一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及其应用。


背景技术：

[0002]2’‑
氟-2
’‑
脱氧腺苷(2
’‑
fluoro-2
’‑
deoxyadenosine,2’f-da)是2
’‑
脱氧腺苷的类似物，其作为反义核苷酸和小干扰rna的组成部分，已被证明比其他c2’修饰的核苷酸具有更好的疾病治疗效果。目前，2’f-da的合成主要是通过化学方法合成，但是在化学合成条件苛刻需要对重要基团进行保护与脱保护，并且反应过程中使用了大量的有毒有机试剂造成环境污染，除此之外，产物的立体选择性也不理想，使得提纯工艺更为复杂；而酶法合成2’f-da由于反应条件温和，无需使用有毒有机试剂，对环境友好，以及产物具有高度的立体选择性，被越来越受重视。
[0003]
现有技术中通过以下几种方式催化合成2’f-da：（1）通过使用来源于lactobacillus reuteri 的2
’‑
脱氧核糖转移酶(lrndt)合成2’f-da，但是转化率极低，完全不能满足工业的生产需求。
[0004]
（2）利用不同来源的胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(tp)与嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)作为生物催化剂，催化2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷(2’f-du)与腺嘌呤进行转糖基化反合成2’f-da，但其转化率仍不理想，其主要原因是天然的pnp对含f的修饰类核苷的催化活性不理想。
[0005]
（3）通过对关键酶escherichia coli来源的pnp的167和168位置氨基酸残基进行饱和突变；筛选到的突变体可以提高催化效率与热稳定性，但就工业化应用而言，嘌呤核苷磷酸化酶的催化性能仍不能达到需求。
[0006]
采用以上几种方式催化合成2’f-da，虽然在性能上有了一定的改善，但是从工业化应用而言，嘌呤核苷磷酸化酶的催化性能仍不能满足工业的生产需求。因此，如何利用蛋白质工程对关键酶pnp进行进一步改性，从而可以提高2’f-da转化率，降低生产成本成为众多厂家所要解决的问题。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术的不足，本技术提供了一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及其应用；本技术的目的在于筛选可以提高2’f-da转化率的pnp突变体；从而提高pnp的热稳定性，在较高温度下催化2’f-da的合成，使得底物溶解度增加。
[0008]
第一方面，本技术提供一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，采用如下的技术方案：一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，所述突变体是由大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶经过氨基酸位点突变后得到，突变位点为下述位点中至少一处：第90位甘氨酸突变成丝氨酸、第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺或第90位甘氨酸突变成苏氨酸。
[0009]
优选的，突变位点为以下任意一种：（1）第90位甘氨酸突变成丝氨酸；
（2）第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺；（3）第90位甘氨酸突变成苏氨酸；（4）第90位甘氨酸突变成丝氨酸、第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺。
[0010]
更优选的，突变位点为第90位甘氨酸突变成丝氨酸和第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺。
[0011]
嘌呤核苷磷酸化酶突变体的氨基酸序列为seq id no.4所示。
[0012]
大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0013]
本技术通过定向改造获得来源escherichia coli的嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，ecpnp）的组合突变体g90s/e182q，该组合突变体热稳定性得到了提高，合成2
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氟-2
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脱氧腺苷的产率也得到提高。
[0014]
第二方面，本技术提供一种编码嘌呤核苷磷酸化酶突变体的基因，采用如下的技术方案：一种编码嘌呤核苷磷酸化酶突变体的基因；嘌呤核苷磷酸化酶突变体的核苷酸序列为seq id no.5所示。
[0015]
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
[0016]
一种重组载体，重组载体包含上述编码基因；重组载体以pcold i为表达载体。
[0017]
一种重组菌，重组菌包含上述重组载体，菌为大肠杆菌bl21(de3)菌株。
[0018]
第三方面，本技术提供一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌在制备2
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氟-2
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脱氧腺苷中的应用，采用如下的技术方案：嘌呤核苷磷酸化酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌在制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧腺苷中的应用。
[0019]
第四方面，本技术提供一种2
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氟-2
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脱氧腺苷的制备方法，采用如下的技术方案：一种2
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氟-2
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脱氧腺苷的制备方法，制备步骤如下：在反应体系中加入2'f-du、腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷磷酸化酶、磷酸盐缓冲液以及上述嘌呤核苷磷酸化酶突变体进行反应，得到2
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氟-2
’‑
脱氧腺苷。
[0020]
本技术中以来源于escherichia coli的tp和来源escherichia coli的pnp为催化剂，以2’f-du和腺嘌呤为底物级联反应获得2’f-da；又以pnp作为研究对象，通过同源建模和分子对接技术，分析了活性口袋半径5
å
范围内的关键氨基酸残基，通过虚拟筛选发掘能提高酶催化活性的热点氨基酸。对位点g21、h63、g64、m65、g66、r88、v89、g90、s91、c92、f160、e180、m181、e182和c201进行虚拟饱和突变，将其中与底物2
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氟-2
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脱氧核糖-1-磷酸(2’f-r1p)亲和力提高最多的突变点进行实验验证，发现单点突变g90s、g90t和e182q催化2’f-da合成转化率均高于野生型，相对于野生型酶pnp分别提高了41.5%、20%和32.5%；然后对优异的单突变体进行组合突变，发现组合突变体g90s/e182q的催化2’f-da合成转化率，相对于野生型酶pnp提高了62.5%；并且该突变体在50℃下孵育24h后，其酶活仍保留90%。本技术所筛选到pnp突变体比野生型酶具有更高的催化活性以及热稳定性，能够完全满足工业应用需求，将其应用于催化反应中能够提高2’f-da产物的生产效率，同时降低了生产成本。
[0021]
综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：
本技术中通过对pnp定向改造所获得突变体g90s/e182q催化2’f-da合成转化率，相对于野生型酶pnp提高了62.5%；并且该突变体在50℃下孵育24h后，其酶活仍保留90%；本技术所筛选到pnp突变体比野生型酶具有更高的催化活性以及热稳定性，能够完全满足工业应用需求，将其应用于催化反应中能够提高2’f-da产物的生产效率，同时降低了生产成本。
附图说明
[0022]
图1为表达载体pcold i-ectp的构建示意图；图2为表达载体pcold i-ecpnp的构建示意图；图3为tp粗酶液、pnp粗酶液以及pnp突变体粗酶液的sds-page电泳结果图；图4为2’f-da合成反应过程流程图；图5为ecpnp其活性中心与底物距离5埃范围内的氨基酸残基的检测结果示意图；图6为ecpnp虚拟饱和突变结果示意图；图7为ecpnp突变体合成2’f-da筛选结果示意图；图8为ecpnp突变体温度稳定性检测结果示意图。
实施方式
[0023]
本技术涉及的原料均采用市售产品，以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
[0024]
本实施例中涉及的缩略语和关键术语定义：escherichia coli：大肠杆菌；tp：胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase)；pnp:嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase)；2’f-da: 2
’‑
氟-2
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脱氧腺苷；2’f-du:2
’‑
氟-2
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脱氧尿苷。
[0025]
实施例1：胸腺嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶基因的合成胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，基因两端分别加入了ndei 和xba i限制性内切酶识别位点序列，由安徽通用生物公司合成。
[0026]
嘌呤核苷磷酸化酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，基因两端分别加入了ndei 和xba i限制性内切酶识别位点序列，由安徽通用生物公司合成。
[0027]
野生型嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0028]
实施例2：重组质粒pcold i-ectp和重组质粒pcold i-ecpnp的构建分别对合成的胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的编码基因和质粒载体pcoldi进行双酶切(酶切位点为nde i和xbai)，对两者的酶切产物进行鉴定、纯化和连接，获得重组质粒pcold i-ectp，如图1所示。
[0029]
分别对合成的嘌呤核苷磷酸化酶的编码基因和质粒载体pcold i进行双酶切(酶切位点为nde i和xba i)，对两者的酶切产物进行鉴定、纯化和连接，获得重组质粒pcold i-ecpnp，如图2所示。
[0030]
实施例3：产tp酶工程菌株和产pnp酶工程菌株的构建
采用热激法转化法将重组质粒pcold i-ectp转入大肠杆菌感受态细胞e.colibl21(de3)中，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板上，37℃倒置培养过夜，挑选单菌落由安徽通用生物公司进行序列测定完成验证，验证正确的菌株即为产tp酶工程菌株。
[0031]
采用热激法转化法将重组质粒pcold i-ecpnp转入大肠杆菌感受态细胞e.colibl21(de3)中，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板上，37℃倒置培养过夜，挑选单菌落由安徽通用生物公司进行序列测定完成验证，验证正确的菌株即为产pnp酶工程菌株。
[0032]
实施例4：产tp酶工程菌株和产pnp酶工程菌株的发酵与表达1、将实施例3中构建好的产tp酶工程菌株与产pnp酶工程菌株分别接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基（5ml）中，37℃，180rpm培养过夜，制备种子液。
[0033]
2、以2%的接种量将种子液接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基（50ml）中，37℃，200rpm培养至od600为0.6-1.0时，取出经冰水浴冷却5min，加入诱导剂异丙基-β-d硫代半乳糖苷（终浓度0.1mmol/l），15℃，200rpm诱导表达24h。
[0034]
3、取诱导表达的发酵液，12000rpm离心10min，弃去上清，然后用50mm na2hpo
4-kh2po4（ph7.0）缓冲重悬清洗菌体，12000rpm离心10min，弃去上清，用缓冲再次重悬，然后超声破碎，破碎液离心12000rpm，10min，上清即为粗酶液。
[0035]
4、取粗酶液进行sds-page电泳检测，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12.5%，样品与上样缓冲按照1:1的比例混合，沸水浴反应5min进行上样电泳。电泳仪设定初始电压为120v，当样品移动至分离胶时提高电压至230v，直至样品移动到电泳槽底部时结束电泳。
[0036]
5、所获得的tp粗酶液和pnp粗酶液sds-page电泳结果如图3所示，目的蛋白tp分子量为47.2kda,目的蛋白pnp的分子量为25.9kda，电泳图中各泳道在47kda和26kda处均有明显条带，表明目的蛋白tp和pnp在大肠杆菌中成功表达。
[0037]
实施例5：2’f-da合成体系的构建2’f-da合成反应过程如图4所示。最终1ml的反应体系包括10mm的2’f-du、20mm的腺嘌呤、缓冲液为50mm na2hpo
4-kh2po4(ph7.0)缓冲。开始反应时加入50μl实施例4步骤3所获得的tp粗酶液，将离心管置于50℃恒温摇床中孵育，转速220rpm/min，反应3h后加入实施例4步骤3所获得的pnp粗酶液，再反应24h后取样50μl，加入950μl的乙腈中终止反应，将样品用1ml注射器过滤膜制样，通过hplc检测2’f-da的转化率。
[0038]
实施例6:pnp活性中心关键氨基酸的确定首先从pdb数据库中获得来源escherichia coli的pnp晶体结构（pdb：1ecp)。由于pnp催化底物2’f-r1p和腺嘌呤磷酸转化为2’f-da，其中腺嘌呤是其天然底物，pnp对其活性很高，而2’f-r1p为非天然底物，其2号c上有氟的修饰，导致pnp对其酶活较低。因此将底物2’f-r1p通过autodock4.2对接进pnp的活性中心，其活性中心与底物距离5埃范围内的氨基酸残基如图5所示，主要包括g21、h63、g64、m65、g66、r88、v89、g90、s91、c92、f160、e180、m181、e182和c201。
[0039]
实施例7：活性中心内氨基酸虚拟饱和突变为研究关键氨基酸的突变对酶和底物的影响，利用moe软件对上述底物半径5
å
范围内与2’f-r1p作用的氨基酸残基进行虚拟饱和突变，分析突变体与底物亲和力的变化。热
点氨基酸位点的选择需要利于底物结合(daffinity《0)，虚拟筛选找到的关键位点如图6所示，选取亲和力最高的15个定点突变位点（g21h、g90r、g90n、g90f、g90s、g90t、g90y、s91f、s91w、m181f、m181y、e182q、e182r、c201r和c201w）进行实验验证。
[0040]
实施例8：pnp突变体文库的构建如实施例7所述，对pnp进行定点突变（g21h、g90r、g90n、g90f、g90s、g90t、g90y、s91f、s91w、m181f、m181y、e182q、e182r、c201r和c201w），并且将获得的有益突变体进行组合突变，以期获得更高催化效率的突变菌株。
[0041]
突变体构建以重组质粒pcold i-ecpnp为模板，参照vazyme生物产品及操作手册，全质粒扩增出定点突变序列。全质粒扩增pcr的反应所需的突变引物序列为表1，由安徽通用生物公司合成。pcr反应体系如表2所示，pcr反应条件如表3所示。pcr产物使用dpn i进行酶切处理，模板消化结束后，采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞e.coli bl21(de3)，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板上，37℃倒置培养过夜，得到突变体工程菌。突变结果由安徽通用生物公司进行序列测定完成验证。
[0042]
表1 突变体引物序列
引物名称引物序列序列号g21h-fgccgacgtggttctgatgccgcatgatccgttacgtgcaaaatatattgseqidno:6g21h-bcaatatattttgcacgtaacggatcatgcggcatcagaaccacgtcggcseqidno:7g90r-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgcgtagctgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:8g90r-bcatgcggtaaaactgcgccgcagctacgcacgcggatgatctttttcacgccseqidno:9g90n-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgaatagctgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:10g90n-bcatgcggtaaaactgcgccgcagctattcacgcggatgatctttttcacgccseqidno:11g90f-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgtttagctgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:12g90f-bcatgcggtaaaactgcgccgcagctaaacacgcggatgatctttttcacgccseqidno:13g90s-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgtctagctgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:14g90s-bcatgcggtaaaactgcgccgcagctagacacgcggatgatctttttcacgccseqidno:15g90t-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgactagctgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:16g90t-bcatgcggtaaaactgcgccgcagctagtcacgcggatgatctttttcacgccseqidno:17g90y-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgtatagctgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:18g90y-bcatgcggtaaaactgcgccgcagctatacacgcggatgatctttttcacgccseqidno:19s91w-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgggttggtgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:20s91w-bcatgcggtaaaactgcgccgcaccaacccacgcggatgatctttttcacgccseqidno:21s91f-fggcgtgaaaaagatcatccgcgtgggtttttgcggcgcagttttaccgcatgseqidno:22s91f-bcatgcggtaaaactgcgccgcaaaaacccacgcggatgatctttttcacgccseqidno:23m181f-ftacggcatcctgggcgttgaatttgaagcagcaggtatttatggtgttgseqidno:24m181f-bcaacaccataaatacctgctgcttcaaattcaacgcccaggatgccgtaseqidno:25m181y-ftacggcatcctgggcgttgaatatgaagcagcaggtatttatggtgttgseqidno:26m181y-bcaacaccataaatacctgctgcttcatattcaacgcccaggatgccgtaseqidno:27e182q-ftacggcatcctgggcgttgaaatgcaggcagcaggtatttatggtgttgseqidno:28e182q-bcaacaccataaatacctgctgcctgcatttcaacgcccaggatgccgtaseqidno:29e182r-ftacggcatcctgggcgttgaaatgcgtgcagcaggtatttatggtgttgseqidno:30e182r-bcaacaccataaatacctgctgcacgcatttcaacgcccaggatgccgtaseqidno:31
c201r-fatttggtgcaaaagcactgaccattcgtaccgttagcgatcatattcgtacccatseqidno:32c201r-batgggtacgaatatgatcgctaacggtactaatggtcagtgcttttgcaccaaatseqidno:33c201w-fatttggtgcaaaagcactgaccatttggaccgttagcgatcatattcgtacccatseqidno:34c201w-batgggtacgaatatgatcgctaacggtccaaatggtcagtgcttttgcaccaaatseqidno:35
表2 全质粒扩增pcr反应体系
[0043]
表3 全质粒扩增pcr反应条件
[0044]
实施例9：pnp突变体合成2’f-da的转化率检测将实施例8所获得突变体工程菌按照实施例4中的步骤1-3进行发酵，制备获得pnp突变体粗酶液，再按照实施例5进行反应检测。最终各突变体合成2’f-da的转化率如图7所示。其中突变体g90s、g90t和e182q催化2’f-da合成转化率均高于野生型，相对于野生型酶pnp分别提高了41.5%、20%和32.5%；然后对优异的单突变体进行组合突变，发现组合突变体g90s/e182q的催化2’f-da合成转化率，相对于野生型酶pnp提高了62.5%。
[0045]
嘌呤核苷磷酸化酶g90s/e182q组合突变体的氨基酸序列为seq id no.4所示；核苷酸序列为seq id no.5所示。
[0046]
实施例10：野生型酶和突变体pnp酶热稳定性测定pnp酶活定义：在实施例5所示的反应体系中，每小时产生1mmol2’f-da所需要的酶量定义为一个酶活单位。将实施例2获得野生型酶和实施例9筛选到的组合突变体pnp酶放在50℃下进行孵育，并在0、5h、10h、15h、20h、25h取出pnp酶进行2’f-da合成活性检测，将0小时的pnp酶活性定为100%。检测结果如图8所示。野生型酶在50℃下孵育24h后，其酶活只
存在60%，而本技术得到的突变体g90s/e182q在50℃下孵育24h后，其酶活仍保留90%，说明本技术的嘌呤核苷磷酸化酶突变体pnp的热稳定性要优于野生型。
[0047]
以上结果表明，本技术所筛选到pnp突变体比野生型酶具有更高的催化活性以及热稳定性，能够完全满足工业应用需求，将其应用于催化反应中能够提高2’f-da产物的生产效率，同时降低了生产成本。
[0048]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，其特征在于：所述突变体是由大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶经过氨基酸位点突变后得到；突变位点为下述位点中至少一处：第90位甘氨酸突变成丝氨酸、第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺或第90位甘氨酸突变成苏氨酸。2.根据权利要求1所述的一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，其特征在于：突变位点为第90位甘氨酸突变成丝氨酸和第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺。3.根据权利要求2所述的一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，其特征在于：突变体的氨基酸序列为seq id no.4所示。4.编码如权利要求3所述的嘌呤核苷磷酸化酶突变体的基因。5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于：编码基因的核苷酸序列为seq id no.5所示。6.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含权利要求4或5所述的编码基因。7.根据权利要求6所述的一种重组载体，其特征在于：重组载体以pcold i为表达载体。8.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含权利要求6或7所述的重组载体，菌为大肠杆菌bl21(de3)菌株。9.权利要求1-3中任一项所述嘌呤核苷磷酸化酶突变体、权利要求4或5所述的编码基因、权利要求6 或7所述的重组载体、权利要求8所述的重组菌在制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧腺苷中的应用。10.一种2
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氟-2
’‑
脱氧腺苷的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：在反应体系中加入2'f-du、腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷磷酸化酶、磷酸盐缓冲液以及权利要求1-3中任一项所述嘌呤核苷磷酸化酶突变体进行反应，得到2
’‑
氟-2
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脱氧腺苷。

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及其应用，一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，突变体是由大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶经过下述位点中至少一处突变后得到，突变位点为第90位甘氨酸突变成丝氨酸、第182位谷氨酸突变成谷氨酰胺、第90位甘氨酸突变成苏氨酸；本申请中通过对PNP定向改造所获得突变体G90S/E182Q催化2’F-dA合成转化率，相对于野生型酶PNP提高了62.5%；并且该突变体在50℃下孵育24h后，其酶活仍保留90%；本申请所筛选到PNP突变体比野生型酶具有更高的催化活性以及热稳定性，能够完全满足工业应用需求。需求。需求。


技术研发人员：童坤 黄磊 肖潇 缪佳颖
受保护的技术使用者：江苏申基生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.04
技术公布日：2023/10/11