一种基于CRISPR-Cas9的叶螨基因编辑系统及应用

一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统及应用。


背景技术：

2.农业害螨属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨亚纲，真螨目的小型及微型动物，广泛分布于各种农林作物上，是当今世界农林作物上的主要害虫，在新疆其危害主要表现在对棉花、林果、玉米等农作物的危害上。
3.多年以来，我国对农业害螨的防治一向以化学防治为主。通常昆虫对某种农药产生抗药性约3-4年，而相比螨类生活周期短，其繁殖能力强、虫口密度高，对某种农药抗药性的产生仅需1-2年，并且可能产生交叉抗性。所以，迫切需要发展新型、安全、高效的方法来控制害螨的危害。
4.rna干扰(rnai)极大地加速了不同昆虫种群的科学进步，将基因与表型联系起来，但目前这种技术并不总是直接应用于螨虫。最近的一项技术，被称为有规律的间隔短回文重复序列(crispr-cas9)，已经彻底改变了许多生物的功能性遗传工作。据报道，crispr-cas9介导的基因操作应用在越来越多的生物上，包括双翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目、直翅目和多种的鳞翅目，但没有应用在叶螨上。很明显，这种有针对性的、可遗传的基因编辑方法，对于研究叶螨也是至关重要的。
5.crispr-cas9介导的基因敲除是通过sgrna指导cas9蛋白对目标基因的靶序列进行切割，形成基因的双链断裂，破坏基因的基因组序列。目前，广泛使用的cas蛋白是来源于嗜热链球菌中的cas9蛋白，在不同的物种中经密码子的优化后发挥高效作用。将合成的不同形式的cas9和sgrna注射生物体的胚胎或是转染细胞，获得想要的基因敲除个体或细胞，己成为基因功能研究的强有力的工具。
6.目前，crispr-cas系统一些技术方面的问题有待进一步改进和探讨：如脱靶现象、pam区的限制性、编辑效率等。尤其是脱靶现象，严重限制了该技术的应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过设计靶向tetur01g11260、tetur13g03250基因的sgrna，构建基因编辑系统，确定了调控白化型的叶螨以及影响幼虫生长发育的基因，为农业上防治叶螨提供了科学理论基础。
8.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
9.本发明提供一种sgrna，包括如下(1)-(2)所示的任意一种：
10.(1)靶向破坏tetur01g11260基因的sgrna，其核苷酸序列如seq id no：1-2所示；
11.(2)靶向破坏tetur13g03250基因的sgrna，其核苷酸序列如seq id no：3-4所示。
12.本发明还提供一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统，包括所述的sgrna。
13.本发明还提供一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统构建的叶螨突变体的方法，包括以下步骤：将cas9与权利要求1所述的sgrna以摩尔比为1:2混合得到cas9-sgrna复合物，将cas9-sgrna复合物转入叶螨中，筛选获取叶螨突变体。
14.优选的是，当将如seq id no：1-2所示的sgrna与cas9混合为cas9-sgrna复合物并转入所述叶螨后，筛选得到白化型的叶螨突变体；
15.当将如seq id no：3-4所示的sgrna与cas9混合为cas9-sgrna复合物并转入所述叶螨后，筛选得到幼虫生长发育受阻的叶螨突变体。
16.本发明还提供所述的sgrna，或者所述的叶螨基因编辑系统在制备防治叶螨产品中的应用。
17.本发明所述的sgrna，或者所述的叶螨基因编辑系统在制备调控叶螨白化表型和/或幼虫生长发育的产品中的应用。
18.本发明所述的sgrna，或者所述的叶螨基因编辑系统在构建叶螨突变体中的应用。
19.优选的是，所述叶螨突变体包括白化型叶螨突变体和幼虫生长发育受阻的突变体。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.本发明以类胡萝卜素合成及保幼激素的相关基因为目标，利用crispr-cas9技术，证明类胡萝卜素合成及保幼激素的相关基因可以作为靶点来防治农业害螨，且crispr-cas9也可以应用于非模式昆虫叶螨。具体地，通过将cas9-sgrna复合物递送到雌性体内。在后代中发现了白化型后代，将白化型后代与野生型交配，并进一步研究其表征。对其完整靶基因进行测序后，在靶基因中pam位点附近的位置发现了突变。表明白化表型是crispr-cas9诱导的类胡萝卜素合成基因突变的结果，保幼激素基因突变致使螨虫生长发育受到影响。，从而为crispr-cas9介导的螨虫遗传修饰的可行性提供了理论依据。本发明为基于crispr-cas9技术的农业害螨防治提供了新的潜在靶标，因此具有良好的应用前景。
22.本发明具有如下优势：(1)特异性干扰害螨专一基因，对高等动物和人类安全；(2)杀螨具有专一性，对非靶标生物安全；(3)对环境无毒无害。因此，本发明相对于传统的害螨防治方法具有明显的技术优势。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
28.实施例1
29.一、实验方法
30.1、试验叶螨的饲养
31.土耳其斯坦叶螨：2021年6月采自石河子大学农学院试验站试验田，在石河子大学昆虫生理实验室光照培养箱(温度为(28
±
1)℃、相对湿度(65
±
5)％、光周期l/d＝16h/8h)中用豇豆饲养至今，饲养过程中未接触任何药剂。
32.2、重组cas9核糖核蛋白和sgrna
33.使用含有多个核定位序列(nlss)的重组化脓性链球菌商用的cas9蛋白。使用crispo网站设计了引物序列(见表1)。
34.表1sgrna的序列
[0035][0036][0037]
3、体外cas9-sgrna裂解实验
[0038]
使用primer 5设计引物，扩增靶向的类胡萝卜合成基因tetur01g11260，保幼激素相关基因tetur13g03250区域的sgrna。根据制造商的说明，使用gentra puregene组织试剂盒(qiagen)从野生型螨中提取dna，并使用成年雌螨作为材料。使用expand
tm
long range dntpack(sigma-aldrich)对tetur01g11260、tetur13g03250片段(扩增片段1和2)进行pcr，92℃预变性2min；92℃10s、60℃15s、68℃1min，5次循环；92℃10s、55℃15s、68℃1min，37次循环；68℃延伸5min，4℃保存，通过琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并使用循环纯化试剂盒纯化。
[0039]
cas9 rnp复合物是由sgrna，alt-r s.p.cas9 v3酶和cas9稀释缓冲液组成的。阴性对照用te取代sgrna。在室温下培养后，在室温下体外裂解反应体系如下：2μl 10
×
cas9核酸酶反应缓冲液，4μl cas9 rnp，10μl dna底物和4μl水。将反应混合物在37℃下90min，然后加入2μl蛋白酶k，并在56℃下10min。随后，使用凝胶电泳分析结果，其中将反应混合物点样到凝胶上。
[0040]
4、体内cas9-sgrna裂解实验
[0041]
4.1 cas9-sgrna注射液
[0042]
将sgrna溶解到rnase-free water中来制备各sgrna的原液。cas9：sgrna以1：2摩尔比加入注射混合物中，氯喹也加入到混合注射液中。将cas9-sgrna注射混合物在37℃下10分钟，最后，将注射混合物在4℃，12000rpm离心10分钟，冷藏至注射。
[0043]
4.2雌性螨的注射
[0044]
野生型雌性螨虫放置于培养皿中，在叶片上部产卵。八天后，将雌性若虫转移到另一个叶盘上。再过一到四天，这些未受精的雌性被用于注射。在显微镜和机械显微操作器下注射螨虫，将大约3-5nl的cas9-sgrna注射混合物注射到体内。将每批注射的螨虫转移到单独叶盘中并使其产卵。24小时后，将注射的雌性转移到新的叶盘中并再次产卵。从产卵后3天开始，对注射的雌性雄性单倍体后代(总共在四个叶盘上(2批：a和b，2个时间点：0-24小时和24-48小时))进行白化表型的表型筛查。
[0045]
5、白化表型的遗传模式和纯合白化品的产生
[0046]
从注射cas9-sgrna的白化型雄性后代在叶盘上分离(每个叶盘一个雄性)，并允许与亲本群体的3到5个未受精的雌螨进行交配。交配的雌性被允许在叶盘(叶盘1)上产卵6天，之后被丢弃。接下来，将3只从1号叶盘上的卵发育而来的f1代雌性若虫转移到另一个单独的叶盘上，让它们成长并产卵4天(叶盘2)。这些未受精的f1代，将雌性(从叶盘2)转移到另一个叶盘，保持在10℃以延长其寿命(叶盘3)。随后，在叶盘2上计数白化型和野生型雄性的数量，并将来自叶盘2的白化雄性与其未受精雌性(在叶盘3上)配对以产生纯合白化型。。简而言之，15只未受精雌性与来自野生型的30只雄性杂交。结果至少有100只f1雌性被评估为白化型。
[0047]
6、叶螨中提取dna和rna以及相关基因的pcr扩增
[0048]
从雌性杂交后代中收集dna。利用体外cas9-sgrna裂解实验引物对tetur01g11260、tetur13g03250片段进行pcr，并从叶螨中提取的dna作为模板。pcr扩增产物在琼脂糖凝胶上验证，根据制造商的说明使用gel和pcr试剂盒纯化。
[0049]
上述实验合成tetur01g11260的引物如表2所示：
[0050]
表2叶螨基因的tetur01g11260合成引物
[0051][0052]
叶螨基因的tetur13g03250合成引物如下表3所示。
[0053]
表3叶螨基因的tetur13g03250合成引物
[0054][0055]
扩增条件：95℃预变性5min；95℃30s，53℃40s，72℃1min，40次循环，72℃延伸2min。以叶螨dna为模板，进行pcr扩增。
[0056]
最后，从叶螨的螨虫中提取rna。收集100只雌性，并使用qiagen rneasy plus mini kit提取rna。使用1μg总rna作为模板，使用rt-qpcr的maxima first strand cdna合成试剂盒合成cdna。采用primer 5设计引物(tetur01g11260、tetur13g03250引物)，以扩增tetur01g11260、tetur13g03250的编码序列，进行pcr。根据制造商的说明制备反应混合物。使用ezna cycle pure kit纯化pcr产物，进行测序。
[0057]
叶螨cdna扩增条件：92℃下预变性2min；
[0058]
92℃10s，57℃15s，68℃2.5min，4次循环；
[0059]
92℃10s，53℃15s，68℃2.5min，40次循环；
[0060]
68℃延伸长7min；4℃保存。4℃保存。以cdna为模板，使用expand
tm long range dntp pack进行扩增。
[0061]
上述tetur01g11260的cdna基因片段(seq id no：5)：
[0062]
atgtggacttacctcgatgtccacctttaccttactttacccattatagcgttggaatactcgcttctccgaccctttctcaatgtccacgaattcatcaagatagcctttatttgttccaatgccatgatttacacagttccttgggacaattacatcgtttacaatgaagcctggtcttatccaattgatcgggttctcggtgtaattggttgggttccatacgaagagtatgcctttttcattatacaaacagttttaacgtctttctggacaatcctatggatgagatggtcaatcccttgtttacatttaaatttcaatcggtttacatttaattgcgctcgttggttgcccatgattgctttaataagtctaacttatctaggctttaatcttggtacaccaggaagcaaaacattttacatgggtgctttactttggtggatttgtccggtaatttgtttcctctggtttggtgctggcaattatttcctgtctcaatggaaattttctttgaccagttttattgtcccatcaatttacctctgttgggttgacacattttcactgagacaaggtatatggcatatcaatgaggcaacaagcctggaatggtttgttgttcctgatttacccattgaagaggctacatttttcactgtagtcaatttattgattgtcttggccaattgtgcctttgacaagtccaagtgtcttcttgatttgtatcccgatctgtttccagtcagtccatcgttaacaatcaatagtttacccaattatttcaagcaaaccttccttgccttcattgccagtgaaccagatttacccaagcaacgtttagatgacttcaaagtttgcctcaatgttttgtctcgatcatctaaatcgtttactgcagccgcttcaacatttcattcaggaattaggatcgacttgagcattttgtatggatatgctagggtaacagatgacatgattgacaaccaacagggaactcaggctcgtcaggaaaagctatcaataataaacaaatttttggatcaattatttgcttcaaggccaaaaaataaatggacttacgatgtaccaaccaaaatggatccaacagaaaaggttaccataaattggaatgaatttgaacatcttttatcggatgaagaattggcagcattccgttcactgacgcatatcgtttattatcttccgtctgaaccattttacgagctttccagaggctatgcatgggatattgagggtaaaaaagtcgaaacagaagccgatttactagaatactcatcatatgtggcttcttccattggaatcctatgtacctttgtaatgtgctacaaaagtg
gcaagtttcctaatggagtaaccaaagagcacatttcaatgattgaaagggctaaagaaatgggccaggtattacagattgtaaacattgcccgtgatattgttactgatagtcaaacactgggtcgttgttatgttccttctaattacatggattcaccggaaaaagaactgaagttacttaaagatgataggaatccttgggccttaggtgaggataaattgaaaagatatgctcttcaaatgctcaatttagctgacgattatgctcgaactgctttaaatggtattgctctattacctagtgaggttcaagctcctgttctggtgacaacagaaatttatcgaatgattggtgttcaaatagcatctcaatcaggttatttggagagagtttatgtttccaaagtgaaaaagctaatgattgccttaacttgtatgtatgcaaaatttattcgtattcaaaagaaatttagtttccatgaaaaatcaaattga。
[0063]
tetur13g03250的cdna基因片段(seq id no：6)
[0064]
atggttttggaagctttggtgaaatggaaggctgaagcagcaaacaagaatcttgggtcagagatgaataacgatcctcagctttatgataaatccaatggattacagaagaaagattctgaatatctcttgaagagactggaaaaagattttcaaaatgtttctccaaaggtaattgtggacattggatgtggaactggaaatataacgaaaatgatttactccagttttcccgattcacgaatcattggtttcgattgcagtgaaaagatgattgaatttgctcgggaaaattattcaacctccaacctcaactttcattgtggaaacatttgtgccgattgggaagaactgtcagttaacttggacatagaagcggaatcggttgacgtagttacatctactttttgccttcattgggttacgaatactgccaaagccatggaaaacatcaataaaatgctgaagccaggaggaaaatgttatttattgatgttttcttggagccccatttttccccttcaagaacagataacatatcaagaaccttggtatgaattgtttcaaaagcttgaggttcctatggatcatgagaaacccaaatatgctacaaaacctcagtcagatataaaatctgagcttgctcggcgagcctcaacctctcaattagccgattcccaacatttgcttgatttggctaaacccaagtctaaatcttcaaccattcgtaggaaatcatcggctccgttccctgtttatgagattcctcctgagaaagaacgaattgatcactggatgcaattgtgtgaaactgctaatttgaagcctattgaagtggcaatacatgactcgactttcacttatgaagatattgaaggattcaaaggtgaattggtatctttgtgtcactttctggctcatgttccgaaagatttgcatcctcaatttctgaacgactattatgaacacatgagaagggttttcattgcacatcagagtactttgccaaagatcaacgtagattaccaatttttaaccgcaatagccgaaaaacctgcgaccaatgacacaaagaataagattaacaaagacgaaaaccaaaatgaatatgagactgaaatctaa。
[0065]
二、结果与分析
[0066]
1、sgrna引导序列设计与体外cas9-sgrna裂解
[0067]
选择tetur01g11260、tetur13g03250的sgrna，经网站预测，选择得分较高的sgrna。cas9-sgrna在体外切割tetur01g11260、tetur13g03250的pcr扩增片段后，得到了正确的预测裂解模式。
[0068]
2、体内cas9-sgrna实验
[0069]
2.1白化型雄性后代的筛选
[0070]
将tetur01g11260、tetur13g03250的cas9和sgrna(sgrna1和sgrna2)的rnp混合物注射入未受精雌性卵巢中，以tetur01g11260为例，注射后24小时，活着的雌性比例为78.5％。注射的雌性产卵24小时，放置在新的叶盘上，在新的叶盘上再产卵24小时。在24小时和24-48小时后，叶盘上的卵分别为550和320个。孵化后，筛选了缺乏色素的雄性若螨。在注射后24小时内积累卵的叶盘中，发现了一个活的白化雄性，在注射后24至48小时之间沉积的卵产生的幼虫/若虫中检测到11个具有白化表型的螨虫。然而，这些若虫都没有发育成成虫。分离出活的白化雄性，使其发育到成虫阶段并杂交，获得纯合稳定的品系，并进一步表征，该品系的所有生命阶段都缺乏红色色素。
[0071]
对tetur13g03250进行实验，发现该若虫均发育不到成虫，由于tetur13g03250与
保幼激素有关。可能是由于tetur13g03250基因的敲除，使得螨虫生长发育受到影响。
[0072]
2.2crispr品系表型的遗传模式和互补检验
[0073]
注入cas9-sgrna的未受精雌性的雄性后代与野生型群体杂交，确定其白化表型的遗传基础。在所有情况下，杂交后代的f1雌性具有正常的身体和眼睛颜色。再加上在未受精的f1雌性所产生的f2单倍体子代中，白化病与野生型表型的比例约为1:1，这强烈表明白化病是作为单基因隐性性状遗传的。将crispr品系的雌性与野生型的雄性杂交，发现所有雌性f1后代是白化型。这种补体的缺失表明，crispr白化表型是由cas9-sgrna实验靶向的基因tetur01g11260突变或破坏引起的。
[0074]
2.3类胡萝卜素合成及保幼激素的相关基因在crispr品系中的序列分析
[0075]
从crispr品系中提取dna，对pcr扩增片段1和2的进行测序，发现出现了中断，都出现了缺失现象。
[0076]
以tetur01g11260为例，crispr品系具有5bp缺失，位于sgrna2 pam位点上游3bp处，导致两个氨基酸的缺失，改变类胡萝卜素结合结构域区域的翻译，为了确保检测到的缺失是tetur01g11260编码序列中的唯一中断，对crispr品系和野生型的tetur01g11260的完整cdna序列进行了测序。结果显示crispr系的cdna序列除了5bp缺失外，与野生型的cdna序列100％相同。
[0077]
综合上述，类胡萝卜素合成及保幼激素相关基因突变导致白化及蜕皮死亡表型。本发明利用这一发现设计了一种crispr-cas9策略，该策略使用sgrna靶向叶螨的类胡萝卜素合成及保幼激素的相关基因。
[0078]
在这项研究中，向未受精的叶螨雌性注射cas9-sgrna，在注射后24h内雌虫产卵发育的后代中鉴定出白化雄性。随后，这些雄性中产生了纯合的白化型，遗传模式和互补试验都表明，tetur01g11260的破坏导致白化表型。此外，sgrna的序列均未预测出脱靶效应。进一步，为了评估tetur01g11260中断是否由典型的crispr-cas9事件引起，我们在dna和cdna水平上对tetur01g11260进行了测序，出现了不同程度的缺失。毫无疑问，cas9诱导缺失是白化表型的潜在遗传基础。本次研究共对tetur01g11260、tetur13g03250进行试验，发现tetur01g11260的突变致使叶螨出现白化表型，而tetur13g03250变致使螨虫不能蜕皮，且发育停滞，致使螨虫死亡，以此表明tetur13g03250影响其生长发育。
[0079]
根据注射雌性产卵的总数，crispr-cas9转化螨胚胎的百分比较低。然而，这个频率与关于非模型昆虫遗传转化的最初报道的频率相似。其次，与24小时卵的叶盘相比，无法从24-48小时卵的叶盘获得活的白化雄性，因为检测到的白化幼虫都没有发育成成虫。为了加强在24-48小时内观察到的具有相同表型的白化型雄性是由crispr-cas9事件引起的可能性，应该对这些死亡的幼年雄性的基因进行测序。然而，幼虫/若虫阶段死亡的雄性很小，很难操纵。综上所述，使用crispr-cas9技术在叶螨中诱导了的突变事件，为crispr-cas9在叶螨中体内的应用提供了理论依据，为今后在螨体内的功能研究奠定了基础。
[0080]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不
[0081]
脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种sgrna，其特征在于，包括如下(1)-(2)所示的任意一种：(1)靶向破坏tetur01g11260基因的sgrna，其核苷酸序列如seq id no：1-2所示；(2)靶向破坏tetur13g03250基因的sgrna，其核苷酸序列如seq id no：3-4所示。2.一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1所述的sgrna。3.一种基于crispr-cas9的叶螨基因编辑系统构建的叶螨突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将cas9与权利要求1所述的sgrna以摩尔比为1:2混合得到cas9-sgrna复合物，将cas9-sgrna复合物转入叶螨中，筛选获取叶螨突变体。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当将如seq id no：1-2所示的sgrna与cas9混合为cas9-sgrna复合物并转入所述叶螨后，筛选得到白化型的叶螨突变体；当将如seq id no：3-4所示的sgrna与cas9混合为cas9-sgrna复合物并转入所述叶螨后，筛选得到幼虫生长发育受阻的叶螨突变体。5.如权利要求1所述的sgrna，或者权利要求2所述的叶螨基因编辑系统在制备防治叶螨产品中的应用。6.如权利要求1所述的sgrna，或者权利要求2所述的叶螨基因编辑系统在制备调控叶螨白化表型和/或生长发育的产品中的应用。7.如权利要求1所述的sgrna，或者权利要求2所述的叶螨基因编辑系统在构建叶螨突变体中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述叶螨突变体包括白化型叶螨雄性突变体和幼虫生长发育受阻的突变体。

技术总结
本发明公开了生物技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR-Cas9的叶螨基因编辑系统及应用。本发明设计了靶向类胡萝卜素合成及保幼激素基因突变相关基因的SgRNA，并构建了Cas9-SgRNA复合物，将Cas9-SgRNA复合物注射到雌性体内。在后代中发现了白化型雄性，将白化型雄性后代与野生型雌性交配，并研究其表征及基因序列。测序后，在靶基因中PAM位点附近的位置发现了突变。表明白化表型是CRISPR-Cas9诱导的类胡萝卜素合成基因突变的结果，保幼激素基因突变致使螨虫生长发育受到影响。这为CRISPR-Cas9介导的螨虫遗传修饰的可行性提供了理论依据，为农业害螨防治提供了新的潜在靶标，具有良好的应用前景。有良好的应用前景。


技术研发人员：赵伊英 崔丹丹
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：2023.08.23
技术公布日：2023/10/11