PLGA纳米球病毒示踪剂及其制备方法与应用

plga纳米球病毒示踪剂及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于环境保护领域，具体地说，涉及一种plga纳米球病毒示踪剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.病毒的基本结构包括蛋白质构成的衣壳和包围在衣壳内部受到保护的核酸(dna/rna)。病毒的衣壳蛋白的性质对其运移性质起决定性作用。作为病毒替代物的示踪剂也应该尽量使得表面特性和目标病毒相近，大体上应该满足最外层完全是蛋白质，dna/rna完全包裹在蛋白衣壳内，不可以裸露在外，或穿过蛋白层。
3.现有的dna病毒示踪剂是将sio2纳米球与所选蛋白质和dna共价偶联，蛋白质和dna同时存在于示踪剂的表面，不但与病毒的表面特性相悖，更重要的是，裸露在外的dna没有受到有效保护，使得此示踪剂的半衰期接近于裸链dna在此环境中的半衰期，但远小于目标病毒的半衰期。可能出现由于dna标记被过快分解而导致的假阴性结果。因此，亟需开发一种新型的dna病毒示踪剂。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种plga纳米球病毒示踪剂及其制备方法与应用。
5.针对现有的dna病毒示踪剂存在以下两点不足：(1)裸露在外的dna没有受到有效保护，使得其半衰期接近于裸链dna，远小于目标病毒，可能出现由于dna标记分解过快而出现的假阴性结果；(2)蛋白质和dna同时存在于示踪剂的表面，这与病毒的表面特性相悖。例如，现有的dna病毒示踪剂是在接近目标病毒大小的sio2纳米球(直径约70nm的球体)外，使用碳二亚胺交联剂edc(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将sio2纳米球与所选蛋白质和dna共价偶联(图1a)。
6.本发明构思如下：制备含有dna标记的plga纳米球对dna进行有效保护，在含有dna标记的plga纳米球基础上通过edc共价偶联蛋白质形成衣壳，确保最外侧由蛋白质构成，与病毒表面特性相似(图1b)。具体来说，先利用纳米沉淀法制备含有dna标记的plga纳米球，即plga(dna)，然后采用共价偶联法在最外层包裹蛋白质，本发明采用edc共价偶联法，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)为交联剂，在最外层共价偶联蛋白质形成衣壳，即可获得[protein(plga(dna))](图2c)。
[0007]
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种plga纳米球病毒示踪剂，其为具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂，由内核和包裹于外壳的蛋白质衣壳组成；
[0008]
所述内核为含有dna标记的plga纳米球，在内核的外侧通过edc共价偶联蛋白质形成厚度为y的衣壳；其中，5nm≤y≤20nm；
[0009]
所述含有dna标记的plga纳米球的粒径为x，55nm≤x≤65nm，优选x约为60nm；其中，plga的分子量为75-85kda，la:ga的摩尔比为1:1；
[0010]
所述示踪剂的粒径为x+2y，65nm≤x+2y≤105nm，优选示踪剂的粒径约为80nm；可根据所示踪的目标病毒的粒径，通过含有dna标记的plga纳米球的粒径x进行控制，并通过蛋白质衣壳的厚度y微调。
[0011]
本发明中，所述核酸是长度60-120bp，且不含茎环、发夹结构的单链或双链dna。
[0012]
所述蛋白质是与目标病毒的衣壳蛋白性质接近的蛋白质，且蛋白质分子中有足够多的氨基确保蛋白质分子有足够多的氨基位点与plga(dna)纳米球表面的羧基进行脱水缩合形成共价键。例如，选取等电点与目标病毒表面等电点接近的蛋白质，确保表面性质与目标病毒接近。
[0013]
在本发明的一个具体实施方式中，当目标病毒为腺病毒时，示踪剂的最外层可以包裹与腺病毒表面等电点接近且半衰期大于等于目标病毒半衰期的蛋白质，如人血清白蛋白。
[0014]
具体应用时，本发明的示踪剂可以根据目标病毒的衰亡速率，通过选取不同分子量和不同la:ga的比例的plga制备包裹dna的内核来控制dna标记的释放速率即plga纳米球病毒示踪剂的衰亡速率，以此模拟目标病毒在多种水土环境中的半衰期。
[0015]
第二方面，本发明提供一种具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)将plga、dmso与dna溶液混合后，将混合液以注射泵注射入tpgs溶液中，所得乳液在通风橱中搅拌4～8小时(或过夜)，使dmso蒸发，且plga颗粒硬化，制备得到含有dna标记的plga纳米球，作为内核，其粒径为x，55nm≤x≤65nm；
[0017]
其中，plga的分子量为75-85kda，la:ga的摩尔比为1:1。
[0018]
(2)酶解内核外侧未被完全包裹的dna，用ph6.0的mes缓冲液洗涤并重悬内核，得到浓度为10mg/ml的plga(dna)纳米球溶液；
[0019]
(3)以edc为交联剂，使plga(dna)纳米球外侧的羧基与蛋白质溶液接触，在所述plga(dna)纳米球的表面通过edc共价偶联形成厚度为y的蛋白质衣壳，得到[protein(plga(dna))]；其中，5nm≤y≤20nm。
[0020]
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
[0021]
1)dna溶液的制备：用超纯水配制dna溶液，得到浓度为4
×
10-6
m的dna溶液；
[0022]
2)含有dna标记的plga纳米球的制备：将20mg plga与1ml dmso混合，溶解过夜，得到plga/dmso混合物；将5μl制备的dna溶液添加到plga/dmso混合物中，冰上超声处理10s(40％振幅)，得到dna/plga/dmso混合物；在磁力搅拌器上，边搅拌边用注射泵将所述dna/plga/dmso混合物注射到20ml 0.3w/v％tpgs溶液中(注射器尖端在溶液液面以下)，所得乳液在通风橱中搅拌4～8小时(或过夜)，使dmso蒸发，且plga颗粒硬化，得到plga颗粒硬化的溶液；
[0023]
3)含有dna标记的plga纳米球外侧未被完全包裹的dna的酶解：使所述plga颗粒硬化的溶液与dna酶试剂接触，酶解裸露在纳米球外侧的dna，得到含有dna标记的plga纳米球溶液，即plga(dna)纳米球溶液；
[0024]
4)蛋白质溶液的配制：用pbs缓冲液配制蛋白质溶液，得到浓度为2mg/ml的蛋白质溶液；
[0025]
5)共价偶联蛋白质：将plga(dna)纳米球溶液在mes缓冲液中清洗2次；第二次洗涤
后，将纳米球沉淀重悬于10ml的mes缓冲液中，得到浓度为10mg/ml的plga(dna)纳米球溶液；在18℃-25℃条件下，边搅拌边逐滴加入10mg/ml的edc 10ml，持续搅拌15分钟；用pbs缓冲液洗2次，然后用5ml的pbs缓冲液重悬纳米球；向其中加入所述蛋白质溶液1.85-18.5ml，于18℃-25℃反应2-4小时，期间不断搅拌，反应结束后，离心弃上清，将纳米球沉淀重悬于10ml的淬火液中，搅拌30分钟后，再次离心弃上清，将纳米球沉淀重悬于储存缓冲液中，即得plga纳米球病毒示踪剂[protein(plga(dna))]，即具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂。
[0026]
其中，所述mes缓冲液的ph为6.0，所述pbs缓冲液的ph为7.4；
[0027]
所述淬火液为1mg/ml酪蛋白溶液；
[0028]
所述储存缓冲液为10mg/ml甘氨酸溶液。
[0029]
若无特殊说明，本发明的操作均在常温(20℃～25℃)条件下进行。
[0030]
进一步地，步骤1)中用超纯水制备双链dna溶液，所述双链dna是由seq id no:1-4任一所示的单链dna及其反向互补链退火得到的。
[0031]
本发明使用的dna酶试剂可以购自thermo fisher scientific(https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/en0521)。
[0032]
第三方面，本发明提供按照所述方法制备得到的具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂，其粒径(x+2y)可在65-105nm范围内，根据所示踪的目标病毒的粒径，通过含有dna标记的plga纳米球的粒径x进行控制，并通过蛋白质衣壳的厚度y微调。
[0033]
第四方面，本发明提供所述示踪剂在施用有机肥的农业区病原体面源污染时空溯源中的应用；其中，所述病原体包括病毒。
[0034]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0035]
(一)本发明提供的plga纳米球病毒示踪剂具有蛋白质衣壳和含有dna标记，可实现对编码dna的有效保护，便于实现多源示踪和后续定量检测和分析。
[0036]
(二)通过plga(dna)内核的大小和蛋白质衣壳的厚度控制示踪剂的粒径，使其与目标病毒大小相近。有效确保示踪剂最外层衣壳完全由所选的与目标病毒表面蛋白质等电点等性质相近且半衰期大于等于目标病毒半衰期的蛋白质构成，使得示踪剂的表面特性和在水土环境中的运移特性能够更接近目标病毒。
[0037]
(三)通过plga的分子量和不同la:ga(乳酸:羟基乙酸)的比例控制plga纳米球病毒示踪剂的衰亡速率，得到在水土环境中与目标病毒衰亡速率接近的dna病毒示踪剂。
附图说明
[0038]
图1为现有技术(a)和本发明(b)的蛋白质包裹dna编码的病毒示踪剂的对比图。
[0039]
图2为本发明plga纳米球病毒示踪剂的制作流程示意图。
[0040]
图3为本发明较佳实施例中plga纳米球病毒示踪剂在施用有机肥的农业区病原体面源污染时空溯源概念图。
具体实施方式
[0041]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0042]
实验试剂：维生素e-d-a-生育酚聚丁二酸乙二醇酯(tpgs)，二甲基亚砜(dmso)，二氯甲烷(dcm，99％)单链dna用表1中的单链dna，双链dna用表1中的单链及其反向互补链退火得到，超纯水，三(羟甲基)氨基甲烷(tris，99.8％)，氯化钠(nacl，99.5％)，mes缓冲液(ph6.0)，pbs缓冲液(ph7.4)。淬火液：1mg/ml酪蛋白溶液。储存缓冲液：10mg/ml甘氨酸溶液。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc，10mg/ml)。
[0043]
75-85kda plga即聚(d,l-丙交酯-co-乙交酯)购自cd bioparticles drug deli very(https://www.cd-bioparticles.net/polylactic-co-glycolic-acids？page＝2)。人血清白蛋白购自sigma-aldrich(https://www.sigmaaldrich.cn/cn/zh/substance/albuminfromh umanserum1234570024907)。脱氧核糖核酸酶i(dnase i)购自thermo fisher sci entific(https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/en0521)。dnase i购自th ermo fisher scientific(https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/en0521)。
[0044]
表1dna序列(seq id no:1-4)
[0045][0046]
注：加粗下划线所示为正向引物，斜体下划线所示为反向引物。
[0047]
实施例1具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂
[0048]
本实施例以核酸为双链dna的腺病毒为目标病毒，进行plga纳米球病毒示踪剂的制备。
[0049]
1、含有dna的plga纳米球内核的制备：将20mg plga与1ml dmso在试管中混合，溶解过夜。将5μl 4
×
10-6
m的dna溶液添加到plga/dmso混合物中，冰上超声处理10s(40％振幅)。用注射泵将dna/plga/dmso混合物加入到磁力搅拌器上搅拌着的含tpgs(20ml 0.3％(w/v))溶液的50ml烧杯中，注射器尖端在溶液液面以下。将该乳液在通风橱中搅拌4小时，在此期间dmso蒸发，plga颗粒硬化，得到plga(dna)纳米球内核(图2a)。
[0050]
2、用透射电子显微镜(tem)观察纳米球大小和结构，并用zetasizer nano zs测定其zeta电位(ζ)和流体动力学直径。纳米球的粒径约60nm。
[0051]
3、为确保dna被完全封装在纳米球中，受到有效保护，将plga(dna)纳米球内核在0.2u/μl的dnase i溶液中轻柔地混匀，并在常温下孵育1小时，消化表面未完全包裹的dna片段，得到将dna完全保护好的plga(dna)纳米球内核(图2b)。
[0052]
4、采用edc共价偶联法在最外层包裹蛋白质：
[0053]
(1)蛋白质的制备：在pbs缓冲液(ph7.4)中配制人血清白蛋白溶液，获得浓度为2mg/ml蛋白质溶液。
[0054]
(2)共价偶联蛋白质：将plga(dna)纳米球溶液在mes缓冲液中清洗2次；第二次洗
涤后，将纳米球沉淀重悬于10ml的mes缓冲液中，得到浓度为10mg/ml的plga(dna)纳米球溶液；在18℃-25℃温度下，边搅拌边逐滴加入10mg/ml的edc 10ml，持续搅拌15分钟；用pbs缓冲液洗2次，然后用5ml的pbs缓冲液重悬纳米球；向其中加入蛋白质溶液5ml，在23℃温度下反应3小时，期间不断搅拌，反应结束后，离心弃上清，将纳米球沉淀重悬于10ml的淬火液中，搅拌30分钟后，再次离心弃上清，将纳米球沉淀重悬于储存缓冲液中，即得plga纳米球病毒示踪剂，即[protein(plga(dna))](图2c)，储存于4℃备用。
[0055]
蛋白质的选择：最外层包裹与腺病毒表面等电点接近的蛋白质，且蛋白质分子中有足够多的氨基确保蛋白质分子有足够多的氨基位点与plga(dna)纳米球表面上的羧基进行脱水缩合形成共价键，且蛋白质的半衰期大于等于目标病毒的半衰期。本实施例选用人血清白蛋白。
[0056]
5、用透射电子显微镜(tem)观察plga纳米球病毒示踪剂[protein(plga(dna))]大小和结构，并用zetasizer nano zs测定其zeta电位(ζ)和流体动力学直径。本实施例制备得到的具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂[protein(plga(dna))]，粒径约80nm，与目标病毒腺病毒70-90nm一致(图2c)。
[0057]
目标病毒腺病毒在地表水中半衰期为23天。选取半衰期约为22天的85kda的plga制备plga(dna)，人血清白蛋白的半衰期接近plga(dna)内核的半衰期，在模拟病毒表面特性的同时，不会影响dna示踪剂的半衰期。
[0058]
6、plga纳米球病毒示踪剂的定量检测
[0059]
将plga纳米球病毒示踪剂[protein(plga(dna))]在ph2.0的胃蛋白酶溶液(模拟胃液)和ph6.8的胰蛋白酶溶液(模拟肠液)中浸泡2小时和12小时，模拟蛋白质的消化过程，以去除最外层包裹的蛋白质外壳。用dcm溶解plga，然后使用qiaquick pcr纯化试剂盒对释放出的dna进行纯化。之后用taqman探针法进行qpcr检测，通过与标准曲线的对比，得到样品的dna拷贝数浓度。
[0060]
7、由第3步结束时得到的大小均匀一致且dna完全保护好的plga(dna)纳米球(图2b)测定示踪剂个数与封装的dna拷贝数的对应关系：示踪剂个数由plga(dna)纳米球总质量、plga的密度和第2步所测定的plga(dna)的粒径计算得到。封装的dna的拷贝数由第6步所述检测方法得到。即可建立示踪剂个数与封装的dna的拷贝数之间的关系，即每个plga(dna)纳米球中平均包裹了多少双链dna。
[0061]
实施例2 plga纳米球病毒示踪剂的应用
[0062]
现有的dna病毒示踪剂无法在水土介质中用示踪剂的迁移转化过程准确反推出目标病毒的迁移转化过程，难以在无法投入致病性病毒只能投入病毒示踪剂的野外真正应用。本实施例将实施例1制备的在土壤中的物理过滤和化学吸附性质及半衰期与目标病毒接近的dna病毒示踪剂，作为目标病毒的替代物使用，示踪病原体的迁移转化过程，从而实现施用有机肥的农业区病原体面源污染时空溯源。例如，当目标病毒为腺病毒。
[0063]
1、用非饱和垂直方向的土柱上加一定水头的积水入渗模拟病毒在非饱和带土壤施用有机肥后入渗和过滤的情景，用饱和水平方向的土柱模拟病毒进入饱和带土壤后向排水沟迁移的过程。为避免示踪剂和目标病毒在土壤中相互影响，例如占据吸附位点等，拟进行平行土柱实验，即装填完全一致的土柱若干，每次只和保守示踪剂kbr(用于反解土壤水动力学参数)一起投入plga纳米球病毒示踪剂或目标病毒，实验得到的恢复率和穿透曲线，
结合土壤中污染物迁移转化模型模拟，获得在不同条件的非饱和带土壤和饱和带土壤中用plga纳米球病毒示踪剂的过滤参数和吸附解吸速率以及衰亡速率反推目标病毒的过滤参数和吸附解吸速率以及衰亡速率的函数。
[0064]
2、取几个代表性沟段不同灌期的水和底泥，用长5米、高1米、宽0.6米的水槽模拟不同沟段在不同灌期的排水情况。所有的示踪剂(plga纳米球病毒示踪剂、目标病毒和用于反解水动力学参数的kbr)一起投入水槽，实验得到的不同迁移距离上覆水中各示踪剂和目标病毒的浓度变化曲线，结合考虑污染物分解和在颗粒物上的吸附解吸、水中悬浮颗粒物沉降和水对底泥的冲刷和淤积的对流弥散方程，获得在不同灌期不同沟段条件下用plga纳米球病毒示踪剂的对流弥散参数和吸附解吸速率和衰亡速率反推目标病毒的对流弥散参数和吸附解吸速率和衰亡速率的函数。
[0065]
在土壤中迁移时，病毒示踪剂和目标病毒的表面化学性质直接影响其在土壤中的吸附。在排水沟中迁移时，病毒示踪剂和目标病毒也会吸附和解吸于水中的泥沙和悬浮颗粒物上，这一吸附解吸过程也与其表面化学性质有着密切的关系。因此，确保病毒示踪剂的表面与目标病毒一样完全由蛋白质包裹尤为重要。
[0066]
3、种植不同的作物所需的有机肥用量和灌溉水量不同，不同质地的土壤对病原体的过滤效果也不同。如图3所示，在前两步土柱和水槽实验和模拟的基础上，将本发明的plga纳米球病毒示踪剂用不同的dna序列编码，标记投入的农田和时间，随有机肥在不同时间、不同农田投入(图3中的4块农田投入的plga纳米球病毒示踪剂分别封装了表1中的4条不同的dna序列)，在附近地下水井和排水沟中采样，检测plga纳米球病毒示踪剂在地下水和地表水中的浓度变化。然后应用前两步土柱和水槽实验和模拟得到的用plga纳米球病毒示踪剂描述目标病毒的迁移转化过程的函数估算目标病毒进入地下水和排水沟的时间和浓度，以及在排水沟中迁移不同距离的时间和浓度，进行施用有机肥农业区病原体面源污染时空溯源，追溯出容易产生病原体面源污染的农田和时间段。
[0067]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.plga纳米球病毒示踪剂，其特征在于，其为具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂，由内核和包裹于外壳的蛋白质衣壳组成；所述内核为含有dna标记的plga纳米球，在内核的外侧通过edc共价偶联蛋白质形成厚度为y的衣壳；其中，5nm≤y≤20nm；所述含有dna标记的plga纳米球的粒径为x，55nm≤x≤65nm；其中，plga的分子量为75-85kda，la:ga的摩尔比为1:1；所述示踪剂的粒径为x+2y，65nm≤x+2y≤105nm；所述核酸为长度60-120bp，且不含茎环、发夹结构的单链或双链dna；所述蛋白质是与目标病毒的衣壳蛋白性质接近的蛋白质。2.plga纳米球病毒示踪剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将plga、dmso与dna溶液混合后，将混合液以注射泵注射入tpgs溶液中，所得乳液在通风橱中搅拌4～8小时，使dmso蒸发，且plga颗粒硬化，制备得到含有dna标记的plga纳米球，作为内核，其粒径为x，55nm≤x≤65nm；其中，plga的分子量为75-85kda，la:ga的摩尔比为1:1；(2)酶解内核外侧未被完全包裹的dna，用ph6.0的mes缓冲液洗涤并重悬内核，得到浓度为10mg/ml的plga(dna)纳米球溶液；(3)以edc为交联剂，使plga(dna)纳米球外侧的羧基与蛋白质溶液接触，在所述plga(dna)纳米球的表面通过edc共价偶联形成厚度为y的蛋白质衣壳；其中，5nm≤y≤20nm；所述核酸为长度60-120bp，且不含茎环、发夹结构的单链或双链dna；所述蛋白质是与目标病毒的衣壳蛋白性质接近的蛋白质。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)dna溶液的制备：用超纯水配制dna溶液，得到浓度为4
×
10-6
m的dna溶液；2)含有dna标记的plga纳米球的制备：将20mg plga与1ml dmso混合，溶解过夜，得到plga/dmso混合物；将5μl制备的dna溶液添加到plga/dmso混合物中，冰上超声处理10s，得到dna/plga/dmso混合物；在磁力搅拌器上，边搅拌边用注射泵将所述dna/plga/dmso混合物注射到20ml 0.3w/v％tpgs溶液中，所得乳液在通风橱中搅拌4～8小时，使dmso蒸发，且plga颗粒硬化，得到plga颗粒硬化的溶液；3)含有dna标记的plga纳米球外侧未被完全包裹的dna的酶解：使所述plga颗粒硬化的溶液与dna酶试剂接触，酶解裸露在纳米球外侧的dna，得到含有dna标记的plga纳米球溶液，即plga(dna)纳米球溶液；4)蛋白质溶液的配制：用pbs缓冲液配制蛋白质溶液，得到浓度为2mg/ml的蛋白质溶液；5)共价偶联蛋白质：将plga(dna)纳米球溶液在mes缓冲液中清洗2次；第二次洗涤后，将纳米球沉淀重悬于10ml的mes缓冲液中，得到浓度为10mg/ml的plga(dna)纳米球溶液；在18℃-25℃条件下，边搅拌边逐滴加入10mg/ml的edc 10ml，持续搅拌15分钟；用pbs缓冲液洗2次，然后用5ml的pbs缓冲液重悬纳米球；向其中加入所述蛋白质溶液1.85-18.5ml，于18℃-25℃反应2-4小时，期间不断搅拌，反应结束后，离心弃上清，将纳米球沉淀重悬于10ml的淬火液中，搅拌30分钟后，再次离心弃上清，将纳米球沉淀重悬于储存缓冲液中，即得plga纳米球病毒示踪剂[protein(plga(dna))]，即具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga
纳米球病毒示踪剂；其中，所述mes缓冲液的ph为6.0，所述pbs缓冲液的ph为7.4；所述淬火液为1mg/ml酪蛋白溶液；所述储存缓冲液为10mg/ml甘氨酸溶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中用超纯水制备双链dna溶液，所述双链dna是由seq id no:1-4任一所示的单链dna及其反向互补链退火得到的。5.按照权利要求2-4任一项所述方法制备得到的具有蛋白质衣壳和含有dna标记的plga纳米球病毒示踪剂。6.根据权利要求5所述的示踪剂，其特征在于，其粒径为x+2y，65nm≤x+2y≤105nm。7.权利要求1、5或6所述示踪剂在施用有机肥的农业区病原体面源污染时空溯源中的应用；其中，所述病原体包括病毒。

技术总结
本发明提供一种PLGA纳米球病毒示踪剂及其制备方法与应用。本发明的示踪剂由内核和包裹于外壳的蛋白质衣壳组成；所述内核为含有DNA标记的PLGA纳米球，在内核的外侧通过EDC共价偶联蛋白质形成衣壳。本发明提供的新型DNA病毒示踪剂可实现对编码DNA的有效保护，便于后续定量检测和分析；有效确保示踪剂最外层衣壳完全由所选蛋白质构成，使得示踪剂的表面特性和运移特性能够更接近目标病毒；并且通过PLGA的分子量和不同LA:GA的比例控制DNA病毒示踪剂的衰亡速率，使其与目标病毒接近。使其与目标病毒接近。


技术研发人员：汪超子 刘家荣 胡曾杰 刘耿 霍再林
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/11