一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法与流程

1.本发明涉及禽类胚胎成肌细胞培养技术领域，具体涉及一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法。


背景技术：

2.鸽子具备较高的经济价值，且鸽肉的营养价值相对于其他家禽来说更高，因此受到许多食客的喜爱，目前许多地区的养鸽业已经成为了新的地区经济增长点。鸽子的可食用肉主要集中于胸肌，占到了总体重的20％～40％，因此，为了满足市场的需求，提高鸽子胸肌产肉量是育种的方向。
3.为了提高鸽子的胸肌产肉率，分子育种是最快且高效的方法。成肌细胞作为骨骼肌的前体细胞，其在胚胎期的数量直接影响着肌肉的产量。因此，在胚胎期控制成肌细胞的增殖和分化程度，可以有效提高鸽子的产肉率，从而满足市场的需求。
4.由于在分子育种中，需要对鸽胚成肌细胞进行基因功能的体外验证，但目前其分离培养、冻存、复苏和传代方法仍鲜见报道，因此，开发一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法具有迫切的现实意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，该方法为鸽肌肉发育建立了体外培养模型，并且鸽胚成肌细胞的体外培养不受时空的影响。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.提供一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，包括以下步骤：
8.步骤a、选取欧洲肉鸽鸽胚，对其进行成肌细胞的分离，具体操作为：
9.采用0.25％胰酶将鸽子胸肌组织消化5～10min，而后终止消化，在4℃、800～1000r/min条件下离心、弃上清后得到成肌细胞，加入增殖培养基重悬后计数，调整细胞密度为5.8
×
105～6.2
×
105；
10.步骤b、对分离好的成肌细胞分别进行37℃和39℃的纯化培养后，吸出上清液，用增殖培养基进行增殖培养；
11.步骤c、当步骤b培养到细胞密度为70～80％后，更换分化培养基进行诱导分化并进行鉴定；
12.步骤d、对步骤b中纯化后的细胞悬液冻存液进行冻存，具体操作为：
13.采用0.25％胰酶将细胞消化5～10min，终止消化后，在4℃、800～1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，加入增殖培养基重悬后计数，然后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，向细胞悬液中加入冻存液并计数，装入冻存管中放入冻存盒，在-80℃下经过24h转入液氮冻存；
14.步骤e、对冻存的细胞进行复苏培养，具体操作为：
15.取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅迅速解冻后加入增殖培养基，4℃、1000r/min离心，弃上清后加入增殖培养基重悬并计数，而后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，接种到培养皿或培养瓶进行增殖培养；
16.步骤f、对复苏细胞培养到密度为70～80％后，进行传代操作，具体操作为：
17.采用0.25％胰酶将贴壁细胞消化2～3min，终止消化后，在4℃、800-1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，然后加入增殖培养基重悬并计数，调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后进行布板。
18.上述技术方案中，步骤a中，选取13日龄的欧洲肉鸽米玛斯品系鸽胚。
19.上述技术方案中，步骤b中，通过对比两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，得出培养鸽胚成肌细胞的最适温度为39℃。
20.上述技术方案中，步骤c中，在细胞诱导分化48h后，对其进行myhc免疫荧光实验和myog、myh1基因的定量分析，检测其是否为成肌细胞。
21.上述技术方案中，步骤d中，向细胞悬液中加入10％的冻存液dmso，采用缓慢降温的方式在-80℃冰箱降温24h后转入液氮进行保存。
22.上述技术方案中，步骤e中，向迅速解冻后的冻存细胞中加入10倍体积量的增殖培养基。
23.上述技术方案中，所述增殖培养基是由按体积百分比计的20％fbs、1％双抗和79％的dmem-f12组成。
24.本发明的有益效果：
25.(1)本发明首次建立了对鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的办法，该方法冻存的鸽胚成肌细胞的增殖分化能力良好，使得鸽肌肉发育相关的研究有了体外模型，并且鸽胚成肌细胞的体外培养不受时空的影响；
26.(2)本发明通过比对37℃和39℃两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，发现了39℃对鸽胚成肌细胞的增殖速度显著高于37℃，探索出鸽胚成肌细胞的最适培养温度，为后续优化鸽胚成肌细胞的体外培养效率提供了有益借鉴。
附图说明
27.图1是经过分离纯化培养的增殖期48h以及分化期24、36h鸽胚成肌细胞情况图(图中标尺均为100μm)。
28.图2是进行诱导分化48h的成肌细胞鉴定结果(图中标尺均为400μm)，其中蓝色是dapi染色所显示的细胞核，绿色是免疫荧光所显示的骨骼肌的主要结构和收缩蛋白-myhc蛋白即形成肌管的标志物。
29.图3是将细胞从存放冻存管的冻存盒转入液氮进行保存和复苏的操作示意图，其中图a为将冻存细胞的冻存管放入冻存盒在-80℃冻存24h的操作图；图b为转入液氮保存的操作图；图c为将冻存细胞在37℃水浴锅中摇动解冻的操作图。
30.图4是冻存细胞复苏增殖48h、分化培养12、36h的情况图(图中标尺均为100μm)。
31.图5是冻存细胞的分化48h鉴定结果图(图中标尺均为200μm)。
32.图6是冻存细胞传代增殖期48h培养以及分化期24、48h的情况图(图中标尺均为200μm)。
33.图7是不同温度下鸽胚成肌细胞增殖48h后的edu染色对比图(图a)以及增殖率(细胞增殖个数/所有细胞个数)对比图(图b)。
34.图8是不同温度下鸽胚成肌细胞分化48h的myhc免疫荧光对比图(图a)以及肌管融合率(融合的细胞核数/总细胞核数)对比图(图b)，图中标尺均为200μm。
35.图9是不同温度下培养的鸽胚增殖和分化主要调控基因的相对定量结果图，其中：图a分别是分化48h的成肌细胞增殖期主要调控基因myod、myf5基因的rt-qpcr检测分析对比图；图b分别是分化48h的成肌细胞的主要调控基因myh1、myog基因的rt-qpcr检测分析对比图。
具体实施方式
36.结合以下实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的材料。
37.本实施例中使用的试剂如下：
38.pbs购于gibco，货号为c10010500bt；
39.双抗购于gibco，货号为15140122；
40.dmem-f12购于gibco，货号为c11330500bt；
41.fbs购于gibco，货号为10091148；
42.dmso购于sigma。
43.增殖培养基的配方组成：按体积百分比计的20％fbs、1％双抗和79％的dmem-f12。
44.分化培养基的配方组成：按体积百分比计的2％马血清、1％双抗和97％的dmem-f12溶液。
45.本实施例选取13胚龄的欧洲肉鸽米玛斯品系鸽胚为例，一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，包括以下步骤：
46.一、鸽胚成肌细胞体外培养方法的建立
47.步骤a、对鸽胚进行成肌细胞的分离：
48.将鸽胚转移至超净台，打开鸽胚大端，取出鸽胚转移至含有1％双抗pbs溶液的培养皿中，清洗并采集胸肌，将采集到的胸肌转移到新的含有1％双抗pbs溶液的培养皿中，用剪刀和镊子小心的去除毛、皮等，反复清洗多次去除血细胞转移至1.5ml离心管内；用经过高压的小剪刀剪成肉糜，再用高压过的碾压棒进行碾压处理，采用0.25％胰酶，吹打成悬液，转移至50ml离心管内，增加胰酶体积，使总体积在组织体积的5～10倍；然后在37℃条件下，将鸽子胸肌组织消化5～10min，而后终止消化，取出吹打，并过200目细胞筛(70μm)；接着在4℃、800～1000r/min条件下离心5min，弃上清后得到成肌细胞，加入增殖培养基重悬，并进行细胞计数，调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105。
49.步骤b、利用成肌细胞与其他细胞贴壁时间的时间差，对分离好的成肌细胞分别进行37℃和39℃的纯化培养1.5～2h后，吸出上清液，用增殖培养基进行增殖培养；。
50.步骤c、当步骤b培养到细胞密度为70～80％后，更换分化培养基进行诱导分化。经过分离纯化培养的增殖期48h以及分化期24、36h鸽胚成肌细胞情况见图1，结果显示体外培养的鸽胚成肌细胞生长情况良好。
51.在细胞诱导分化48h后对其进行myhc免疫荧光实验并用rt-qpcr法进行myog、myh1基因的定量分析，检测其是否为成肌细胞。增殖期基因的引物序列如表1所示：
52.表1.增殖期基因的引物序列
[0053][0054]
鉴定结果如表2所示，图中蓝色是dapi染色所显示的细胞核，绿色则是免疫荧光所显示的骨骼肌的主要结构和收缩蛋白：myhc蛋白，即形成肌管的标志物。从免疫荧光结果可以看出，培养的细胞出现了绿色荧光信号的成熟肌管结构蛋白，因此，可以确定培养的细胞的确是鸽胚成肌细胞，表明鸽胚成肌细胞体外培养方法成功建立。
[0055]
二、鸽胚成肌细胞的冻存、复苏和传代
[0056]
步骤d、对步骤b中纯化后的细胞悬液冻存液进行冻存，具体操作为：
[0057]
采用0.25％胰酶将贴壁细胞消化2～3min，终止消化后，在4℃、800～1000r/min条件下离心5min，弃上清后得到细胞，加入增殖培养基重悬后计数，然后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，向细胞悬液中加入10％的冻存液dmso，轻轻吹打混合均匀后转至1.8ml内旋冻存管；放入异丙醇冻存盒，放入-80℃冰箱，等待24h后转入液氮冻存若干天。冻存操作如图3所示。
[0058]
步骤e、对冻存的细胞进行复苏培养，具体操作为：
[0059]
取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅，不断摇动，待冰块融化后迅速取出，加入10倍冻存体积量的增殖培养基，在4℃、1000r/min下离心5min，弃上清，加入增殖培养基重悬计数，调整细胞密度5.8
×
105～6.2
×
105后，接种到培养皿或培养瓶进行增殖培养。
[0060]
待细胞培养到密度为70～80％后，更换分化培养基进行诱导分化。冻存细胞复苏增殖48h、分化培养12h、36h的情况如图4所示，图中可以看到增殖培养有小梭形细胞和圆形细胞且细胞形态正常，增殖情况良好；在分化诱导12h和36h的图中可以清晰看到细胞融合为长且粗的肌管，圆形以及梭形细胞减少，证明诱导分化情况良好。
[0061]
在细胞诱导分化48h后对其进行myhc免疫荧光实验，检测其是否为成肌细胞。鉴定结果见图5，从免疫荧光结果可以看出，培养的细胞出现了绿色长条状荧光信号的成熟肌管结构蛋白，因而冻存后复苏培养细胞的确为成肌细胞，按照此方法冻存操作可行。冻存细胞复苏后活力良好，可以诱导分化为肌管。
[0062]
步骤f、对复苏细胞培养到密度为70～80％后，进行传代操作，具体操作为：
[0063]
吸出培养基，加入0.25％胰酶消化5min，后加入增殖培养基终止消化后，在4℃、1000r/min条件下离心5min，弃上清后得到细胞，然后加入增殖培养基吹打重悬并计数，调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后进行布板，继续进行增殖培养。
[0064]
冻存细胞传代增殖期48h培养以及分化期24h、48h的情况如图6所示，图中细胞形
态正常：增殖期为圆形及梭形细胞，增殖情况良好；分化期为长条状多核融合肌管，伴随有未分化的圆形细胞。因此冻存的鸽胚成肌细胞活力良好，传代培养成功，表明通过此方法冻存的细胞具有活力，可以进行后期的培养。
[0065]
本实施例中，进一步通过步骤b探索鸽胚成肌细胞的培养温度，通过对比两个培养温度(37℃和39℃培)下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，确定培养鸽胚成肌细胞的最适温度。具体检测分析如下：
[0066]
待不同温度下细胞培养到密度为70～80％时，更换分化培养基进行诱导分化，进行edu实验并收集细胞进行myhc免疫荧光实验以及进行myog、myh1基因的rt-qpcr检测分析。分化期基因的引物序列如表2所示：
[0067]
表2.分化期基因的引物序列
[0068][0069]
(1)对比不同温度下的细胞增殖率，即细胞增殖个数/所有细胞个数，结果见图7。图7中的图a为不同温度下鸽胚成肌细胞增殖48h后edu染色对比图，图中蓝色荧光信号为dapi染色的细胞核，绿色信号为胸腺嘧啶脱氧核苷类似物(edu)染色的增殖细胞dna信号；图a第一行为37℃细胞的edu染色图，第二行为39℃细胞的edu染色图。图b为经过统计测算后的增殖率(细胞增殖个数/所有细胞个数)对比图，可以看出39℃培养条件下细胞增殖率显著高于37℃，从而确定培养鸽胚成肌细胞的最适温度为39℃。
[0070]
(2)对比不同温度下的肌管融合率(融合的细胞核数/总细胞核数)，结果件图8。图8中的图a为不同温度下鸽胚成肌细胞分化48h的myhc免疫荧光对比图，图中蓝色荧光信号为dapi染色的细胞核，绿色信号为myhc蛋白染色的成熟肌管结构蛋白；图a第一行为39℃细胞的myhc免疫荧光图，第二行为37℃细胞的myhc免疫荧光图。图b为经过统计测算后的肌管融合率对比图，可以看出37℃的培养条件下成肌细胞分化效率更高，但是与39℃相比未达到显著性差异。
[0071]
(3)对比不同温度下的细胞myod、myf1基因的表达量，结果见图9，图a和b分别是48h的成肌细胞增殖期主要调控基因myod、myf5基因的rt-qpcr检测分析对比图；图c和d则是不同温度下的培养分化48h的成肌细胞的主要调控基因myh1、myog基因的rt-qpcr检测分析对比图。结果可以看出，不同温度下，39℃的增殖期myod基因显著高于37℃，myf5基因显著低于37℃；不同温度下，在分化期促使肌管融合的基因myh1未达到显著性，在基因上表达无显著差异，但myog的表达量在37℃显著高于39℃。因此，我们可以判断37℃是鸽胚成肌细胞的最适分化温度，其mrna的相对表达量与细胞的生长状态一致。
[0072]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应
当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、选取欧洲肉鸽鸽胚，对其进行成肌细胞的分离，具体操作为：采用0.25％胰酶将鸽子胸肌组织消化5～10min，而后终止消化，在4℃、800～1000r/min条件下离心、弃上清后得到成肌细胞，加入增殖培养基重悬后计数，调整细胞密度为5.8
×
105～6.2
×
105；步骤b、对分离好的成肌细胞分别进行37℃和39℃的纯化培养后，吸出上清液，用增殖培养基进行增殖培养；步骤c、当步骤b培养到细胞密度为70～80％后，更换分化培养基进行诱导分化并进行鉴定；步骤d、对步骤b中纯化后的细胞悬液冻存液进行冻存，具体操作为：采用0.25％胰酶将细胞消化5～10min，终止消化后，在4℃、800～1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，加入增殖培养基重悬后计数，然后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，向细胞悬液中加入冻存液并计数，装入冻存管中放入冻存盒，在-80℃下经过24h转入液氮冻存；步骤e、对冻存的细胞进行复苏培养，具体操作为：取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅迅速解冻后加入增殖培养基，4℃、1000r/min离心，弃上清后加入增殖培养基重悬并计数，而后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，接种到培养皿或培养瓶进行增殖培养；步骤f、对复苏细胞培养到密度为70～80％后，进行传代操作，具体操作为：采用0.25％胰酶将细胞消化5～10min，终止消化后，在4℃、800-1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，然后加入增殖培养基重悬并计数，调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后进行布板。2.根据权利要求1所述的一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：步骤a中，选取13日龄的欧洲肉鸽米玛斯品系鸽胚。3.根据权利要求1所述的一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：步骤b中，通过对比两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，得出培养鸽胚成肌细胞的最适温度为39℃。4.根据权利要求1所述的一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：步骤c中，在细胞诱导分化48h后，对其进行myhc免疫荧光实验和myog、myh1基因的定量分析，检测其是否为成肌细胞。5.根据权利要求1所述的一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：步骤d中，向细胞悬液中加入10％的冻存液dmso，采用缓慢降温的方式在-80℃冰箱降温24h后转入液氮进行保存。6.根据权利要求1所述的一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：步骤e中，向迅速解冻后的冻存细胞中加入10倍体积量的增殖培养基。7.根据权利要求1所述的一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：所述增殖培养基是由按体积百分比计的20％fbs、1％双抗和79％的dmem-f12组成。

技术总结
本发明涉及禽类胚胎成肌细胞培养技术领域，具体涉及一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，该方法冻存的鸽胚成肌细胞的增殖分化能力良好，使得鸽肌肉发育相关的研究有了体外模型，并且鸽胚成肌细胞的体外培养不受时空的影响；并且，本发明通过比对37℃和39℃两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，探索出鸽胚成肌细胞的最适培养温度，为后续优化鸽胚成肌细胞的体外培养效率提供了有益借鉴。供了有益借鉴。供了有益借鉴。


技术研发人员：张续勐 朱辰语 黄运茂 王梓颖 肖小烽 常楷悦 伍仲平 梁雅妍 陈益填 沈栩 李秀金
受保护的技术使用者：梅州市金绿现代农业发展有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/10/11