施马伦贝格病毒实时荧光RT-RAA快检方法及应用

施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用
技术领域
1.本发明涉及预防兽医学技术领域，具体为施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用。


背景技术：

2.施马伦贝格病毒(schmallenberg virus,sbv)是一种新发rna病毒，最早于2011年11月在西部城镇施马伦贝格被检测出而得名，它是一种正本雅病毒属的新病毒，感染症状为发热、腹泻、乏力等，感染此病毒的奶牛产奶量降低，以及新生幼畜出现缺陷等，对羊等反刍动物养殖业造成严重威胁，现有技术需要建立一种敏感、快速、特异检测方法，来应对施马伦贝格病毒带来的挑战。
3.本研究基于sbv s基因保守序列，设计特异性引物和探针，建立sbv反转录重组酶介导核酸恒温扩增(rt-raa)检测方法。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用，来解决上述问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用，包括以下步骤：
8.筛选最佳引物对；
9.建立sbv实时荧光rt-raa反应体系以及优化反应条件；
10.构建sbv实时荧光rt-raa标准曲线；
11.进行sbv实时荧光rt-raa灵敏度试验；
12.进行sbv实时荧光rt-raa特异性试验；
13.进行sbv实时荧光rt-raa重复性试验；
14.进行模拟阳性样本的检测。
15.优选的，所述引物对由3条正向引物和3条反向引物组合成9种不同的引物对，包括f1/r1、f1/r2、f1/r3、f2/r1、f2/r2、f2/r3、f3/r1、f3/r2、f3/r3。
16.(三)有益效果
17.与现有技术相比，本发明提供了施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用，具备以下有益效果：
18.该方法特异性强、灵敏度高，检测下限为103拷贝/反应，与口蹄疫病毒(fmdv)、小反刍兽疫病毒(pprv)、非洲马瘟病毒(ahsv)、塞内卡谷病毒(svv)、水疱性口炎病毒(vsv)均与不发生交叉反应，该方法具有很大的应用潜力，能够快速、准确地检测施马伦贝格病毒，为羊等反刍动物养殖业提供有效的监测和防控手段，这种新发的检测方法对于保护畜牧业
健康、减少疫情威胁具有重要意义。
附图说明
19.图1为本发明中不同引物组合的实时荧光pcr扩增结果示意图；
20.图2为本发明中sbv实时荧光rt-raa温度及时间筛选结果示意图；
21.其中：a:循环时间15s扩增结果；b：温度38℃扩增结果；1：1
×
105拷贝/反应；2：1
×
104拷贝/反应；3：1
×
103拷贝/反应。
22.图3为本发明中sbv实时荧光rt-raa标准曲线示意图；
23.图4为本发明中实时荧光rt-raa灵敏度结果示意图；
24.其中：1：1
×
106拷贝/反应；2：1
×
105拷贝/反应；3：1
×
104拷贝/反应；4：1
×
103拷贝/反应；5：1
×
102拷贝/反应；6：1
×
101拷贝/反应；7：阴性对照。
25.图5为本发明中实时荧光rt-pcr灵敏度结果示意图；
26.其中：1：1
×
106拷贝/反应；2：1
×
105拷贝/反应；3：1
×
104拷贝/反应；4：1
×
103拷贝/反应；5：1
×
102拷贝/反应；6：1
×
101拷贝/反应；7：阴性对照。
27.图6为本发明中实时荧光rt-raa特异性结果示意图；
28.其中：1：sbv 2：fmdv；3：vsv；4：svv；5：pprv；6：ahsv；7：阴性对照。
29.图7为本发明中实时荧光rt-pcr和rt-raa的相关性示意图。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
32.如图1所示，筛选最佳引物对：针对设计合成的3条正向引物和3条反向引物，组合成9种不同的引物对，结果显示每种组合均出现扩增曲线，其中引物组合f3/r3扩增目的片段的斜率起始时间最短，且终点的荧光值最高，因此，选择f3/r3用于sbv实时荧光rt-raa检测。
33.如图2所示，建立sbv实时荧光rt-raa反应体系以及优化反应条件：为了优化反应条件，对不同扩增温度(37℃～42℃)和不同循环时间(10s～35s)条件下的扩增反应进行测试，结果显示，上述试验均可观察到阳性检测线，在扩增温度38℃循环时间15s时扩增效率最高。综合时间效率、荧光值、扩增曲线等因素，最终确定sbv实时荧光rt-raa的最佳引物浓度和探针浓度为10μmol/l，最佳反应温度和循环时间分别为38℃和15s。
34.如图3所示，构建sbv实时荧光rt-raa标准曲线：对1
×
106copies/μl～1
×
101copies/μl的sbv rna标准品按照优化的反应条件进行实时荧光rt-raa反应，实时荧光rt-pcr为平行对照实验，测定标准曲线，结果显示，sbv实时荧光rt-raa反应ct值与拷贝数的对数值具有相关性，相关系数r2为0.8946，斜率为-1.9011，回归方程为：ct＝-1.9011lg(x)+20.257。
35.如图4-5所示，进行sbv实时荧光rt-raa灵敏度试验：将rna标准品进行10倍稀释(1
×
106拷贝/反应～1
×
101拷贝/反应)，以此作为模板进行sbv实时荧光rt-raa方法灵敏度检测，结果显示，能检测浓度的最低下限为103拷贝/反应，退行性分析表明该检测系统在95％置信区间内的检测敏感性为103拷贝/反应而实时荧光rt-pcr方法所检测最底下限为102拷贝/反应，结果表明，本实验建立的实时荧光rt-raa方法灵敏度比实时荧光rt-pcr方法低一个数量级，但raa具备操作快捷便利、无需复杂设备的优势，广泛适用于养殖场、野外及口岸等现场检测。
36.如图6所示，进行sbv实时荧光rt-raa特异性试验：应用本研究建立的实时荧光rt-raa方法分别对sbv rna标准品以及fmdv、pprv、ahsv、vsv、svv、核酸进行扩增，结果显示，sbv扩增出曲线，其余病毒核酸及阴性对照均未出现扩增，表明该方法能够特异性检测sbv rna，与fmdv、pprv、ahsv、vsv、svv、不发生交叉反应。结果表明，该方法特异性强。
37.参照表1，进行sbv实时荧光rt-raa重复性试验：通过对3种不同浓度的rna标准品进行组间、组内变异系数分析，其cv值均在5％以下，结果表明，本研究建立的方法具有较高的重复性。
[0038][0039]
表1实时荧光rt-raa的重复性试验结果
[0040]
如图7所示，参照表2表3，进行模拟阳性样本的检测：应用本研究建立的实时荧光rt-raa检测方法和实时荧光rt-pcr检测方法对20份模拟样品(16份阳性、4份阴性)进行检测，结果显示，建立的实时荧光rt-raa方法结果于实时荧光rt-pcr完全一致，可准确检测到其中的16份模拟阳性样品。比较sbv实时荧光rt-raa方法ct值和sbv实时荧光rt-pcr方法的ct值之间的关联性，结果如图7所示，r2＝0.81。
[0041]
[0042]
[0043][0044]
表2比较两种检验方法
[0045][0046]
表3检样结果统计
[0047]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：筛选最佳引物对；建立sbv实时荧光rt-raa反应体系以及优化反应条件；构建sbv实时荧光rt-raa标准曲线；进行sbv实时荧光rt-raa灵敏度试验；进行sbv实时荧光rt-raa特异性试验；进行sbv实时荧光rt-raa重复性试验；进行模拟阳性样本的检测。2.根据权利要求1所述的施马伦贝格病毒实时荧光rt-raa快检方法及应用，其特征在于，所述引物对由3条正向引物和3条反向引物组合成9种不同的引物对，包括f1/r1、f1/r2、f1/r3、f2/r1、f2/r2、f2/r3、f3/r1、f3/r2、f3/r3。

技术总结
本发明涉及预防兽医学技术领域，具体为施马伦贝格病毒实时荧光RT-RAA快检方法及应用，本发明基于SBV S基因保守序列，设计特异性引物和探针，建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法，结果显示，在SBV S基因RNA标准品基础上，确定最佳引物对F3/R3和最佳温度38℃，于20min的短时间内，该方法即可检测出SBV，该方法特异性强、灵敏度高，检测下限为103拷贝/反应，与口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲马瘟病毒(AHSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)均与不发生交叉反应。叉反应。叉反应。


技术研发人员：李彦敏 陈嘉仪 黄晓琪 王炜杰 莫竣喻 张志东 王苏艳 陈劲松 丹珍翁姆 游青
受保护的技术使用者：西南民族大学
技术研发日：2023.08.03
技术公布日：2023/10/11