卡那霉素降解酶AquKGDγ基因及其应用

卡那霉素降解酶aqukgd
γ
基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物基因领域，具体涉及卡那霉素降解酶aqukgdγ基因及其应用。


背景技术：

2.抗生素耐药所造成的危害已成为感染性疾病治疗工作的巨大威胁。研究发现，在过去70年耐药细菌急剧增加的主要原因是在环境残留抗生素的选择压力下，水平转移促进了耐药基因的广泛传播和增殖。因此，解决细菌耐药问题首先要解决环境中残留的抗生素。残留抗生素的消除主要包括非生物作用(活性污泥的吸附、光解以及水解等)和生物作用(主要为微生物降解)。目前，非生物作用降解残留抗生素研究和实践较多，集中在理化处理，如高温法、微波法、光降解法、超声法、化学氧化法和电化学法等。理化处理法具有很多缺点，如所需成本普遍较高而管理较为复杂。此外大部分方法去除率都较低并对固态介质中抗生素残留的去除存在局限性。抗生素的生物降解由于价格低廉、环境污染小等优点逐渐成为研究热点，而酶降解被认为是抗生素生物去除最有前途的方法。
3.氨基糖苷类抗生素是一类水溶性强、可以对抗大部分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的广谱性抗生素。因对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、克雷伯菌属等常见革兰氏阴性杆状细菌有较长的抗菌后效，氨基糖苷类抗生素被广泛应用于由敏感需氧型革兰氏阴性杆状细菌所导致的严重感染，如皮肤软组织感染、呼吸道感染、脑膜炎、烧伤感染、尿道感染、骨关节感染及胃肠道感染等。由于结构的稳定，氨基糖苷类抗生素在自然环境中很难借助光、温度等物理因素进行降解；更糟糕的是，迄今为止，氨基糖苷类抗生素被认为是不可生物降解的。在细菌中仅仅发现通过修饰酶对这类抗生素的氨基或羟基进行化学修饰，这种修饰会导致氨基糖苷类抗生素的失活，但并不涉及化学键的断裂，并且由于修饰发生在细胞内，修饰后的产物没有运输到细胞外，这类酶钝化氨基糖苷类抗生素效率极低。目前没有将这类修饰酶应用于氨基糖苷类抗生素污染治理的报道。氨基糖苷类抗生素的广泛应用和难以降解意味着亟需更有效的降解方法对环境中残留的这类抗生素进行去除。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供卡那霉素降解酶aqukgdγ基因及其应用。
5.本发明从菌株aquamicrobium sp a3-1中分离到能将卡那霉素(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)降解为氨基环醇6-o-氨基糖苷的复合酶，命名为aqukgd。aqukgd由两个蛋白组成，分别命名为aqukgdα和aqukgdγ。aqukgdα大小为61,710da，编码基因命名为kdr-a，长度1686bp；aqukgdγ大小为21,450da，编码基因为kdr-b，长度588bp。
6.本发明所述aqukgdα基因(kdr-a)的核酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明所述aqukgdγ基因(kdr-b)的核酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明kdr-a基因编码的蛋白aqukgdα、kdr-b基因编码的蛋白aqukgdγ能将卡那霉素(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)降解为氨基环醇6-o-氨基糖苷。卡那霉素经aqukgdα或aqukgdγ降解后的产物失去了对细菌的抑菌活性，此外，对降解产物的细胞毒性进行评估，
发现与同浓度的母体卡那霉素相比，毒性显著降低。该结果表明用aqukgdα或aqukgdγ对环境中的卡那霉素进行降解修复时不会引起二次污染，具有应用可行性。
附图说明
9.图1为硫酸铵沉淀法纯化蛋白流程图。
10.图2为不同硫酸铵沉淀区进行离子交换后部分收集管的卡那霉素降解活性及其蛋白条带。
11.图3为不同硫酸铵沉淀区的离子交换图谱。
12.图4为60-70％硫酸铵沉淀区收集管活性及sds-page。
13.图5为菌体破碎液离子交换后44号收集管非变性凝胶电泳(a)及目标条带切胶回收后sds-page(b)和活性验证(c)
14.图6为实施例2的目标基因。
15.图7为kdr-a和kdr-b连接到不同表达载体时在e.coli bl21de3中的表达。
16.图8为kdr-a和kdr-b基因同时在同一个e.coli bl21de3细胞中双表达时破碎上清液的sds-page图。
17.图9为kdr-a和kdr-b基因体外表达蛋白降解卡那霉素废水中的卡那霉素。
18.图10为kdr-a和kdr-b基因体外表达蛋白降解卡那霉素生产菌渣中的卡那霉素。
19.图11为kdr-a和kdr-b基因体外表达后用于养殖水体中卡那霉素残留的降解。
具体实施方式
20.以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。以下未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规实验条件或者制造厂商所建议的条件。
21.本发明所涉及的菌株aquamicrobium sp a3-1，已在文献“deglycosylation inactivation initiated by a novel periplasmic dehydrogenase complex provides a novel strategy for eliminating the recalcitrant antibiotic kanamycin[j].environmental science&technology,2023”中公开发表。
[0022]
本发明从菌株aquamicrobium sp a3-1中分离到能将卡那霉素(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)降解为氨基环醇6-o-氨基糖苷的复合酶，命名为aqukgd。aqukgd由两个蛋白组成，分别命名为aqukgdα和aqukgdγ。aqukgdα大小为61,710da，编码基因命名为kdr-a，长度1686bp；aqukgdγ大小为21,450da，编码基因为kdr-b，长度588bp。
[0023]
其中，aqukgdα基因(kdr-a)的核酸序列如seq id no.1所示，aqukgdγ基因(kdr-b)的核酸序列如seq id no.2所示。
[0024]
实施例1
[0025]
1.1降解酶aqukgd的纯化
[0026]
1.1.1硫酸铵沉淀法初步纯化目的蛋白
[0027]
如图1所示，准确量取60mlaquamicrobium sp a3-1菌体破碎上清液，分别加入到5个烧杯中，将烧杯放在磁力搅拌器上，边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，使其饱和度分别达到20％、30％、40％、50％和60％，静置30min以上使溶液中的蛋白质沉淀。然后于12000
×
g，4℃离心30min。分别准确量取60ml上清液再次加入到5个干净的烧杯中，边搅拌边再次加入
硫酸铵粉末，使其浓度分别提高10％。混匀后静置30min以上，于12000
×
g、4℃离心30min，弃上清留沉淀，然后用无菌的1
×
pbs缓冲液溶解。所得5份沉淀即为20％～30％、30％～40％、40％～50％、50％～60％和60％～70％的沉淀区。整个实验过程控制室温在25℃左右。
[0028]
1.1.2离子交换法二次纯化目的蛋白
[0029]
(1)脱盐：经硫酸铵沉淀法获得的不同沉淀区蛋白含有硫酸盐，因此首先要进行脱盐。串联四根hitrap脱盐柱使得总长度为20cm，上样体积为1.5ml。在akta-900纯化仪上进行操作，用洗脱缓冲液a洗脱，流速1ml/min。
[0030]
(2)离子交换：用洗脱缓冲液a平衡强阴离子交换预装柱hiprap qff，样品经0.45μm滤膜过滤后上柱。上柱后继续用洗脱液洗去未挂柱的蛋白，然后用洗脱液b(含1mol/l的nacl)进行梯度洗脱，洗脱时间50min，流速为1ml/min。紫外检测器在线检测a280 nm，自动部分收集器每管收集1.8ml，测定各管降解卡那霉素的活性并进行sds-page，对比活性大小和蛋白条带浓度的关系。
[0031]
1.1.3非变性凝胶电泳纯化蛋白
[0032]
(1)样品准备：将离子交换层析后具有高降解活性且sds-page显示杂带较少的收集管，进行冷冻干燥并加入约150μl的无菌1
×
pbs缓冲液重悬后4℃保存备用。
[0033]
(2)配胶：首先配制12％的分离胶，用5ml移液枪迅速灌入制胶板，加入约2ml异丙醇压平凝胶上端。静置30min以上后，配制3％的浓缩胶，再次灌入制胶板至顶端，插入梳子，室温静置30min以上使胶完全聚合。连同制胶板一起放入非变性电极缓冲液中，4℃浸泡过夜后使用。
[0034]
(3)电泳：电泳槽中加入4℃冰预冷的电极缓冲液，样品与上样缓冲液按4:1混合后上样，每个孔上样30μl。电泳电压设置为恒压，浓缩胶为80v，分离胶为120v，整个过程保持冰浴。电泳完成后，剥离凝胶，超纯水清洗，然后从凝胶边缘一侧切割一条凝胶带进行考马斯亮蓝r-250染色30min并脱色。其余凝胶暂时先放置于4℃冰箱中并保持表面湿润。
[0035]
(4)电泳条带的回收与降解活性验证：脱除染色凝胶块的背景颜色后，将凝胶块置于白色底板上。将脱色凝胶和放在冰箱保存的未染色凝胶拼接成未切割时的模样，参照脱色凝胶上出现的蛋白凝胶条带将凝胶分成3个区。用无菌手术刀片切割各个区的凝胶，逐一置于无菌研钵中充分研磨，将研磨后的碎块转移到10ml离心管中，加入2～8ml 1
×
pbs缓冲液中，悬挂在四维旋转混合仪中置于4℃旋转浸泡18h左右。然后于10000
×
g中离心15min，转移上清分装到2ml ep管中，每管装约1.5ml，冻干浓缩。冻干后的样品各加入约500μl 1
×
pbs缓冲液溶解，取100μl样品加入卡那霉素母液(100g/l)至终浓度为5g/l，于37℃，230r/min过夜转化。另取10μl进行sds-page电泳检测。
[0036]
1.14葡聚糖凝胶纯化蛋白
[0037]
串联两根以葡聚糖凝胶g-100为填料的玻璃层析柱(1.5cm
×
100cm)，以1
×
pbs缓冲液为流动相，流速0.5ml/min，每管收集1.5ml。紫外检测器在线检测a280 nm，测定各管降解卡那霉素的活性并进行sds-page，分析降解活性和蛋白条带。
[0038]
1.1.5目的蛋白的n端氨基酸测序
[0039]
经纯化获得的具有活性的蛋白进行n端氨基酸序列测序，委托北京百泰派克生物科技有限公司进行。
[0040]
1.2.结果与分析
[0041]
1.2.1卡那霉素降解酶的分离纯化
[0042]
aquamicrobium sp a3-1菌体破碎上清液经硫酸铵沉淀后获得不同沉淀区的蛋白。对不同沉淀区脱盐后进行离子交换，检测各个收集管的卡那霉素降解活性和蛋白条带。结果如图2所示，各个沉淀区均有降解活性，其中30％-40％和40％-50％沉淀区的降解活性较低，50％-60％和60％-70％沉淀区的降解活性较高。30％-40％沉淀区的降解活性集中在20-22号收集管，40％-50％沉淀区的降解活性集中在48-51号收集管，50％-60％沉淀区的降解活性集中在75-77号收集管，60％-70％沉淀区降解活性集中在101-103号收集管。sds-page对比发现在所有活性收集管中都有两条蛋白，大小介于60kda～75kda命名为aqukgdα，大小介于15～25kda的蛋白条带命名为aqukgdγ。离子交换图谱如图3所示，整体来看，四个沉淀区的峰型都差不多，结合tlc活性检测发现活性收集管位于峰3(紫色墨迹所圈)，出峰时间为从开始洗脱算起30min左右。在30％-40％和40-50％沉淀区该峰较小，而在50％-60％和60-70％沉淀区该峰非常明显。峰的大小和活性大小也呈正相关，即峰越高则相关管的活性越强。60％-70％沉淀区目标峰最高且sds-page显示目标峰所在收集管杂带较少，因此将其作为后面大量制备降解酶的最佳沉淀区。如图4，分别在lb中培养2l aquamicrobium sp a3-1菌液，菌体破碎上清液经硫酸铵沉淀后获得60-70％沉淀区蛋白，脱盐和离子交换后发现a3-1菌株活性集中在39-46号。sds-page结果显示a3-1菌株的44、45杂带较少，因此选择其中44号管进行非变性凝胶电泳。a3-1菌株的44号管进行非变性凝胶电泳，切割目的条带，并进行活性验证和sds-page验证，结果如图5所示。44号收集管目标条带浓度非常高，在非变性中能隐约看到黄色条带，切下来回收的蛋白经浓缩后呈现黄色。
[0043]
1.2.2n端测序及基因定位
[0044]
将44号活性管经非变性凝胶电泳后切胶回收的蛋白样品命名为a344n，送至北京百泰派克生物科技有限公司对aqukgdα和aqukgdγ进行n端测序。结果如表1所示，aqukgdα的n端序列为nh2-anneydaivv，以a3-1菌株基因组(已提交ncbi，登录号sub11923747)为模板进行比对，发现其对应的是aqua3.1_gm000009基因(简化成kdr-a)，编码一个gmc家族的氧化还原酶(表1)；aqukgdγ的n端序列是nh2-spgardadva，在a3-1菌株基因组上相对应的是aqua3.1_gm000010基因(简化成kdr-b)，编码一个双精氨酸转运系统信号分子(表1)。kdr-a的核酸序列如seq id no.1所示。kdr-b的核酸序列如seq id no.2所示。
[0045]
表1 aqukgdα和aqukgdγ的n端序列及a3-1菌株上对应蛋白的氨基酸序列
[0046][0047]
实施例2
[0048]
本实施例对kdr-a和kdr-b基因进行体外表达，发现体外表达的aqukgdα和aqukgdγ能将卡那霉素降解为氨基环醇6-o-氨基糖苷。
[0049]
2.1 kdr-a和kdr-b基因扩增
[0050]
提取aquamicrobium sp a3-1基因组dna,分别以duetpka2 kdr-af/duetpka2kdr-ar和duetpka2 kdr-bf/duetpka2 kdr-br为引物(表2)扩增pka2 kdr-a和pka2kdr-b基因。扩增后用用sanprep柱式dna胶回收试剂盒进行切胶纯化，结果如图1。
[0051]
表2本实施例所用的引物
[0052][0053]
2.2表达质粒提取和双酶切
[0054]
采用sanprep柱式质粒dna提取试剂盒分别提取pcoladuet，pcdfduet，prsfduet，pacycduet和petduet质粒，并分别进行bamhi/hind iii和nde i/xhoi双酶切。
[0055]
2.3质粒和基因的连接及转化
[0056]
双酶切后质粒用sanprep柱式dna胶回收试剂盒进行纯化。目的基因纯化片段和线性后的质粒使用无缝克隆试剂盒hieffplus multi one stepcloning kit进行同源重组，重组产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布于含氨苄青霉素、链霉素、氯霉素或者卡那霉素的lb平板，37℃过夜培养。将能在抗性平板上生长的克隆子转至含有相应抗性的液体lb培养基中，37℃，230r/min培养8h左右后进行菌液pcr验证。
[0057]
2.4重组蛋白诱导表达
[0058]
将验证正确的重组表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态，涂布相应抗性平板。第二天挑选单菌落接种于含相应抗生素的lb液体培养基，于37℃，230r/min培养12-14h。按1％的接种量转接到50ml含相应抗生素lb液体培养基中，于37℃，230r/min培养至od
600
为0.4～0.6时，向培养液中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，并于16℃诱导20h。
[0059]
2.5sds-page验证目的基因的表达
[0060]
待培养结束后，测量菌液od
600
值，并调整每个样品od
600
值为10进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察目标基因的表达情况(图2)。图2为kdr-a和kdr-b基因单独在pcoladuet，pcdfduet，prsfduet，pacycduet和petduet质粒上的表达情况，kdr-a除了在pacycduet上表现为不可溶表达外，在其他四个载体上有可溶性表达；kdr-b基因在5个质粒上均为可溶性表达，但在pacycduet上表达量较低。
[0061]
2.6双表达e.coli bl21(de3)的构建及诱导表达
[0062]
根据上述的sds-page结果，分别将重组表达载体pcolakdr-a/pcdfkdr-b、petkdr-a/pcdfkdr-b、prsfkdr-a/pcdfkdr-b、pcdfkdr-a/pcolakdr-b或petkdr-a/pcolakdr-b转化e.coli bl21(de3)，构建含有pcolakdr-a/pcdfkdr-b、petkdr-a/pcdfkdr-b、prsfkdr-a/pcdfkdr-b、pcdfkdr-a/pcolakdr-b或者petkdr-a/pcolakdr-b载体的双表达宿主菌。培养、诱导和目的蛋白检测如上。结果如图8。kdr-a和kdr-b基因均能同时进行共表达且为可溶性
的，其中能同时表达较高浓度的kdr-a和kdr-b蛋白的组合为petduet-kdr-a/pcoladuet-kdr-b，因此选择该组组合大量表达进行后续活性检测实验。
[0063]
2.7活性检测
[0064]
将步骤2.6构建好的petkdr-a/pcolakdr-b双表达宿主菌按1％的接种量转接到含相应抗生素lb液体培养基中，于37℃，230r/min培养至od
600
为0.4～0.6时，向培养液中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，并于16℃诱导20h。于8000
×
g、4℃，离心10min收集菌体，并用pbs(ph 7.4)清洗一遍然后重悬于同样体积的pbs(ph 7.4)缓冲液中，冰浴超声破碎，功率35％，工作3秒停4秒，超声时间10-20min。于12000
×
g，4℃，离心10min，收集上清液即得粗酶液。反应分两步：第一步的反应体系为粗酶液1ml，pqq(4.5mmol/l)9μl，mgso4·
7h2o(1mol/l)1μl，cacl2·
2h2o(1mol/l)1μl，然后于25℃孵育30min以上；第二步反应体系为：第一步全部反应液，nad(80mmol/l)25μl，fad(6mmol/l)2μl，atp(20mmol/l)10μl，乙酰coa(10mmol/l)50μl，丙酰coa(10mmol/l)50μl，dtt(0.5mmol/l)5μl，pms(100mmol/l)1μl，卡那霉素母液(100g/l)50μl，然后于37℃，230r/min过夜反应。
[0065]
2.8降解产物的分离鉴定
[0066]
采用葡聚糖层析结合tlc法对2.7步的降解产物进行分离纯化。对分离纯化的降解产物kana-1进行结构鉴定。通过与卡那霉素的核磁共振波谱和质谱结果进行比较，结果如表3。卡那霉素(kanamycin)质子信号重合比较严重，不易归属。从结构式来看，kanamycin和kana-1的比较明显的区别在于3”位和3'位，6”位和6'位(6”位化学位移比6'位偏高)。首先通过2d-nmr归属kanamycin的质子和碳信号：
13
c给出了17个信号，其中一个重叠信号，说明分子含18个c原子；在kanamycin中，最容易判断的是2号位置质子信号，由于2个质子磁不等价，具有明显的耦合裂分；根据cosy可确定1号和3号位置质子及碳的化学位移，由于4号和6号位置连接糖苷键，故其化学位移较大。而kana-1中的4号位未连接糖苷键，故其化学位移偏低；根据hmbc和cosy，可确定4、5及6位质子及碳的化学位移。1'及1”化学位移比较高，容易指认，根据其和6位及4位的远程相关，可以判断两个糖的位置1”(4.96)和6(86.3)相关；1'(5.42)和4(82.7)相关。和卡那霉素相比，明显看出，kana-1 1
h谱图中缺失了化学位移为5.42的质子，说明1'位质子已经不存在。缺少化学位移为3.02和3.29的质子，说明6'位质子不存在。因此通过全谱分析，kana-1的结构如表3所示。即kdr-a和kdr-b基因表达产物能将卡那霉素(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)降解为氨基环醇6-o-氨基糖苷。
[0067]
表3卡那霉素和kana-1的波谱数据
[0068][0069][0070]
实施例3
[0071]
kdr-a和kdr-b基因体外表达后用于抗生素废水中卡那霉素残留降解
[0072]
(1)aqukgdα和aqukgdγ粗酶液准备
[0073]
步骤2.6构建好的petkdr-a/pcolakdr-b双表达宿主菌按1％的接种量转接到
1000ml含相应抗生素lb液体培养基中，于37℃，230r/min培养至od
600
为0.4～0.6时，向培养液中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，并于16℃诱导20h。收集菌体，并加入适量的裂解缓冲液，利用超声波破碎仪对菌细胞进行冰浴破碎从而获得aqukgdα和aqukgdγ粗酶液。破碎条件为：工作3秒，停顿3秒，功率35％，破碎时间10～15min。
[0074]
(2)卡那霉素废液的制备
[0075]
先准确称取适量的菌渣，菌渣和蒸馏水以1:5的比例混合，搅拌混匀，处理约6h，使菌渣中的抗生素、有机质、金属离子等可溶性物质尽量溶出，然后用4℃离心机，5000rpm离心10min，取上清液，再离心一次，然后将上清液用4层纱布过滤，去除上清液中的漂浮物，即为卡那霉素废液。
[0076]
(3)降解卡那霉素废液效果
[0077]
取100ml上述卡那霉素废液，加入10ml的aqukgdα和aqukgdγ粗酶液和终浓度为1mmol/l的吩嗪硫酸甲脂pms，37℃过夜反应。离心取上清，采用高效液相色谱法检测卡那霉素的降解。结果如图9所示，12小时后卡那霉素全部降解为kana-1(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)。
[0078]
实施例4
[0079]
kdr-a和kdr-b基因体外表达后用于卡那霉素菌渣中卡那霉素的降解
[0080]
(1)aqukgdα和aqukgdγ粗酶液准备
[0081]
步骤2.6构建好的petkdr-a/pcolakdr-b双表达宿主菌按1％的接种量转接到1000ml含相应抗生素lb液体培养基中，于37℃，230r/min培养至od
600
为0.4～0.6时，向培养液中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，并于16℃诱导20h。收集菌体，并加入适量的裂解缓冲液，利用超声波破碎仪对菌细胞进行冰浴破碎从而获得aqukgdα和aqukgdγ粗酶液。破碎条件为：工作3秒，停顿3秒，功率35％，破碎时间10～15min。
[0082]
(2)称取100g菌渣，置于培养皿中，然后先各加入菌渣质量30％的菌液，再加入10％上述粗酶液，补充蒸馏水，使得水分和菌液添加总量为60％，搅拌均匀，盖上皿盖，用报纸密封，在尽量降低水分蒸发的条件下保证透气性，然后将其置于37℃恒温箱中。一定时间后取出菌渣用蒸馏水溶解，去沉淀，上清进行hplc检测。结果如图10所示，96小时后菌渣中的卡那霉素残留被降解成kana-1(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)。
[0083]
实施例5
[0084]
kdr-a和kdr-b基因体外表达后用于养殖水体中卡那霉素残留的降解
[0085]
(1)aqukgdα和aqukgdγ粗酶液准备
[0086]
步骤2.6构建好的petkdr-a/pcolakdr-b双表达宿主菌按1％的接种量转接到1000ml含相应抗生素lb液体培养基中，于37℃，230r/min培养至od
600
为0.4～0.6时，向培养液中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，并于16℃诱导20h。收集菌体，并加入适量的裂解缓冲液，利用超声波破碎仪对菌细胞进行冰浴破碎从而获得aqukgdα和aqukgdγ粗酶液。破碎条件为：工作3秒，停顿3秒，功率35％，破碎时间10～15min。
[0087]
(2)废水从养殖场取回后保存于冷库中，使用前经过4000r/min离心2min。取100ml离心后的养殖废水，加入10ml的aqukgdα和aqukgdγ粗酶液和终浓度为1mmol/l的吩嗪硫酸甲脂pms，37℃过夜反应。离心取上清，采用高效液相色谱法检测卡那霉素的降解。结果如图11所示，10小时后卡那霉素全部降解为kana-1(氨基环醇4,6-o-氨基糖二苷)。

技术特征：
1.卡那霉素降解酶基因，其特征在于：所述卡那霉素降解酶命名为aqukgdγ，aqukgdγ基因的核酸序列如seq id no.2所示。2.含有权利要求1所述的基因的aqukgdγ在降解卡那霉素中的应用。

技术总结
本发明公开了卡那霉素降解酶AquKGDγ基因及其应用。AquKGDγ基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。AquKGDγ能将卡那霉素（氨基环醇4,6-O-氨基糖二苷）降解为氨基环醇6-O-氨基糖苷。卡那霉素经AquKGDγ降解后的产物失去了对细菌的抑菌活性，此外，对降解产物的细胞毒性进行评估，发现与同浓度的母体卡那霉素相比，毒性显著降低。该结果表明用AquKGDγ对环境中的卡那霉素进行降解修复时不会引起二次污染，具有应用可行性。具有应用可行性。具有应用可行性。


技术研发人员：王明兹 陈志红 陈必链 陈立文 方森海
受保护的技术使用者：福建师范大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/10/11