跨膜吸收的潜力，通过aller top v.2.0工具对肽的潜在过敏性进行预测，通过toxin pred工具对肽的潜在毒性和理化性质进行预测，不存在潜在过敏性和毒性的序列进行后续的合成和验证；(5)抗氧化活性的测定：进行体外抗氧化活性检测，包括dpph法、abts法、orac法及h2o2诱导raw 264.7细胞氧化损伤模型，找到抗氧化活性最强的肽段。7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述模拟唾液为：α-淀粉酶ec 232-565-6，终浓度150u/ml；所述模拟胃液为：胃蛋白酶ec 3.4.23.1和胃脂肪酶ec 3.1.1.3，终浓度分别为4000u/ml和120u/ml；所述模拟肠液为：胰酶ec 3.4.21.4终浓度200u/ml，牛胆盐终浓度20mmol/ml。8.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)对文蛤肉匀浆后需要将匀浆液置于实验冷柜中或立即进行后续实验，避免长期放在室温下导致蛋白及多肽类组分降解。9.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)具体为：利用nano-hplc液相系统easy-nlc 1200分离后用q-exactive质谱仪对步骤(2)中获得的组分进行质谱分析；获得的质谱数据使用软件maxquant进行分析，并将所得多肽序列与uniprot数据库进行对比获取肽序列的蛋白来源。

技术总结
本发明公开了一种文蛤源抗氧化肽及其筛选方法和应用，通过体外模拟消化、LC-MS/MS肽谱鉴定、生物信息学工具预测、多肽合成及活性验证，得到抗氧化活性最佳的抗氧化肽序列为WLV(Trp-Leu-Val)。本发明所述文蛤源抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，并且其肽段由3个氨基酸组成，肽段较短，易于消化吸收，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当。并且通过本发明的筛选方法，可以保证从食源性蛋白中制备活性多肽的安全性及有效性，得到的抗氧化肽可以作为抗氧化添加剂应用至食品、药品和化妆品在内的功能性产品中，对新型抗氧化产品的开发具有重要的意义。要的意义。要的意义。


技术研发人员：杜超 王平 赵华伟 惠珍珍 李娜 王晓萱
受保护的技术使用者：鲁东大学
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/10/8