一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法与流程

1.本发明涉及水稻种植技术领域，具体涉及一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法。


背景技术：

2.土壤的盐渍化影响种子萌发、限制作物生长发育，是导致减产的第二大非生物胁迫。在人口数量不断增加、耕地面积日趋减少和淡水资源严重不足的压力下，合理开发利用盐碱地，是全世界范围内的一个重要课题。
3.盐碱地种植水稻不仅可以扩大粮食作物种植面积，还可以改良盐碱地。而水稻是中等敏盐作物，其种子萌发期与幼苗期是水稻一生中的重要阶段，对盐胁迫反应较为敏感，若土壤中盐分过多在种子萌发过程中易出现出苗率低、出苗不整齐等盐害症状。前人为提高水稻耐盐性做了大量研究，已有近千个水稻不同生育时期耐盐相关qtl被报道，但仅有kcl1和hst1基因被图位克隆，来自pokkali的saltol被精细定位，且仅有saltol耐盐基因被成功用于水稻耐盐性分子改良，因此利用分子标记辅助选择技术将耐盐基因导入盐敏感水稻中提高其耐盐性存在育种周期长，难以应用的缺点。
4.在盐胁迫下，为抵御盐害水稻体内发生了复杂的生理变化，积累大量的代谢产物，如提高体内脯氨酸的含量以调节盐胁迫时的渗透平衡。应用代谢组学对植物进行逆境胁迫研究，为植物耐盐生理机制提供了新的视野。但目前大都集中在植物受到逆境胁迫后代谢产物或代谢途径的改变，且对水稻耐盐代谢组学的研究较少，特别是如何利用盐胁迫下水稻自身代谢物来提高水稻耐盐性方面的报道更少。
5.

技术实现要素：

6.解决的技术问题：针对现有技术中存在上述技术问题，本发明提供一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，所述方法成本低廉，能够有效提高盐敏感水稻盐胁迫下的发芽率、根长、和生长速率。
7.技术方案：一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，步骤如下：步骤一.用3-10 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为50-400 mg/l的dl-哌啶酸溶液，然后将水稻种子表面消毒；步骤二.将消毒后的水稻种子在dl-哌啶酸溶液中于20-30℃温度下浸种16-24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。
8.作为优选，所述快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法具体为盐敏感水稻种子在盐胁迫条件下快速提高其发芽率、根长和生长速率的方法。
9.作为优选，所述步骤一中水稻种子表面消毒具体步骤如下：选取籽粒饱满无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70-75 wt.%乙醇溶液快速润洗2-3次，每次20-40 s，无菌水冲洗2-3次，再用5-10 wt.% naclo溶液灭菌5-15 min，无菌水冲洗3-5次，最后用无菌滤纸吸干种
子表面附着水即可。
10.作为优选，所述步骤一中用5 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为100mg/l的dl-哌啶酸溶液。
11.作为优选，所述步骤二中盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为dl-哌啶酸和nacl的混合溶液，其中dl-哌啶酸浓度为0-400mg/l，nacl浓度为3-10 wt.
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。
12.作为优选，检验步骤二中水稻种子发芽率、根长和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于20-30℃进行暗培养2-3d，然后再进行光培养，光照强度为4000-10000 lx，光培养2-4天后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔pcr平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25-30℃，光照强度4000-10000 lx，湿度为60-80%，光培养：暗培养为16h:8h，然后用步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液进行水培，每3天换一次水培液，14天后测量幼苗株高、根长、干重。
13.作为优选，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5cm视为发芽。
14.有益效果：1）本发明提出一种盐敏感水稻种子在盐胁迫条件下快速提高其发芽率、根长和生长速率的方法，能够有效提高盐敏感水稻的耐盐性。无盐胁迫下，盐申稻83006种子发芽率约为100%，说明挑选的种子发芽率高且整齐一致，平均株高6.49cm，根长9.89cm；5
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盐胁迫下，发芽率急剧下降为72.33%，株高4.06cm，根长7.67cm，外源dl-哌啶酸100-400mg/l浸种处理均极显著提高5
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盐胁迫下种子的发芽率，其中浓度为100mg/l处理后发芽率达87.33%，株高5.42cm，根长12.25cm。
15.2）本发明采用的dl-哌啶酸是发明人前期研究发现的一种耐盐相关代谢物，有研究报道它对植物的免疫至关重要，但未见其在植物耐盐应用方面的报道。本发明利用外源dl-哌啶酸增加盐敏感水稻品种的耐盐性，可满足我国沿海滩涂对高产、优质、抗病、耐盐、直播水稻品种的迫切需求。
16.3）与发明人在先申请的专利文献（公开号cn112020930 b）相比，在先申请文件中用到的5-羟基-l-正缬氨酸较难购买，且价格昂贵，100mg约2000元左右，难以大量应用于耐盐水稻生产；而本发明提出的dl-哌啶酸价格低廉，100克约200元左右，且dl-哌啶酸对促进根的生长作用非常明显，5
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盐胁迫下100-400mg/l的dl-哌啶酸处理后的根长均极显著长于无胁迫处理下的根长，而5羟基正缬氨酸对根系生长无显著促进作用。
17.附图说明
18.图1为含有100 mg/l的dl-哌啶酸浸种处理后的种子发芽率与未处理对照在5
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盐胁迫下生长7天对比图，图中a为未处理对照在5
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盐胁迫下生长7天的种子发芽图，b为100 mg/l的dl-哌啶酸溶液浸种处理后在5
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盐胁迫下生长7天的种子发芽图。
19.图2为含有100 mg/l的dl-哌啶酸与对照在5
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盐胁迫下生长14天对比图，图中a为未处理对照在5
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盐胁迫下生长14天的表型，b为含有100 mg/l的dl-哌啶酸在5
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盐胁迫下生长14天的表型。
20.具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
22.本说明书实施例中水稻（oryza sativa l.）为盐申稻83006。dl-哌啶酸（cas号为4043-87-2）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，含量》97.5%。nacl为常规化学试剂。
23.实施例1一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，步骤如下：步骤一. 用3 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为50 mg/l的dl-哌啶酸溶液，然后将水稻种子表面消毒，消毒过程如下：选取籽粒饱满无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70wt.%乙醇溶液快速润洗2次，每次20s，无菌水冲洗2次，再用5wt.% naclo溶液灭菌5min，无菌水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水。
24.步骤二. 将水稻种子用步骤一制得的dl-哌啶酸溶液于20℃温度下浸种16h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫下正常发芽生长即可。所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为dl-哌啶酸和nacl的混合溶液，其中dl-哌啶酸浓度为50mg/l，nacl浓度为3wt.
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25.检验步骤二中处理后的水稻种子发芽率、根长和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于20℃进行暗培养2d，然后再进行光培养，光照强度为4000 lx，光培养2天后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5cm视为发芽；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔pcr平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25℃，光照强度4000lx，湿度为60-80%，光培养：暗培养为16h:8h，然后用步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液进行水培，每3天换一次水培液，14天后测量幼苗株高、根长、干重。
26.实施例2一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，步骤如下：步骤一. 用10 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为400 mg/l的dl-哌啶酸溶液，然后将水稻种子表面消毒，消毒过程如下：选取籽粒饱满无霉菌斑点的成熟水稻种子，用75wt.%乙醇溶液快速润洗3次，每次40s，无菌水冲洗3次，再用10wt.% naclo溶液灭菌15min，无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水。
27.步骤二. 将水稻种子用步骤一制得的dl-哌啶酸溶液于30℃温度下浸种24h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫下正常发芽生长即可。所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为dl-哌啶酸和nacl的混合溶液，其中dl-哌啶酸浓度为400mg/l，nacl浓度为10wt.
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28.检验步骤二中处理后的水稻种子发芽率、根长和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于30℃进行暗培养3d，然后再进行光培养，光照强度为10000 lx，光培养4天后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5cm视为发芽；将发芽后的幼苗转
入截去底部的96孔pcr平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为30℃，光照强度10000lx，湿度为60-80%，光培养：暗培养为16h:8h，然后用步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液进行水培，每3天换一次水培液，14天后测量幼苗株高、根长、干重。
29.实施例3一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，步骤如下：步骤一. 用5 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为100 mg/l的dl-哌啶酸溶液，然后将水稻种子表面消毒，消毒过程如下：选取籽粒饱满无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70 wt.%乙醇溶液快速润洗2次，每次30s，无菌水冲洗2次，再用5wt.% naclo溶液灭菌5min，无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水。
30.步骤二. 将水稻种子用步骤一制得的dl-哌啶酸溶液于25℃温度下浸种24h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫下正常发芽生长即可。所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为同步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl的混合溶液检验步骤二中处理后的水稻种子发芽率、根长和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒（19cmх14cmх12cm）中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于28℃进行暗培养3d，然后再进行光培养，光照强度为4000 lx，光培养3d后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5cm视为发芽；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔pcr平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25℃，光照强度4000lx，湿度为60-80%，光培养：暗培养为16h:8h，然后用步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液进行水培，每3天换一次水培液，14天后测量幼苗株高、根长、干重。
31.实施例4同实施例3，区别在于，步骤一中用5 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为200 mg/l的dl-哌啶酸溶液。
32.实施例5同实施例3，区别在于，步骤一中用5 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为400 mg/l的dl-哌啶酸溶液。
33.对比例1同实施例3，区别在于，步骤一中将浓度200mg/l的dl-哌啶酸溶液换成同等体积的无菌水。
34.对比例2同实施例3，区别在于，步骤一中将浓度200mg/l的dl-哌啶酸溶液换成同等体积的5 wt.
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nacl溶液。
35.实施例3-5及对比例1和对比例2处理后的水稻种子发芽率和幼苗生长状况见下表：不同浓度dl-哌啶酸对5
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盐胁迫下种子发芽率和幼苗生长的影响
36.图1为含有100 mg/l的dl-哌啶酸浸种处理后的种子发芽率与未处理对照在5
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盐胁迫下生长7天对比图，图2为含有100 mg/l的dl-哌啶酸与对照在5
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盐胁迫下生长14天对比图，从表中以及图1和图2中可以看出，无盐胁迫条件下，盐申稻83006种子发芽率约为100%，说明挑选的种子发芽率高且整齐一致；5
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盐胁迫下，发芽率急剧下降为72.33%，外源dl-哌啶酸100-400mg/l浸种处理均极显著提高5
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盐胁迫下的发芽率至86.67-88.67%。与nacl单独处理相比，100-400mg/l的dl-哌啶酸处理均使幼苗在盐胁迫下的生物量增加，其中以100mg/l处理时效果最好（幼苗生长14d后照片见图2b）。因此选用100mg/l的dl-哌啶酸为最佳浓度。
37.本说明书实施例中由于实验室条件限制，所以盐胁迫环境设定为浇灌水盐胁迫溶液为dl-哌啶酸和nacl的混合溶液，其中dl-哌啶酸浓度为0-400mg/l，nacl浓度为3-10 wt.
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。实际种植时，将处理后的水稻种子种植在盐渍土/或者盐胁迫环境均可。
38.上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或者等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，步骤如下：步骤一.用3-10 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为50-400 mg/l的dl-哌啶酸溶液，然后将水稻种子表面消毒；步骤二.将消毒后的水稻种子在dl-哌啶酸溶液中于20-30℃温度下浸种16-24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。2.根据权利要求1所述的一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，所述快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法具体为盐敏感水稻种子在盐胁迫条件下快速提高其发芽率、根长和生长速率的方法。3.根据权利要求1所述的一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤一中水稻种子表面消毒具体步骤如下：选取籽粒饱满无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70-75 wt.%乙醇溶液快速润洗2-3次，每次20-40 s，无菌水冲洗2-3次，再用5-10 wt.% naclo溶液灭菌5-15 min，无菌水冲洗3-5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水即可。4.根据权利要求1所述的一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤一中用5 wt.
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nacl溶液溶解dl-哌啶酸，配制成浓度为100mg/l的dl-哌啶酸溶液。5.根据权利要求1所述的一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤二中盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为dl-哌啶酸和nacl的混合溶液，其中dl-哌啶酸浓度为0-400mg/l，nacl浓度为3-10 wt.
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。6.根据权利要求1所述的一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，检验步骤二中水稻种子发芽率、根长和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于20-30℃进行暗培养2-3d，然后再进行光培养，光照强度为4000-10000 lx，光培养2-4天后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔pcr平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25-30℃，光照强度4000-10000 lx，湿度为60-80%，光培养：暗培养为16h:8h，然后用步骤一同等浓度的dl-哌啶酸和nacl混合溶液进行水培，每3天换一次水培液，14天后测量幼苗株高、根长、干重。7.根据权利要求6所述的一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，其特征在于，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5cm视为发芽。

技术总结
一种快速提高盐敏感水稻耐盐性的方法，属于水稻种植技术领域。步骤如下：步骤一.用3-10 wt.


技术研发人员：张桂云 孙明法 朱国永 王爱民 唐红生 严国红 胡蕾 刘凯 施伟 孙一标 赵绍路 朱静雯 代金英 张梦龙 程新杰 岳红亮
受保护的技术使用者：江苏沿海地区农业科学研究所
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/10/11