一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。在免疫细胞治疗中，一般采用羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，hes)离心沉淀法或ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmc)。分离出的外周血单个核细胞(pbmc)含有淋巴细胞、红细胞、粒细胞等多种细胞成分，由于成分的复杂，细胞保存条件极其苛刻。虽然细胞储存的技术已经有了长足的进步，但是目前细胞储存还有很多的问题。例如粒细胞的保存一直都未得到好的解决。
3.目前冻存方法多采用的是dmso、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，例如cn102301992a公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚砜，还可以包含动物血清和培养基等成分，采用该冻存液的优点是细胞保存时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的报道，例如，cn104026118a公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。
4.综上所述，开发新型的免疫细胞的冻存保护剂及保存方法，对于免疫细胞治疗领域具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用，为有效保存免疫细胞提供新方法、新思路，有利于免疫细胞治疗领域的发展。
6.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种免疫细胞的冻存保护剂，所述冻存保护剂包括培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉。
8.本发明中，设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率。
9.本发明中，所述培养基指能够维持免疫细胞存活的培养基，市售的免疫细胞培养基均适用于本发明，例如gibco品牌rpmi-1640培养基。
10.本发明中，所述自体血浆指外周血制备分离单个核细胞过程中去除红细胞后得到
的血浆。
11.本发明中，所述胎盘冻干粉指胎盘冻干粉是一种将新鲜胎盘进行处理和冻干的产品。冻干过程可以将胎盘中的水分去除，同时保留其中的生物活性成分和营养物质。胎盘冻干粉通常用于医疗和保健领域，被认为具有一些潜在的益处。例如市场在售的天美健牌胎盘冻干粉胶囊(卫生健号(1999)第120号)。
12.优选地，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)，包括但不限于55:21:14、51:25:12、59:29:11、57:23:13、或53:26:13。
13.优选地，所述冻存保护剂中人血白蛋白的体积百分比为5％～10％，包括但不限于6％、7％、8％或9％。
14.优选地，所述冻存保护剂中胎盘冻干粉的体积百分比为5％～8％，包括但不限于6％或7％。
15.优选地，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)，人血白蛋白的体积百分比为5％～10％，胎盘冻干粉体积百分比为5％～8％。
16.第二方面，本发明提供第一方面所述的免疫细胞的冻存保护剂的制备方法，所述制备方法包括：
17.将培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉混合，得到所述免疫细胞的冻存保护剂。
18.第三方面，本发明提供第一方面所述的免疫细胞的冻存保护剂在保存免疫细胞中的应用。
19.第四方面，本发明提供一种免疫细胞的保存方法，所述保存方法包括：
20.将外周血单个核细胞配制成细胞悬液，将所述细胞悬液与第一方面所述的免疫细胞的冻存保护剂混合，得到混合液，对所述混合液进行降温处理，然后转入液氮中保存。
21.优选地，所述细胞悬液的细胞密度为1
×
106～1
×
108个/ml。
22.优选地，所述细胞悬液与免疫细胞的冻存保护剂的体积比为1:(10～20)，包括但不限于1:11、1:12、1:13、1:15、1:16、1:17、1:18或1:19。
23.优选地，所述降温处理包括(应用程序性降温的降温梯度为)：
24.a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；
25.b.以5℃/min降至0℃，保持5min；
26.c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；
27.d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；
28.e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；
29.f.结束。
30.优选地，所述保存方法还包括分离单个核细胞的步骤。
31.优选地，所述分离单个核细胞的方法包括：
32.采集新鲜的抗凝人外周血进行离心处理，分别提取血浆和外周血单个核细胞。
33.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
34.本发明设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良
好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率，细胞活性可达95％以上，中性粒细胞回收率可达88％以上，嗜酸性粒细胞回收率可达85％以上，总细胞回收率可达86％以上。
具体实施方式
35.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
36.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
37.本发明具体实施例中采集新鲜的edta抗凝人外周血，人外周血单核细胞的分离方法为：1.外周血的预处理：将加入抗凝剂的外周血移入离心管中，800g，10min离心，弃去上层血浆，下层细胞加入等体积的pbs溶液，混匀获得细胞悬液；2.将ficoll分离液加入到离心管中；3.将所述细胞悬液平铺到分离液上，在20～25℃、600～800g，20～30min条件下离心，吸取白膜层细胞，加入30ml pbs溶液，在4～20℃600～800g，6～10min条件下离心获得人外周血单个核细胞。将获得的单个核细胞加入1～2ml的pbs溶液重悬，获得细胞悬液，通过细胞计数使细胞悬液浓度1
×
106～1
×
108个/ml。在细胞悬液中按照1:10比例加入冻存保护剂，混合均匀后于程控降温仪(thermo7453)程控降温，然后转入液氮中保存。使用的培养基为gibco品牌rpmi-1640培养基，自体血浆为公司自己制备。以下是自体血浆制备方法：
38.采集血液样本：在无菌条件下，采用穿刺技术从患者的静脉处采集血液样本。通常使用抗凝剂(如柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠)预先加入采集管中，以防止血液凝固；
39.离心分离：将采集的血液样本置于离心机中，在4～20℃、800～1000g，20～30min条件下进行离心分离。离心的目的是将血液分为不同的组分，其中血浆是位于上层的液体部分；
40.血浆处理：将离心分离得到的血浆小心地转移至另一个无菌容器中。
41.人血白蛋白购自上海莱士血液制品股份有限公司。
42.胎盘冻干粉的制备方法：
43.将装有采集到的胎盘(人来源)的采集盒盒盖打开，用剪刀镊子将胎盘上的脐带剪下，另行处理。将胎盘上的羊膜剥下，另行处理。将胎盘泡在自来水中，用手捏住胎盘边缘，顺着大血管的方向，将大血管的血液向剪掉脐带的开口挤出，血液挤出后换水，然后抓住胎盘的揉搓，直至大血管中重新看到血液。3次后浸泡2小时在流水下揉搓胎盘直至胎盘呈粉红色，如果颜色仍然较红，沥干清水后加入生理盐水。将清洗好的胎盘沥干，剪成1cm左右的小块，冻干、磨粉，-40℃备用。
44.实施例及对比例
45.实施例及对比例的具体实施方案冻存保护剂的组分、加入比例以及保存条件如表1。
46.表1
[0047][0048][0049]
测试例1
[0050]
本测试例检测各实施例和对比例冻存后外周血单个核细胞活性及回收率，具体方法为：将实施例和对比例中涉及的在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏：取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，并不断轻轻摇动，保证管内液体在l min内80％溶解，将细胞吸到一定量1640培养基中，并洗涤冻存管1次，移入15ml离心管中，300g离心5min。弃上清，加入适量
培养基，轻轻混匀，留取500μl做计数测细胞活性。用台盼蓝染色计数活细胞，细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合均匀(终浓度0.04％)，然后用血球计数板进行计数。镜下观察计数板中四个象限活细胞数(c)和被染成蓝色的死细胞术(n)，采用下列公式计算细胞活性：活细胞率(％)＝[100-10n/c]
×
100％。冻后粒细胞回收率＝(冻后pbmcs体积
×
冻后pbmcs中粒细胞浓度)/(冻前pbmcs体积
×
冻前pbmcs中粒细胞浓度)
×
100％；冻后总细胞回收率＝(冻后pbmcs体积
×
冻后pbmcs中单个核细胞浓度)/(冻前pbmcs体积
×
冻前pbmcs中单个核细胞浓度)
×
100％。
[0051]
冻存后外周血单个核细胞活性及回收率检测结果如表2所示，由表2可知，采用本发明的冻存保护及冻存后的细胞活性升高，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞回收率增加，总细胞回收率增加。
[0052]
表2
[0053][0054]
测试例2
[0055]
本测试例分析各实施例和对比例冻存后外周血单个核细胞比例及数量，具体检测方法为：取标本200微升，利用希森美康kx-21血球计数仪按照说明书进行血细胞计数。
[0056]
冻存后外周血单个核细胞比例检测结果(
±
s)如表3所示，lymph(％)：淋巴细胞比例；mono(％)：单核细胞比例；eo(％)：嗜酸性粒细胞比例；neut(％)：中性粒细胞比例，由表3可知，采用本发明的冻存保护剂冻存后的中性粒细胞比例增加。
[0057]
表3
[0058]
[0059][0060]
冻存后外周血单个核细胞数量检测结果如表4所示，lymph(#)：淋巴细胞数量；mono(#)：单核细胞数量；eo(#)：嗜酸性粒细胞数量；neut(#)：中性粒细胞数量。由表4可知，采用本发明的冻存保护剂冻存后的中性粒细胞数量增加。
[0061]
表4
[0062]
组别nk(#)
×
108lymph(#)
×
108mono(#)
×
108eo(#)
×
108neut(#)
×
108实施例11.092.570.610.205.49实施例21.082.660.620.215.5实施例31.122.650.640.225.7对比例11.102.550.550.144.67对比例21.112.450.470.134.54对比例31.042.650.580.154.47对比例41.062.720.530.114.78
[0063]
综上所述，本技术设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率。
[0064]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种免疫细胞的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂包括培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉。2.根据权利要求1所述的免疫细胞的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)；优选地，所述冻存保护剂中人血白蛋白的体积百分比为5％～10％；优选地，所述冻存保护剂中胎盘冻干粉的体积百分比为5％～8％。3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)，人血白蛋白的体积百分比为5％～10％，胎盘冻干粉体积百分比为5％～8％。4.权利要求1-3任一项所述的免疫细胞的冻存保护剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉混合，得到所述免疫细胞的冻存保护剂。5.权利要求1-3任一项所述的免疫细胞的冻存保护剂在保存免疫细胞中的应用。6.一种免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括：将外周血单个核细胞配制成细胞悬液，将所述细胞悬液与权利要求1-3任一项所述的免疫细胞的冻存保护剂混合，得到混合液，对所述混合液进行降温处理，转入液氮中保存。7.根据权利要求6所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞密度为1
×
106～1
×
108个/ml。8.根据权利要求6或7所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述细胞悬液与免疫细胞的冻存保护剂的体积比为1:(10～20)。9.根据权利要求6-8任一项所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述降温处理包括：a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；b.以5℃/min降至0℃，保持5min；c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。10.根据权利要求6-9任一项所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述保存方法还包括分离单个核细胞的步骤；优选地，所述分离单个核细胞的方法包括：采集新鲜的抗凝人外周血进行离心处理，分别提取血浆和外周血单个核细胞。

技术总结
本发明公开了一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用。所述冻存保护剂包括培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉。本申请设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率。有效增加粒细胞成分的回收率。


技术研发人员：嵐山芮 许超
受保护的技术使用者：广州瑞铂茵健康科技有限公司
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/11