一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及烟草原料废弃物加工技术领域，尤其涉及一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.烟梗作为卷烟生产中的副产物，每年产生的烟梗废料高达数十万吨，约占烟叶总质量的20％～30％。此外每年烟叶产量450～500万t，年均有效烟叶生产量在210万吨左右，而在打叶复烤和卷烟制造过程中失去预期使用价值的烟草原料废弃物却高达400万t左右。若将这些烟梗和烟草原料废弃物统称为烟草废弃物，则在整个烟草种植和生产过程中，烟草废弃物所占的比例更高，如果不能得到合理利用，不仅浪费资源，而且污染环境。
3.对于烟草种植和生产过程中产生的大量废弃烟叶，其中含有多种植物生长所需营养元素，如酚、醛、醌、脂类芳香物质以及有机酸等，可以作为有机肥料的原料，同时烟草中所含的烟碱物质能有效驱除地下害虫并能够防治作物病害。李雁楠等人在其研究中，利用烟草工业下脚料提取抗虫成分并分析其抗虫谱及抗虫效果，结果发现抗虫成分具有很广的抗虫谱，其中对大型蚤、稻飞虱均具有强大的杀灭作用。抗虫成分主要为烟碱，又名尼古丁，是一种剧毒且难以降解的环境污染物。过量摄入烟碱会引起迷幻作用，严重时导致呼吸困难或心脏麻痹。因此如何降解烟碱同时将烟草原料废弃物转化为有机肥，是目前烟草原料废弃物处理的一个热点。


技术实现要素：

4.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用，本发明将筛选到的具有降解烟碱作用的微生物菌株与腐熟发酵菌剂混合使用，对烟草原料废弃物进行发酵处理，以解决烟草原料废弃物绿色低碳高效处理问题，同时对烟草原料废物的肥料化处理将烟草原料废弃物转变为有机肥，提高烟草原料废弃物的可利用性。
5.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
6.一种芽孢杆菌(bacillus sp.zr-1)，已于2023年5月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no.m 2023841，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
7.菌株在牛肉膏琼脂培养基平板上生长良好，固体发酵3天即开始产生芽孢，无荚膜。
8.本发明的另一目的在于提供了上述的芽孢杆菌在烟草原料废弃物发酵中的应用。
9.在一些实施方式中，所述芽孢杆菌的培养方法为：
10.先将纯菌株在lb平板上进行划线活化，挑取单克隆接种到lb液体培养基中，30℃，170rpm摇床震荡培养48h，然后将培养液接种至固体发酵培养基中，37℃连续发酵7天，发酵产物在80℃烘箱中烘干，粉碎成粉即得zr-1粉剂。
11.在一些实施方式中，所述固体发酵培养基为：麸皮600g/kg，豆粕60g/kg，玉米粉
100g/kg，谷壳200g/kg，硫酸铵10g/kg，磷酸氢二钾6g/kg，七水硫酸镁3.5g/kg，硫酸锰0.1g/kg，碳酸钙10g/kg，石灰22g/kg，固体：液体＝1：1。
12.在一些实施方式中，在烟叶中的发酵步骤为：
13.(1)将烟草原料废弃物经过粉碎处理，并去除原料中的杂物；
14.(2)烟草原料废弃物与辅料进行混合，控制原始物料中碳氮比在25：1～30：1之间；辅料为农业废弃物谷壳、秸秆、畜禽粪便；畜禽粪便使用前经过灭菌处理；
15.(3)向混合料中加水，调整含水量在50％～60％之间；
16.(4)接种发酵菌剂，zr-1粉剂按照1：1000～1：100添加；
17.(5)接种后物料混合均匀后堆成长条形条垛或在槽式通道内进行堆积发酵；
18.(6)整个堆肥过程中，定期监测记录发酵的温度和水分指标，随着堆体温度的变化，当温度超过70℃时，进行合理的翻堆处理或者曝气，促进堆肥发酵腐熟。
19.(7)发酵产物检测显示，发酵产物符合有机肥标准ny/t525要求，同时发酵产物中烟碱含量不继续下降时完成发酵。
20.本发明的又一目的在于提供了一种烟草原料废弃物发酵产品，由包括上述的芽孢杆菌和烟草原料废弃物混合发酵制成。
21.在一些实施方式中，所述产品中的芽孢杆菌包括如下(1)或(2)所示的一种或两种：
22.(1)权利要求1所述的芽孢杆菌的菌群和/或菌剂；
23.(2)权利要求1所述的芽孢杆菌的培养物、溶胞物和/或提取物。
24.将发酵产物用于小麦、黄瓜、玉米等作物的种子发芽试验，发芽率100％，与常规营养土没有差异，同时对黄瓜苗、小麦苗的长势调查发现，当生长基质中烟碱控制在0.5％以内，烟草原料废弃物的发酵产物对黄瓜生长具有促进作用。
25.根据16srdna序列分析，确定该菌株为芽孢杆菌，命名为zr-1。
26.本发明的有益效果在于：
27.本发明的一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用，通过从土壤中分离获得一株降解烟碱的芽孢杆菌zr-1，利用该菌株可以有效降解烟草原料废弃物中烟碱含量，降解率在65％左右。利用本发明中菌种发酵处理烟草原料废弃物，不仅降低烟草原料废弃物中烟碱含量，还促进烟草原料废弃物的肥料化，提高烟草原料废弃物的可利用性，在烟草原料废弃物的低碳环保处理方面具有良好应用前景。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明芽孢杆菌形态。
30.图2为本发明发酵产物中不同烟碱浓度对黄瓜生长的影响。
31.图3为本发明发酵产物中不同烟碱浓度对小麦生长的影响。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
33.在任一实施例中，本发明的一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用，所述芽孢杆菌的培养方法为：
34.先将纯菌株在lb平板上进行划线活化，挑取单克隆接种到lb液体培养基中，30℃，170rpm摇床震荡培养48h，然后将培养液接种至固体发酵培养基中，37℃连续发酵7天，发酵产物在80℃烘箱中烘干，粉碎成粉即得zr-1粉剂。
35.所述固体发酵培养基为：麸皮600g/kg，豆粕60g/kg，玉米粉100g/kg，谷壳200g/kg，硫酸铵10g/kg，磷酸氢二钾6g/kg，七水硫酸镁3.5g/kg，硫酸锰0.1g/kg，碳酸钙10g/kg，石灰22g/kg，固体：液体＝1：1。
36.在一个具体实施例中，本发明的一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用，包括以下步骤：
37.烟草原料废弃物的预处理：将烟草原料废弃物经过简单的粉碎处理，使物料粒径控制在5cm以内，去除原料中铁丝、绳线、塑料薄膜、石块等杂物。
38.烟草原料废弃物与辅料进行混合，控制原始物料中碳氮比在25：1～30：1之间。
39.向混合料中加水，控制含水量在50％～60％之间。
40.接种发酵菌剂，按照1：100-1000添加，在拌料过程中以机械或人工方式均匀混入。
41.接种后物料混合均匀后堆成长条形条垛或在槽式通道内进行堆积发酵。
42.整个堆肥过程中，定期监测记录发酵的温度和水分指标，随着堆体温度的变化，当温度超过70℃时，进行合理的翻堆处理或者曝气，促进堆肥发酵腐熟。
43.发酵产物检测显示，发酵产物基本符合有机肥标准ny/t525要求，同时发酵产物中烟碱含量不继续下降为止。
44.在一个具体实施例中，烟粉烟梗混合，发酵菌剂接种1％，控制原始物料中碳氮比25～30：1，设置3个重复，烟碱含量变化如下：
45.处理烟碱含量(％)对照1.5处理10.53处理20.54处理30.53
46.通过菌剂接种发酵之后，与对照样品的烟碱含量1.5％相比，处理中烟碱含量下降至0.53％左右，烟碱含量相比于对照下降了65％。
47.烟碱含量检测方法：高效液相色谱法检测；
48.烟碱降解率＝100％
×
(c
0-c1)/c0；
49.c0：接入菌株芽孢杆菌前烟草原料废弃物中烟碱浓度；
50.c1：接入菌株芽孢杆菌后某天发酵产物中烟碱浓度；
51.发酵产物中烟碱含量的测定：分别精密称取0.5g样品，置具塞锥形瓶中，加入
0.4％氢氧化钠溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理4h，冷却至室温，称定重量，以0.4％氢氧化钠溶液补助减失的重量，摇匀后用0.22um微孔滤膜过滤，作为供试品。
52.精密称取烟碱对照9.03mg，用甲醇职称浓度分别为0.001806mg/ml，0.01806mg/ml，0.0903mg/ml，0.4515mg/ml，0.903mg/ml的对照溶液。
53.利用高效液相色谱仪检测，检测条件：中谱科技中谱红色谱柱(aq-c18 4.6*250mm 5um，lc-164)，流动相为甲醇(0.02mol/l)：磷酸盐缓冲溶液(三乙胺调节ph＝6.5)＝30∶70，流速1.0ml/min，检测波长260nm，柱温35℃。
54.标准曲线建立：按照上述条件测定以上系列对照品溶液，测定峰面积，用excel做峰面积(y)与烟碱浓度(x，mg/ml)的线性回归方程：
55.y＝9033204.15054x
–
13565.39807(r2＝1.00000)；
56.发酵产物在黄瓜、小麦发芽率统计结果，促生长调查数据结果；
57.将发酵产物与常规营养土按照不同比例混配成烟碱终浓度分别为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％和1％(用烟草原料废弃物来调节)的基质，以常规营养土作为对照基质(ck)，分装到穴盘中，分别种植黄瓜和小麦种子。生长7～10天后，分别统计小麦和黄瓜的发芽率以及长势相关指标。
58.发酵产物中不同烟碱浓度对黄瓜生长的影响；
59.烟碱含量1％0.50％0.40％0.30％0.20％0.10％ck鲜重0.15e0.89d1.16c1.41b1.57a1.47ab0.83d株高3.03g9.81f11.84d13.03c14.67a13.77b10.57e叶长0d3.48b3.91a4.09a4.03a4.03a2.49c叶宽0d4.26b5.05a5.29a5.06a5.2a3.07c出芽率91％100％100％100％100％100％100％
60.发酵产物中不同烟碱浓度对小麦生长的影响
61.烟碱含量1％0.50％0.30％0.20％0.10％ck地上鲜重0.08e0.19cd0.23a0.22ab0.17d0.20bc地下鲜重0.02c0.05ab0.05ab0.04b0.04b0.06a株高9.2c18.44b23.12a22.19a19.20b18.62b根长3.10d11.18b8.77c12.45ab10.97b12.54a出芽率34％100％97％100％100％100％
62.发酵产物中不同烟碱浓度对玉米生长的影响
63.烟碱浓度ck0.10％0.20％0.30％0.40％0.50％0.60％株高49.83b55.36a42.21c24.75d10.87e5.01f5.37f地上鲜重3.15b4.55a2.36c1.29d0.52e0.12e0.09e根长20.40a22.19a22.32a7.96b5.82b1.17b1.24b地下鲜重1.18a1.20a0.66b0.36c0.20cd0.07d0.04d
64.将发酵产物用于小麦、黄瓜、玉米等作物的种子发芽试验，发芽率100％，与常规营养土没有差异，同时对黄瓜苗的长势调查发现，当生长基质中烟碱控制在0.5％以内，烟草发酵产物对黄瓜生长具有促进作用。
65.通过调节发酵产物中烟碱的浓度并种植小麦，结果发现小麦对烟碱的耐受浓度在0.5％左右，烟碱含量低于0.5％的发酵产物不但对小麦发芽率没有显著影响，同时对于小麦的地上鲜重和株高等性状具有促生作用。
66.通过调节发酵产物中烟碱浓度并种植玉米，结果发现玉米苗对烟碱的耐受浓度在0.3％～0.4％左右，当烟碱浓度在0.1％时，发酵产物不但不影响玉米苗正常生长，甚至在株高、地上鲜重等指标上显著高于对照处理，说明发酵产物对玉米生长也具有促生作用。
67.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一种芽孢杆菌(bacillus sp.zr-1)，已于2023年5月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no.m 2023841。2.如权利要求1所述的芽孢杆菌在烟草原料废弃物发酵中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌的培养方法为：先将纯菌株在lb平板上进行划线活化，挑取单克隆接种到lb液体培养基中，30℃，170rpm摇床震荡培养48h，然后将培养液接种至固体发酵培养基中，37℃连续发酵7天，发酵产物在80℃烘箱中烘干，粉碎成粉即得zr-1粉剂。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固体发酵培养基为：麸皮600g/kg，豆粕60g/kg，玉米粉100g/kg，谷壳200g/kg，硫酸铵10g/kg，磷酸氢二钾6g/kg，七水硫酸镁3.5g/kg，硫酸锰0.1g/kg，碳酸钙10g/kg，石灰22g/kg，固体：液体＝1：1。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在烟草原料废弃物中的发酵步骤为：(1)将烟草原料废弃物经过粉碎处理，并去除原料中的杂物；(2)烟草原料废弃物与辅料进行混合，控制原始物料中碳氮比在25：1～30：1之间；辅料为农业废弃物谷壳、秸秆、畜禽粪便；(3)向混合料中加水，调整含水量在50％～60％之间；(4)接种发酵菌剂，zr-1粉剂按照1：1000～1：100添加；(5)接种后物料混合均匀后堆成长条形条垛或在槽式通道内进行堆积发酵；(6)整个堆肥过程中，定期监测记录发酵的温度和水分指标，随着堆体温度的变化，当温度超过70℃时，进行合理的翻堆处理或者曝气，促进堆肥发酵腐熟；(7)发酵产物检测显示，发酵产物符合有机肥标准ny/t525要求，同时发酵产物中烟碱含量不继续下降时完成发酵。6.一种烟草原料废弃物发酵产品，其特征在于，由包括权利要求1所述芽孢杆菌和烟草原料废弃物混合发酵制成。7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品中包括如下(1)或(2)所示的一种或两种：(1)权利要求1所述的芽孢杆菌的菌群和/或菌剂；(2)权利要求1所述的芽孢杆菌的培养物、溶胞物和/或提取物。

技术总结
本发明公开了一种降解烟碱的芽孢杆菌及其应用，通过从土壤中分离获得一株降解烟碱的芽孢杆菌ZR-1，利用该菌株可以有效降解烟草原料废弃物中烟碱含量，降解率在65％左右。利用本发明中菌种发酵处理烟草原料废弃物，不仅降低烟草原料废弃物中烟碱含量，还促进烟草原料废弃物的肥料化，提高烟草原料废弃物的可循环利用性，在烟草原料废弃物的低碳环保处理方面具有良好应用前景。具有良好应用前景。具有良好应用前景。


技术研发人员：张宝 姜继红 王斌 韩松 陈兴旺 王登杰 薛琴 张婧 欧小龙 魏思乐 李霞
受保护的技术使用者：绵阳市农业科学研究院
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/10/11