兼容不同体积封装的PCR反应试剂、试剂盒及其分装方法和扩增方法与流程

兼容不同体积封装的pcr反应试剂、试剂盒及其分装方法和扩增方法
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，尤其是涉及兼容不同体积封装的pcr反应试剂、试剂盒及其分装方法和扩增方法。


背景技术：

2.体外诊断中应用比较多的技术通常包含核酸分析，能确定病原体、遗传疾病、癌症的存在，或与易感性、严重程度或对治疗的反应相关的患者病情的动态化监控检测。当然，在其他的一些场景中也有应用，例如刑侦、农业种子改良分析等等。上述用于研究和/或诊断目的的核酸检测和/或分子诊断方法通常包含以下步骤：1)收集生物样本；2)生物样本内的细胞或病毒颗粒的裂解；3)核酸提取纯化；以及4)使用变温循环pcr技术或恒温循环的rpa等方案扩增靶标进而完成检测dna或rna。目前比较多的场景中采用的方案为预封装类型的试剂盒，如此一线的使用者只需要提供处理完成的样本或者包含靶标的提取产物，并将其添加至试剂盒内即可实现上机扩增的目标，使用过程便捷操作效率也更高。
3.为了保证高效率扩增，不同公司设计了不同类型的试剂盒，欧洲发明专利ep0590327b1保护了一种能够对于全血样本进行高效扩增的pcr检测试剂盒，扩增试剂盒中添加了抗凝剂肝素、柠檬酸盐和edta等至少之一的试剂，并且随着添加的处理试剂不同，需要添加不同浓度的二价正离子的盐，其中抗凝剂肝素对应的正价离子浓度在10-160mm内，edta对应的正价离子浓度在10-135mm内，柠檬酸盐对应的正价离子浓度在30-200mm间；欧洲发明专利ep2048247b1为了保证检测试剂盒检测的高效性，对于样本用量进行了限定，探索出了最佳的样本用量范围；欧洲发明专利ep3443124b1则授权了一种不包含pcr聚合酶的预封装试剂盒，在使用中通过增加聚合酶的添加步骤来解决整体预封装方案中酶的活性可能受到影响而无法保障稳定性的问题；中国发明专利申请cn109072291a则重点关注了试剂盒预封装方案中由于存在高分子有机物可能产生气泡的问题，在试剂盒中引入了消泡剂保证扩增的可靠性；美国发明专利us10351840b2关注了酸碱度对于反应体系试剂的保护作用，其应用于rna类型病毒的检测试剂盒中，最主要的是逆转录酶具有最高活性的ph值环境，而为了保障试剂盒稳定保存等性能，预封装的此类试剂盒具有低于最高活性ph的保存环境；中国发明专利申请cn113481287a公开了一种能够在2-8℃的温度范围内进行更长效稳定保存的试剂盒；中国发明专利申请cn113490749a公开的技术方案对比了不同比例的proclin对于扩增曲线影响很大，尤其是对于存储过程中的影响因素进行了全面探索。但是上述的各种技术基本上均以靶标的特异性差异为切入点，差别化地进行试剂盒设计，然而在实际使用过程中由于特殊的需求，将产生不同体积的试剂预封装方案，总结来看这种技术一般采用相同或者相近的封装工艺设备，关注更多的也是反应体系试剂的兼容性设计，而目前的现有技术中鲜有类似研究。
4.现有试剂盒按照不同的应用场景将出现不同含水量的封装试剂盒，而这种需求下封装的试剂盒内最终封装的pcr反应体系试剂体积差异很大，目前各类厂家所采用的基本
为相同体积的pcr反应体系试剂封装方案，其对于稳定化保存需求无法很好满足，并且不同体积封装一般采用不同的封装产线进行，如此需要针对性设计封装体系试剂各组分配置，并且还需要改变生产设备和相关工艺，使得成本巨高。
5.因此，亟待开发一种能够兼容不同体积封装的反应体系，实现在基本不改变现有封装设备或者工艺的基础上，能够最终实现不同场景需求下的预封装的反应体系稳定保存和后续的可靠性检测目标。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术的不足，提供了兼容不同体积封装的pcr反应试剂、试剂盒及其分装方法和扩增方法。在基本不改变现有封装设备或者工艺的基础上，能够实现不同体积封装的反应体系稳定保存和后续的可靠性检测目标。
7.为此，本发明第一方面提供了一种兼容不同体积封装的pcr反应试剂，包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp；还包括补充至少两种不同体积的水以形成不同体积封装的pcr反应试剂；所述pcr反应试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组的含量不小于内标引物探针组的含量。
8.在本发明的一些实施方式中，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中mg2+浓度为1.5-6.5mm，优选为2-6mm，更优选为3-5mm。在一些例子中，例如，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中mg2+浓度包括但不限于：1.5mm、2mm、3mm、3.1mm、3.2mm、4mm、5mm、5.5mm、6mm或6.5mm。
9.根据本发明，mg2+是taq dna酶不可或缺的辅助因子，在pcr中的可以与dna聚合酶形成镁离子-酶复合物，从而激活dna聚合酶的催化活性，促进pcr反应的进行。能够调节反应体系的离子环境，使得酶催反应在最适条件下进行，同时可以降低退火温度，促进引物与dna的结合。因此，镁离子浓度过高可降低pcr扩增的特异性，产生非特异性扩增，浓度过低则使得酶活力降低，pcr扩增效率变差，甚至使pcr扩增失败，为了保证不同体积封装的试剂盒均能兼容性扩增得到准确的扩增结果，需要保证配置pcr反应试剂的mg2+在一定的浓度范围内。
10.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中还包括甘油，所述甘油在未补充水的pcr反应试剂中的浓度为0.04-0.1mm，优选为0.05-0.09mm。在一些例子中，例如，所述甘油在未补充水的pcr反应试剂中的浓度包括但不限于：0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm或0.1mm。
11.根据本发明，在pcr扩增反应中甘油具有保护taq酶的稳定性，增加酶的耐高温性质，同时，甘油作为一种低温保护剂，可延长试剂的保存稳定性。甘油还能降低高gc序列的二级结构，提高扩增反应的特异性。甘油浓度过高则可能对后续扩增产生影响，同时小体积封装试剂盒中的甘油浓度更高，在保存过程中将使不同体积的封装方案后续扩增检测的差异性更大，而过低的浓度则很难发挥甘油的保护作用，在小体积封装试剂盒中能起到保护作用的甘油浓度对于大体积封装试剂盒则可能存在无法保护的问题，进而也将导致扩增结果差异过大；因此为了兼容两种体积封装的试剂盒，添加甘油的浓度至关重要。
12.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中还包括第一组分稳定剂或第二
组分稳定剂。
13.在本发明的一些实施方式中，所述第一组分稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮。
14.在本发明的一些实施方式中，所述第二组分稳定剂包括葡聚糖和proclin 300。
15.在本发明的一些实施方式中，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中聚乙烯吡咯烷酮的含量为0.01％-0.02％。在一些例子中，例如，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中聚乙烯吡咯烷酮的含量包括但不限于：0.01％、0.012％、0.015％、0.018％或0.02％。
16.在本发明的一些实施方式中，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中葡聚糖的含量为0.01％-1％，优选为0.05％-0.8％，更优选为0.1％-0.6％。在一些例子中，例如，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中葡聚糖的含量包括但不限于：0.01％、0.05％、0.08％、0.1％、0.3％、0.5％、0.6％、0.8％或1％。
17.在本发明的一些实施方式中，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中proclin300的浓度百分比为0.01％-0.1％，优选为0.04％-0.09％。在一些例子中，例如，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中proclin300的浓度百分比包括但不限于：0.01％、0.02％、0.04％、0.05％、0.07％、0.09％或0.1％。
18.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂包括补充两种不同体积的水以形成不同体积封装的pcr反应试剂。
19.在本发明的另一些实施方式中，所述pcr反应试剂还可以但不限于包括补充三种、四种或五种不同体积的水以形成不同体积封装的pcr反应试剂。
20.在本发明的一些实施方式中，补充所述两种不同体积的水的体积比值不小于2；优选为8-195倍，更优选为8-193.9倍，更优选为8-23.8倍，更优选为8.6-13.9倍。在一些例子中，例如，补充所述两种不同体积的水的体积比值可以但不限于为2倍、3倍、3.6倍、5倍、8倍、8.6倍、10倍、13.9倍、20倍、23.8倍、30倍、50倍、100倍、193.9倍或195倍。
21.在本发明的一些实施方式中，所述对应于靶标基因的靶标引物探针组包括靶标正向引物、靶标反向引物和靶标探针。
22.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中靶标正向引物浓度为0.1-3μm。
23.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中靶标反向引物浓度为0.1-3μm。
24.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中靶标探针浓度为0.1-1μm。
25.在本发明的一些实施方式中，所述内标引物探针组包括内标正向引物、内标反向引物和内标探针。
26.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中内标正向引物浓度为0.1-1μm。
27.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中内标反向引物浓度为0.1-1μm。
28.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中内标探针浓度为0.1-1μm。
29.在本发明的一些实施方式中，所述聚合酶包括taq dna聚合酶。
30.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中聚合酶浓度为240000u/l。
31.在本发明的一些实施方式中，所述5b(+)工作液为5
×
含甘油buffer工作液。
32.在本发明中，5b(+)工作液和聚合酶保存在甘油中，能更好地保护酶的活性，以防止酶在水中保存可能产生的变质。
33.在本发明的一些实施方式中，所述buffer为10
×
buffer。
34.在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应试剂中dntp的浓度为0.6mm。
35.本发明第二方面提供了兼容不同体积封装的pcr反应试剂盒，包括n个井单元，一所述井单元内包含以第一体积或第二体积封装的如本发明第一方面所述的pcr反应试剂；所述第二体积的pcr反应试剂中水的体积不小于第一体积的pcr反应试剂中水的体积的2倍；优选为8-195倍，更优选为8-193.9倍，更优选为8-23.8倍，更优选为8.6-13.9倍。在一些例子中，例如，第二体积的pcr反应试剂中水的体积可以但不限于为第一体积的pcr反应试剂中水的体积的2倍、3倍、3.6倍、5倍、8倍、8.6倍、10倍、13.9倍、20倍、23.8倍、30倍、50倍、100倍、193.9倍或195倍。
36.在本发明的一些实施方式中，所述n为不小于1的整数。在一些例子中，例如，所述n包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7或8。
37.根据本发明，所述第一体积的pcr反应试剂中水的体积为0.57μl。
38.根据本发明，所述第二体积的pcr反应试剂中水的体积为13.57μl。
39.水根据对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp的添加体积进行添加，添加水将pcr反应试剂的体积补足至第一体积或第二体积。
40.在本发明的一些实施方式中，所述第一体积的pcr反应试剂和第二体积的pcr反应试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp各组分的体积相等。
41.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的检测灵敏度的dna含量不低于0.5ng/反应。
42.在本发明的一些实施方式中，当所述pcr反应试剂为第一体积时，所述pcr反应试剂包括第一组分稳定剂；和/或，当所述pcr反应试剂为第二体积时，所述pcr反应试剂包括第二组分稳定剂。
43.本发明也关注到由于存储时间或者存储环境造成的检测结果差异，当所述pcr反应试剂盒为小体积封装时，所述pcr反应体系还包含第一组分稳定剂，当所述pcr反应试剂盒为大体积封装时，所述pcr反应体系还包含第二组分稳定剂，所述第一组分稳定剂与所述第二组分稳定剂不相同，如此，只需要很小地改动生产工艺和流程，只差异稳定剂配置流程工艺与相关设备即可实现非标准环境内长效稳定保存试剂盒的效果。
44.在本发明的一些实施方式中，所述第一体积为4.5-6μl。在一些例子中，例如，所述第一体积包括但不限于：4.5μl、5μl、5.5μl或6μl。
45.在本发明的一些实施方式中，所述第二体积为18μl。
46.本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的兼容不同体积封装的pcr反应试剂盒的分装方法，包括如下所述的分装方法：
47.先混合对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp形成能用于分装不少于m个pcr反应试剂的反应液，再定量加入第五体积或第六体积的水，第六体积不小于第五体积的2倍，形成第一待分装试剂或第二待分装试剂，再将第一待分装试剂以第一体积分别加入每一个所述井单元内或将第二待分装试剂以第二体积分别加入每一个所述井单元内，以形成第一体积或第二体积的pcr反应试剂。
48.在本发明的一些实施方式中，所述的分装方法还可以为：先向每一个所述井单元中分别定量加入包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp的反应液，再向每一个所述井单元中分别定量加入第三体积或第四体积的水，第四体积不小于第三体积的2倍，以形成第一体积或第二体积的pcr反应试剂。
49.在本发明的一些实施方式中，为了保证试剂配制的精准性，所述m优选为不小于5的整数。在一些例子中，例如，所述m包括但不限于：15、35、80、100、200、500、800或1000。
50.在本发明的一些实施方式中，所述第一体积的pcr反应试剂和第二体积的pcr反应试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp各组分的添加量相等。这种设计是兼容性设计的前提，整个分装流程所使用的设备也可以相同，使得分装成本也较低。
51.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述靶标正向引物的添加体积为0.03-0.15μl。
52.根据本发明，每一个所述井单元中所述靶标正向引物的添加体积为0.05μl。
53.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述靶标反向引物的添加体积为0.03-0.15μl。
54.根据本发明，每一个所述井单元中所述靶标反向引物的添加体积为0.05μl。
55.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述靶标探针的添加体积为0.03-0.05μl。
56.根据本发明，每一个所述井单元中所述靶标探针的添加体积为0.03μl。
57.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述内标正向引物的添加体积为0.03-0.05μl。
58.根据本发明，每一个所述井单元中所述内标正向引物的添加体积为0.05μl。
59.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述内标反向引物的添加体积为0.03-0.05μl。
60.根据本发明，每一个所述井单元中所述内标反向引物的添加体积为0.05μl。
61.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述内标探针的添加体积为0.03-0.05μl。
62.根据本发明，在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中所述内标探针的添加体积为0.03μl。
63.根据本发明，每一个所述井单元中所述聚合酶的添加体积为0.4μl。
64.根据本发明，每一个所述井单元中所述5b(+)工作液的添加体积为1.8μl。
65.根据本发明，每一个所述井单元中所述buffer的添加体积为1.1μl。
66.根据本发明，每一个所述井单元中所述mgcl2的添加体积为0.01μl
67.根据本发明，每一个所述井单元中所述tris工作液的添加体积为0.6μl。
68.根据本发明，每一个所述井单元中所述dntp的添加体积为0.3μl。
69.本发明第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的兼容不同体积封装的pcr反应试剂盒的扩增方法，所述扩增方法包括：向所述井单元内分装好的pcr反应试剂中加入包含靶标基因的样本液，形成包含靶标基因的待扩增混合液；使所述待扩增混合液在恒温或
变温条件下进行扩增反应。
70.在本发明的一些实施方式中，所述以第一体积封装的pcr反应试剂盒中形成的待扩增混合液体积与以第二体积封装的pcr反应试剂盒中形成的待扩增混合液体积相等。
71.根据本发明，所述以第一体积封装的pcr反应试剂盒中形成的待扩增混合液体积与以第二体积封装的pcr反应试剂盒中形成的待扩增混合液体积均为20μl。
72.在本发明的一些实施方式中，所述扩增反应包括以下条件：(1)预变性反应：95℃反应3min；(2)扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应45s，45个循环。
73.在本发明的一些实施方式中，所述不同体积封装的pcr反应试剂盒可以用于但不限于对结直肠癌相关基因位点、癫痫相关基因位点、精神疾病相关基因位点、ugt1a1*28、irs1c.2911g》a或mthfrc.677c》t基因位点进行检测。不限定只能在所列举的靶标和标点检测中使用，其他一些位点检测也同样适用，并不限定。
74.本发明的有益效果：
75.(1)本发明通过对于各组分配置的最优化含量探索，设计了一种能适应体积差异造成的巨大环境差异存在时，仍能有效检测出不同类型靶标的方案，本发明需要配置适当含量的对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组，并且对应于靶标基因的靶标引物探针组的含量不小于内标引物探针组的含量，如此可以保证两种封装体积下扩增的ct值合适且准确，不至于出现内标引物探针组含量多于对应于靶标基因的靶标引物探针组含量而造成两种不同体积封装下至少之一可能出现的ct值过于靠前，避免造成两种不同体积封装试剂盒扩增的结果差异较大产生的检测不准确问题。
76.(2)本发明为了保证甘油在差异化的封装体积内能更好地发挥保护taq酶的稳定性与降低高gc序列的二级结构作用，需要保证加水之前甘油浓度为0.04-0.1mm；同时为了适应两种不同体积封装方案中对于酶活性的保护，并兼容后续扩增对于非特异性扩增的一致需求，本发明的pcr反应试剂配制mg2+浓度为1.5-6.5mm。
77.(3)本发明为了进一步适应于两种不同封装体积导致的环境差异，两种不同封装体系需要重点保障的有效组分有所差异，为了更长效保持不同体积封装的pcr反应试剂盒内配置不同组分的稳定剂，当pcr反应试剂盒为小体积封装时，pcr反应体系还配置第一组分稳定剂，当pcr反应试剂盒为大体积封装时，pcr反应体系还配置第二组分稳定剂，第一组分稳定剂与第二组分稳定剂不相同，如此，只需要很小地改动生产工艺和流程，只差异稳定剂配置流程工艺与相关设备即可实现非标准环境内长效稳定保存试剂盒的效果。
78.(4)本发明为实现不同体积封装方案能实现dna含量最低0.5ng/反应的检测灵敏度，配置调整体系中各组分的含量，如此能避免两种封装方案由于体积差异而造成的环境差异，进而影响到最终检测结果的问题，实现不同封装在妥善保存后能达到相近的检测效果，
79.(5)本发明通过先混合形成能用于分装不少于m个pcr反应试剂的待分装试剂，再分装形成以第一体积或第二体积封装的pcr反应试剂盒，能满足兼容性和低成本的需求。
80.(6)本发明提供的不同体积封装的pcr反应试剂盒可以对结直肠癌相关基因位点、癫痫相关基因位点、精神疾病相关基因位点、ugt1a1*28、irs1c.2911g》a、mthfrc.677c》t等基因位点进行准确稳定检测，具有广泛的适应性，能够适用于更多靶基因的准确稳定检测，且可同时检测多个靶标，一小时左右即可完成检测。
附图说明
81.图1是本发明的不同体积封装的pcr反应试剂盒分装过程与最终使用状态示意图，其中，(a)-待分装状态，(b)-以第一体积或第二体积封装状态，(c)-最终使用状态；
82.图2是本发明中不同体积封装的pcr反应试剂盒对于结直肠癌相关基因位点重复性验证检测结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
83.图3是本发明中不同体积封装的pcr反应试剂盒对于精神疾病相关基因位点检测结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
84.图4是本发明中添加稳定剂的大体积封装的pcr反应试剂盒在破坏性试验后的检测结果图，其中，(a)-未添加稳定剂的大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-添加稳定剂的大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
85.图5是本发明中添加稳定剂的小体积封装的pcr反应试剂盒在破坏性试验后检测结果图，其中，(a)-未添加稳定剂的小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-添加稳定剂的小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
86.图6是本发明中添加0.06mm的甘油浓度的不同体积封装的pcr反应试剂盒对于某一样本扩增结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
87.图7是本发明中添加0.09mm的甘油浓度的不同体积封装的pcr反应试剂盒对于某一样本扩增结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
88.图8是本发明中添加0.09mm的甘油浓度的不同体积封装的pcr反应试剂盒对于另一样本扩增结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
89.图9是本发明中添加0.02mm的甘油浓度的不同体积封装的pcr反应试剂盒对于某一样本扩增结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
90.图10是本发明中添加0.12mm的甘油浓度的不同体积封装的pcr反应试剂盒对于某一样本扩增结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果；
91.图11是本发明中配置3.2mm的mg2+浓度的不同体积封装的pcr反应试剂盒对于某一样本扩增结果图，其中，(a)-小体积封装的pcr反应试剂盒检测结果，(b)-大体积封装的pcr反应试剂盒检测结果。
具体实施方式
92.为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
93.如背景技术中所公开的方案，目前很多厂家采用了预封装的液态化试剂盒，这种试剂盒能够支持使用者在现场快速高效地添加样本液或者样本提取液，进而高效快速地完
成现场检测，为了保证检测准确性，需要设计的试剂盒能够长久稳定地被保存。目前多数厂家探索较多的为直接在试剂盒内添加某种稳定剂，进而通过稳定剂的保护能延长试剂盒的保存时间；一些厂家还关注到不同的稳定剂需要配置不同浓度的阳离子，以保证检测结果的准确性。实际上在一些场景中采用很少量的水形成浓缩的封装体系能一定程度上延长试剂盒的保存时间，同时在较少含水量的试剂盒中只需更低浓度的稳定剂既能长效稳定地保存试剂盒，又不至于影响后续的扩增反应。因此从试剂盒封装方法来看，两种不同体积的封装有其不同的应用场景，为了兼容不同封装体积，本发明提供的pcr反应试剂能适应封装体积差异在2倍以上的不同封装体积的试剂盒，且能达到基本相近的扩增结果。
94.pcr反应通常需要在不同组分的试剂所组成的pcr反应扩增体系试剂内，加入包含靶标片段的提取液或者是样本液形成待扩增混合液，封闭后在pcr设备上执行两步或者三步法的温度循环扩增，并配合对应的荧光检测方案即可实现对样本中的靶标定性或定量的检测。在内标法的定量扩增方案中，内标与靶标被混合在相同的井单元内形成pcr反应扩增体系试剂。
95.试剂均为市售试剂。
96.样本均为西安天博医学检验所提供。
97.实施例1
98.本实施例以8个井单元组成的8连管类型耗材形成的试剂盒为例，将对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水各组分按照下表1的方式进行混合，形成能用于分装1000个pcr反应试剂的第一待分装试剂。
99.表1第一待分装试剂配比表
[0100][0101][0102]
同样将对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水各组分按照下表2的方式进行混合，形成能用于分
装1000个pcr反应试剂的第二待分装试剂。
[0103]
表2第二待分装试剂配比表
[0104]
组分规格用量(μl)靶标正向引物母液100μm50靶标反向引物母液100μm50靶标探针母液100μm30内标正向引物母液100μm30内标反向引物母液100μm30内标探针母液100μm30酶mix3u/μl4005b(+)工作液5
×
180010
×
buffer10
×
1100mgcl22m10tris工作液/600du plus dntp mixture10mm300甘油100mm1.77-4.43(用量不计入总体积)h2o/13570
[0105]
对于表1中的第一待分装试剂分装1000个pcr反应试剂，形成每个封装的pcr反应试剂的体积为5μl；对于表2中的第二待分装试剂分装1000个pcr反应试剂，形成每个封装的pcr反应试剂的体积为18μl。第二待分装试剂中的水的体积为第一待分装试剂中的水的体积的23.8倍。第一待分装试剂和第二待分装试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp各组分的添加量相等。
[0106]
本实施例的分装过程如图1中step1和step2所示状态，其中step2状态中8连管类型耗材能以5μl或者18μl两种不同体积封装形成pcr反应试剂盒。也可以采用另外一种实施方式，向8连管类型的耗材中每一个井单元中分别定量加入包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp的反应液，再向每一个井单元中分别加入0.57μl的水形成5μl的pcr反应试剂，或加入13.57μl的水形成18μl的pcr反应试剂。这种方案分装获得的不同体积的试剂盒差别也仅在于含水量有差异。
[0107]
之后在执行扩增前打开封闭的8连管类型耗材试剂盒，将处理好的样本、阴性对照和阳性对照分别取15μl分别加入井单元中分装好的pcr反应试剂中，加入包含靶标片段的提取液或者样本液后，使井单元内包含20μl的待扩增混合液，当执行扩增时使用盖体对包含待扩增混合液的试剂盒如图1中step3所示进行封闭，混匀离心后将pcr管按一定顺序放入荧光pcr扩增仪上，设置反应体系为20μl，按以下程序进行pcr扩增：(1)预变性反应：95℃反应3min；(2)扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应45s，45个循环。可以搭配gentier96r、gentier 96e、fascan 48e多通道荧光定量分析仪或全自动核酸纯化及扩增检测分析系统pana hm5000进行pcr扩增检测。两种封装方案对应的样本添加量也有差别，但最终的待扩增混合液体积相同，小体积封装试剂盒内加入的样本可以为稀释后的样本，而大体积封装
试剂盒内加入原样本。
[0108]
实施例2
[0109]
本实施例采用实施例1提供的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒和扩增检测方法以采集的全血样本为对象，对结直肠癌相关基因ugt1a1*6、ugt1a1*28、ugt1a1*93位点进行重复性验证检测，每个靶标重复10次验证检测，两种不同体积封装的pcr反应试剂盒均在相同的合适存储条件下存储相同时间。结果如图2所示。
[0110]
由图2结果可知，图2(a)中小体积封装的pcr反应试剂盒和图2(b)中大体积封装的pcr反应试剂盒的检测结果均能正确无遗漏地识别出靶标基因，图中的扩增曲线形态也基本均呈现出了标准的s型扩增曲线，同时可以看出ct值对应的扩增起始位置也基本一致，两种不同体积封装试剂盒的ct值相差较小，整体检测结果准确可靠。也说明了按照本发明配置适当含量的对应于靶标基因的靶标引物探针组和内标引物探针组，其中对应于靶标基因的靶标引物探针组的含量不小于内标引物探针组的含量，如此可以保证两种不同体积封装的pcr反应试剂扩增的ct值合适且准确，不至于出现内标引物探针组的含量多于对应于靶标基因的靶标引物探针组含量而造成两种不同体积封装的pcr反应试剂至少之一可能出现的ct值过于靠前，避免造成两种不同体积封装的pcr反应试剂扩增的结果差异较大产生的检测不准确问题。
[0111]
实施例3
[0112]
为了进一步验证本发明配置的不同体积封装的pcr反应试剂盒的检测结果可靠性和通用性，本实施例采用实施例1提供的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒和扩增检测方法以采集的全血样本为对象，对癫痫相关基因cyp2c9 c.1075a》c、polg c.3708g》t、polg c.3428a》g位点进行重复性验证检测ct值，每个靶标重复10次验证检测，两种不同体积封装的pcr反应试剂盒均在相同的合适存储条件下存储相同时间。结果如表3和表4所示。
[0113]
表3大体积封装的pcr反应试剂盒检测ct值统计
[0114]
[0115][0116]
表4小体积封装的pcr反应试剂盒检测ct值统计
[0117][0118]
由表3和表4的检测结果可知，对于相同的1例全血样本，重复10次检测ct值，不同体积封装的pcr反应试剂盒的检测结果判读均正确且一致性高，不同通道ct值的cv均小于2％，两种不同体积封装的pcr反应试剂盒之间的ct值差异也更小。
[0119]
实施例4
[0120]
本实施例采用实施例1提供的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒，在合格的保存环境中，经过相同时间后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对精神疾病相关基因进行扩增检测。结果如图3所示。
[0121]
由图3结果可知，两种不同体积封装的pcr反应试剂盒在合格的保存环境中，经过相同时间后进行检测，均能实现对于靶标的扩增，整体能够准确地给出定性结果，但是从个别扩增曲线来看，其已经不是传统的s型扩增曲线，逐步转变为更偏性直线的扩增特性。说明本发明实施例1提供的两种体积封装的试剂盒对精神疾病相关基因能基本正确检测，有一定适用性，但有个别出现了直线扩增，可能是稳定性还有欠缺，因此需要进一步探索试剂盒的稳定性。
[0122]
实施例5
[0123]
图4和图5为不同封装体系添加不同的稳定剂后在包含abcb1 c.3435c》t、abcb1c.2677t》g/a位点经历破坏性实验后检测结果对比图，两种反应体系中，可以按照如下表5和表6的方案进行1000个反应的大体积和小体积体系配置，过程与实施例1相类似不
再赘述。
[0124]
表5
[0125]
组分规格添加体积(μl)靶标正向引物母液100μm50靶标反向引物母液100μm50靶标探针母液100μm30内标正向引物母液100μm30内标反向引物母液100μm30内标探针母液100μm30聚合酶3u/μl4005b(+)工作液5
×
1800buffer10
×
1100mgcl22m10tris工作液/600du plus dntp mixture10mm300甘油100mm1.77-4.43(用量不计入总体积)聚乙烯吡咯烷酮100mg/ml0.5-1(用量不计入总体积)h2o/570
[0126]
表6
[0127]
组分规格添加体积(μl)靶标正向引物母液100μm50靶标反向引物母液100μm50靶标探针母液100μm30内标正向引物母液100μm30内标反向引物母液100μm30内标探针母液100μm30聚合酶3u/μl4005b(+)工作液5
×
1800buffer10
×
1100mgcl22m10tris工作液/600du plus dntp mixture10mm300甘油100mm1.77-4.43(用量不计入总体积)葡聚糖1m72proclin 3001m11h2o/13487
[0128]
本实施例中实验组1采用表6中与实施例1其他组分相同、添加葡聚糖含量为0.36％和proclin 300浓度百分比为0.055％的大体积封装的pcr反应试剂盒，实验组2采用表5中与实施例1其他组分相同、添加聚乙烯吡咯烷酮的含量为0.02％的小体积封装的pcr
反应试剂盒，对照组采用实施例1提供的两种不同体积封装试剂盒；并将实验组和对照组的试剂盒37℃放置6天进行破坏性试验后，再采用与实施例1相同的扩增检测方法对样本进行扩增检测。结果如图4和图5所示。
[0129]
由图4结果可知，图4(a)为未添加稳定剂的大体积封装的pcr反应试剂盒经过破坏性试验之后的检测结果，图4(b)为添加葡聚糖和proclin 300的大体积封装的pcr反应试剂盒经过破坏性试验之后的检测结果；同一样本分别在添加稳定剂与不添加稳定剂的大体积封装的pcr反应试剂盒中进行检测，可看出不添加稳定剂的大体积封装的pcr反应试剂盒，个别通道扩增曲线为斜直线，荧光高度降低，且ct值较加稳定剂的体系推后。
[0130]
由图5结果可知，图5(a)为未添加稳定剂的小体积封装的pcr反应试剂盒经过破坏性试验之后的检测结果，图5(b)为添加聚乙烯吡咯烷酮的小体积封装的pcr反应试剂盒经过破坏性试验之后的检测结果；同一样本分别在添加稳定剂与不添加稳定剂的小体积封装的pcr反应试剂盒中进行检测，可看出不添加稳定剂的小体积封装的pcr反应试剂盒，部分样本扩增ct值推后，扩增曲线ct值分布弥散。
[0131]
从上述结果说明了添加稳定剂的不同体积封装的pcr反应试剂盒具有更好的稳定性；同时也说明了两种不同体积封装的pcr反应试剂盒中需要重点保护的有效组分有所差异，这也是由于小体积封装试剂盒浓缩态所具有一定稳定各组分作用所导致。
[0132]
实施例6
[0133]
本发明为了保证整个检测结果对不同体积封装的pcr反应试剂更高兼容性，需要对对应于靶标基因的靶标引物探针组和内标引物探针组的浓度进行合适配置。本实施例的实验组采用与实施例1相同的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒，采用与实施例1相同的扩增检测方法对ugt1a1*28、irs1c.2911g》a、mthfrc.677c》t基因位点分别进行检测ct值。结果如表7所示。
[0134]
表7不同引物探针添加量在不同体积封装试剂盒中的检测ct值统计
[0135][0136]
由表7结果可知，以本发明的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒兼容多种检测位点的检测需求，需要配置合适的引物探针用量，本发明的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒中添加的标准的引物探针可以为100μm的标准浓度，其中引物的正常用量为50μl/1000反应，探针的正常用量为30μl/1000反应，添加量不能超过正常用量的20％也不能低于正常用量的20％，否则将出现如上表中的检测结果差异过大，非特异性扩增比较明显，使得结果可
靠性降低甚至出现直接无法正确检测的问题。
[0137]
实施例7
[0138]
本实施例中实验组1采用实施例1提供的其他组分相同、添加甘油浓度均为0.06mm的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒，实验组2采用实施例1提供的其他组分相同、添加甘油浓度均为0.09mm的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒，对照组1采用实施例1提供的其他组分相同、添加甘油浓度均为0.02mm的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒，对照组2采用实施例1提供的其他组分相同、添加甘油浓度均为0.12mm的两种不同体积封装的pcr反应试剂盒；采用与实施例1相同的扩增检测方法分别对第一抗凝全血样本进行扩增检测，实验在合格的保存环境中保存7天后的试剂盒进行检测，结果如图6、图7、图9与图10所示；同时将实验组2的试剂盒对第二抗凝全血样本进行扩增检测，结果如图8所示，实验检测的靶点为ugt1a1*6、ugt1a1*28、ugt1a1*93位点。
[0139]
由图6和图7的结果可知，对于同一样本，在甘油浓度分别为0.06mm和0.09mm的两种不同体积封装试剂盒的检测结果可以看出，在这两种甘油浓度下添加不同量的水形成不同体积封装的试剂盒均能正确地检测出样本结果值，并且检测结果差异较小，两者ct值也相差不大，结果可信度较高。
[0140]
由图7和图8的结果可知，对于不同的样本，在甘油浓度均为0.09mm的两种不同体积封装试剂盒的检测结果可以看出，不同体积封装试剂盒中甘油浓度配置合适时，对于不同检测对象，两种不同体积封装试剂盒均能实现准确高效的检测，两种不同体积封装试剂盒的检测结果差异也较小。
[0141]
由图9的结果可知，在甘油浓度均为0.02mm的两种不同体积封装试剂盒的检测结果可以看出，此时的甘油浓度很低，相比较而言小体积封装试剂盒扩增曲线相对更高，但是两种不同体积封装试剂盒扩增检测的结果差异很大，并且检测曲线分布相对更弥散，部分扩增结果很差，偏向于假阴性的结果。
[0142]
由图10的结果可知，在甘油浓度均为0.12mm的两种不同体积封装试剂盒的检测结果可以看出，过高的甘油浓度对于扩增有一定的抑制作用，小体积封装试剂盒的扩增曲线相对较低，而且两种不同体积封装试剂盒的扩增结果差异较大，扩增曲线分布也相对更弥散。
[0143]
因此，本发明需要保证采用0.04-0.1mm的甘油浓度来配制最终的pcr反应试剂，实现甘油在保存中能更好地保护反应体系试剂组分，又不至于影响后续的扩增，能保证不同体积封装试剂盒对于靶标的准确且一致率更高的有效扩增。
[0144]
实施例8
[0145]
本实施例采用甘油浓度均为0.06mm其余与实施例1其他组分相同、mg2+浓度均为3.2mm的两种不同体积封装的pcr反应试剂，与实施例1相同扩增检测方法对edta抗凝全血样本进行扩增检测，同样实验检测的靶点为ugt1a1*6、ugt1a1*28、ugt1a1*93位点，结果如图11所示。
[0146]
由图11结果可知，图11(a)中小体积封装的pcr反应试剂盒和图11(b)大体积封装的pcr反应试剂盒扩增的ct值相差较小，荧光曲线的涨幅也相差较小，非特异性扩增也均得到了很好的抑制。因此采用本发明提供的mg2+浓度的pcr反应试剂可以兼容配置不同体积封装的pcr反应试剂盒，可以保证不同体积封装的pcr反应试剂盒均能准确一致地扩增，本
发明通过类似甘油添加最优用量方案并为了保证不同封装体积的试剂盒均能兼容性扩增得到准确的扩增结果，获得了需要保证配置反应体系的mg2+在一定的浓度范围内，通过探索发现需要保证在补充水后的终反应体系中mg2+浓度范围为1.5-6.5mm。
[0147]
实施例9
[0148]
为了保证本发明的封装试剂盒对不同体积封装的兼容性，本实施例按照最终封装的pcr反应试剂盒能使待扩增样本实现dna含量最低0.5ng/反应的检测灵敏度。本实施例采用甘油浓度均为0.06mm其余与实施例1提供的两种不同体积封装的pcr反应试剂和扩增检测方法均相同的配置，实验组配置样本中dna含量为0.5ng，对照组配置样本中dna含量为0.35ng，对ugt1a1*28、irs1c.2911g》a、mthfrc.677c》t基因位点分别进行检测ct值。结果如表8所示，其中na：表示ct值扩增＞45。
[0149]
表8不同检测灵敏度在不同体积封装试剂盒中的检测ct值统计
[0150][0151]
由表8结果可知，针对不同的基因位点，分别测试了在不同体积封装试剂盒中dna含量为0.5ng与0.35ng的野生型样本，结果显示在大体积封装试剂盒中0.35ng的样本漏检或提示复检的风险升高，并且按照0.35ng灵敏度配置的反应体系在两种不同体积封装试剂盒中的ct值检测结果相差较大，使得检测结果可靠性过低，而0.5ng的样本在不同体积封装试剂盒中均可正确检出。因此，为了兼容封装两种不同体积封装试剂盒，将试剂盒的检测灵敏度配置为不低于0.5ng/反应。
[0152]
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

技术特征：
1.兼容不同体积封装的pcr反应试剂，其特征在于，包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp；还包括补充至少两种不同体积的水以形成不同体积封装的pcr反应试剂；所述pcr反应试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组的含量不小于内标引物探针组的含量。2.如权利要求1所述的pcr反应试剂，其特征在于，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中mg2+浓度为1.5-6.5mm。3.如权利要求1所述的pcr反应试剂，其特征在于，所述pcr反应试剂中还包括甘油，所述甘油在未补充水的pcr反应试剂中的浓度为0.04-0.1mm。4.如权利要求1所述的pcr反应试剂，其特征在于，所述pcr反应试剂中还包括第一组分稳定剂或第二组分稳定剂；优选地，所述第一组分稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮；和/或，所述第二组分稳定剂包括葡聚糖和proclin 300；更优选地，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中聚乙烯吡咯烷酮的含量为0.01％-0.02％；和/或，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中葡聚糖的含量为0.01％-1％；和/或，补充至少两种不同体积的水形成的所述pcr反应试剂中proclin300的浓度百分比为0.01％-0.1％。5.如权利要求1所述的pcr反应试剂，其特征在于，所述pcr反应试剂包括补充两种不同体积的水以形成不同体积封装的pcr反应试剂；优选地，补充所述两种不同体积的水的体积比值不小于2。6.兼容不同体积封装的pcr反应试剂盒，其特征在于，包括n个井单元，一所述井单元内包含以第一体积或第二体积封装的如权利要求1-5中任意一项所述的pcr反应试剂；所述第二体积的pcr反应试剂中水的体积不小于第一体积的pcr反应试剂中水的体积的2倍；所述n为不小于1的整数。7.如权利要求6所述的pcr反应试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测灵敏度不低于0.5ng/反应。8.如权利要求6所述的pcr反应试剂盒，其特征在于，当所述pcr反应试剂为第一体积时，所述pcr反应试剂包括第一组分稳定剂；和/或，当所述pcr反应试剂为第二体积时，所述pcr反应试剂包括第二组分稳定剂。9.如权利要求6-8中任意一项所述的兼容不同体积封装的pcr反应试剂盒的分装方法，其特征在于，包括如下所述的分装方法：先混合对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp形成能用于分装不少于m个pcr反应试剂的反应液，再定量加入第五体积或第六体积的水，第六体积不小于第五体积的2倍，形成第一待分装试剂或第二待分装试剂，再将第一待分装试剂以第一体积分别加入每一个所述井单元内或将第二待分装试剂以第二体积分别加入每一个所述井单元内，以形成第一体积或第二体积的pcr反应试剂；所述m优选为不小于5的整数；优选地，所述第一体积的pcr反应试剂和第二体积的pcr反应试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp各组分的添加量相等。
10.如权利要求6-8中任意一项所述的兼容不同体积封装的pcr反应试剂盒的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括：向所述井单元内分装好的pcr反应试剂中加入包含靶标基因的样本液，形成包含靶标基因的待扩增混合液；使所述待扩增混合液在恒温或变温条件下进行扩增反应；优选地，所述以第一体积封装的pcr反应试剂盒中形成的待扩增混合液体积与以第二体积封装的pcr反应试剂盒中形成的待扩增混合液体积相等。

技术总结
本发明属于基因检测技术领域，尤其是涉及兼容不同体积封装的PCR反应试剂、试剂盒及其分装方法和扩增方法。兼容不同体积封装的PCR反应试剂，包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5B(+)工作液、Buffer、MgCl2、Tris工作液和dNTPs；还包括补充至少两种不同体积的水以形成不同体积封装的PCR反应试剂；所述PCR反应试剂中对应于靶标基因的靶标引物探针组的含量不小于内标引物探针组的含量。在基本不改变现有封装设备或者工艺的基础上，能够实现不同体积封装的反应体系稳定保存和后续的可靠性检测目标。稳定保存和后续的可靠性检测目标。稳定保存和后续的可靠性检测目标。


技术研发人员：邓波 王鸿 范亮波 杨静静 张浩奇 石欣 李红东 李明
受保护的技术使用者：西安天隆科技有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/11