一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶及其制备方法

1.本发明涉及水凝胶制备技术领域，具体而言，涉及一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.纳米材料因具有小尺寸效应、较高的包裹效率、高灵敏度等特性，已广泛应用于材料、医药、生物和食品等领域中。但是由于纳米材料的尺寸、形貌及结构取决于材料的制备方法，为了得到具有应用价值的纳米材料，如何制备超细、高纯、均匀的纳米材料显得尤为重要。另外，纳米粒子的稳定性与其所暴露的环境有直接的关系，为提高其稳定性，通常会选择合适的载体对其进行负载，而水凝胶因其独特的三维网状结构而被广泛地用作递送体系，因此将水凝胶作为纳米粒子的载体很有前景，但在使用过程中水凝胶的结构和功能完整性也会受到外部机械力或化学腐蚀的影响，特别是在复杂的环境中。
3.纳米粒子的制备方法可大致分为物理法和化学法，物理法一般指机械方法，适用于金属类等固体纳米粒子，但对于生物活性材料纳米粒子多用化学法，且最常用化学液相法，但该方法合成的纳米粒子往往受原料纯度、添加量、添加顺序等多种因素的影响，使得到的生物活性材料纳米粒子粒径分布不均匀、有杂质、团聚甚至是失去活性，这些都会影响纳米粒子的功效和进一步的负载。壳聚糖是一种安全性较高的天然高分子物质，且带正电荷，可与一些带负电荷的盐类物质交联形成水凝胶，考虑到作为载体的水凝胶需要有一定的释放效率，因此具有响应性的水凝胶在作为载体时更受青睐。壳聚糖与β-甘油磷酸钠可以在一定条件下形成温敏性水凝胶，但温度范围相对比较广泛，形成的水凝胶的稳定性也有明显的差异，因此，若要选取其作为载体，对其凝胶条件进行优化是使其成为可靠载体的关键，否则对负载率和释放率均会有很大的影响。
4.目前已有的水凝胶纳米粒子体系很多，但大多数以无机纳米粒子为主，加之生物安全性较高且可用于制备水凝胶的高分子物质并不多，因此，制备具有一定功效同时又能保证生物安全性的水凝胶纳米粒子体系具有一定的挑战性。要同时克服水凝胶和纳米粒子的稳定性问题，不仅要考虑二者各自制备方法的不同，更要考虑纳米粒子与水凝胶间的适配度，以及负载后的协同效应。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，以解决常规方法制备水凝胶时纳米粒子与水凝胶的适配度差，协同效应一般的问题。
6.为了解决上述问题，本发明提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.s1：选取分子量100000-500000的壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后进行冰浴搅拌得到混合液，将所述混合液进行水浴处理后得到水凝胶混合液；
8.s2：选取乳酸链球菌素作为活性物质，经过提纯处理后加水得到乳酸链球菌素水溶液，将所述乳酸链球菌素水溶液与γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌得到混合溶液，将所述混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌后，得到纳米粒子溶液；
9.s3：将所述步骤s2制备得到的纳米粒子溶液进行均质处理并过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；
10.s4：将所述步骤s3制得的纯净纳米粒子溶液加入至所述步骤s1制备的水凝胶混合液中，搅拌后在25℃-37℃的温度下水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。
11.相对于现有技术，本发明的制备方法具备以下的技术进步：
12.1.本发明的制备方法中，通过控制水凝胶条件的优化使水凝胶的凝胶性能得到保证，从表征结果中可以看出，在探究得到的较优条件下，壳聚糖与β-磷酸甘油钠的化学键结合更牢固，交联效果更好，三维网状结构更明显
13.2.本发明制备方法中对于的乳酸链球菌素提纯处理，对于纳米粒子的均匀性和粒径分布极为关键，并且可以节省成本。
14.3.通过本发明制备方法得到的乳酸链球菌素纳米粒子，活性得到很好地保持，粒径分布较为均匀且较小，粒径在120nm左右，更适合于负载。
15.4.本发明的制备方法中，纳米粒子与水凝胶中均使用了壳聚糖作为基质，避免负载后得到的体系中成分过于杂乱，且壳聚糖安全性极高，更有前景应用于生物学领域。
16.5.本发明的制备方法中，乳酸链球菌素纳米粒子与壳聚糖水凝胶负载之后，保证了纳米粒子活性和水凝胶的温敏性。
17.作为优选的方案，所述步骤s1中，所述壳聚糖溶液为2％壳聚糖的盐酸溶液，所述β-磷酸甘油钠溶液为45％的β-磷酸甘油钠溶液。
18.作为优选的方案，所述壳聚糖溶液与所述β-磷酸甘油钠溶液的体积比为(4-8)：2。
19.作为优选的方案，所述步骤s1中，所述冰浴搅拌的时间为30min，所述水浴处理的温度为37℃。
20.作为优选的方案，所述步骤s2中，所述提纯处理的条件为：通过截留分子量为1000d的透析袋对乳酸链球菌素进行提纯。
21.作为优选的方案，所述步骤s2中，所述乳酸链球菌素水溶液与所述γ-聚谷氨酸水溶液的体积比为1:1，且所述γ-聚谷氨酸水溶液的γ-聚谷氨酸含量为4mg/ml，所述乳酸链球菌素水溶液中乳酸链球菌素的浓度为12-24mg/ml。
22.作为优选的方案，所述步骤s2中，所述壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖醋酸的浓度为2mg/ml，且所述混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液的方式为逐滴加入，所述进行搅拌与所述再次搅拌的时间均为30min。
23.作为优选的方案，所述步骤s3中，所述均质处理并过滤去杂质的条件为：将所述纳米粒子溶液置于微量高速均质机下均质处理1.5min-5min，并使用0.22μm滤膜对其进行过滤去杂质。
24.作为优选的方案，所述步骤s4中，所述纯净纳米粒子溶液的加入方式为逐滴加入，所述搅拌的时间为30min，所述水浴加热的温度为37℃。
25.本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝
胶，以解决常规水凝胶稳定性和生物安全性一般的问题。
26.为了解决上述问题，本发明提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶，所述水凝胶由所述制备方法制备而得。
27.相对于现有技术，本发明制备得到的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶具备以下的技术进步：
28.通过本发明制备得到的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的化学键结合更牢固，交联效果更好，三维网状结构更明显，且稳定性好，生物安全性高。
附图说明
29.图1为不同分子量、不同体积比下的凝胶状态图；
30.其中，(a)为10w分子量的壳聚糖与不同体积比的β-gp的凝胶状态图，(b)为50w分子量的壳聚糖与不同体积比的β-gp的凝胶状态图；
31.图2为红外光谱分析结果图；
32.图3为分子量10w，温度37℃，体积比7:3的水凝胶形貌分析图；
33.图4为分子量10w，温度37℃，体积比8:2的水凝胶形貌分析图；
34.图5为分子量50w，温度37℃，体积比8:2的水凝胶形貌分析图；
35.图6为凝胶组别流变学分析结果的温度扫描图；
36.图7为凝胶组别流变学分析结果的时间扫描图；
37.图8为水凝胶溶胀率比较图；
38.图9为粒径分布图；
39.图10为细胞增值率比较图；
40.其中，从左至右依次为10w/8:2、10w/7:3、50w/8:2的分组；
41.图11为溶血率结果图；
42.其中，从左至右依次为10w/8:2、10w/7:3、50w/8:2的分组。
具体实施方式
43.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.本发明提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
45.s1：选取分子量100000-500000的壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后进行冰浴搅拌得到混合液，将所述混合液进行水浴处理后得到水凝胶混合液；
46.s2：选取乳酸链球菌素作为活性物质，经过提纯处理后加水得到乳酸链球菌素水溶液，将所述乳酸链球菌素水溶液与γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌得到混合溶液，将所述混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌后，得到纳米粒子溶液；
47.s3：将所述步骤s2制备得到的纳米粒子溶液进行均质处理并过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；
48.s4：将所述步骤s3制得的纯净纳米粒子溶液加入至所述步骤s1制备的水凝胶混合
液中，搅拌后在25℃-37℃的温度下水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。
49.优选的，所述壳聚糖溶液与所述β-磷酸甘油钠溶液的体积比为(4-8)：2。
50.优选的，所述步骤s1中，所述冰浴搅拌的时间为30min，所述水浴处理的温度为37℃。
51.优选的，所述步骤s2中，所述提纯处理的条件为：通过截留分子量为1000d的透析袋对乳酸链球菌素进行提纯。
52.优选的，所述步骤s2中，所述乳酸链球菌素水溶液与所述γ-聚谷氨酸水溶液的体积比为1:1，且所述γ-聚谷氨酸水溶液的γ-聚谷氨酸含量为4mg/ml，所述乳酸链球菌素水溶液中乳酸链球菌素的浓度为12-24mg/ml。
53.优选的，所述步骤s2中，所述壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖醋酸的浓度为2mg/ml，且所述混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液的方式为逐滴加入，所述进行搅拌与所述再次搅拌的时间均为30min。
54.优选的，所述步骤s3中，所述均质处理并过滤去杂质的条件为：将所述纳米粒子溶液置于微量高速均质机下均质处理1.5min-5min，并使用0.22μm滤膜对其进行过滤去杂质。
55.优选的，所述步骤s4中，所述纯净纳米粒子溶液的加入方式为逐滴加入，所述搅拌的时间为30min，所述水浴加热的温度为37℃。
56.本发明还提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶，所述水凝胶由所述制备方法制备而得。
57.实施例1：
58.本实施例提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
59.s1：选取分子量100000的壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后进行30min的冰浴搅拌得到混合液，所述壳聚糖溶液与所述β-磷酸甘油钠溶液的体积比为4：2，将所述混合液进行37℃的水浴处理后得到水凝胶混合液；
60.s2：选取乳酸链球菌素作为活性物质，通过截留分子量为1000d的透析袋对乳酸链球菌素进行提纯，经过提纯处理后加水得到12mg/ml的乳酸链球菌素水溶液，将所述乳酸链球菌素水溶液与等量的4mg/ml得γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌30min得到混合溶液，将所述混合溶液逐滴加入至2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌30min后，得到纳米粒子溶液；
61.s3：将所述步骤s2制备得到的纳米粒子溶液置于微量高速均质机下均质处理1.5min，并使用0.22μm滤膜对其进行过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；
62.s4：将所述步骤s3制得的纯净纳米粒子溶液逐滴加入至所述步骤s1制备的水凝胶混合液中，搅拌30min后在25℃的温度下水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。
63.实施例2：
64.本实施例提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
65.s1：选取分子量500000的壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后进行30min的冰
浴搅拌得到混合液，所述壳聚糖溶液与所述β-磷酸甘油钠溶液的体积比为8：2，将所述混合液进行37℃的水浴处理后得到水凝胶混合液；
66.s2：选取乳酸链球菌素作为活性物质，通过截留分子量为1000d的透析袋对乳酸链球菌素进行提纯，经过提纯处理后加水得到24mg/ml的乳酸链球菌素水溶液，将所述乳酸链球菌素水溶液与等量的4mg/ml得γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌30min得到混合溶液，将所述混合溶液逐滴加入至2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌30min后，得到纳米粒子溶液；
67.s3：将所述步骤s2制备得到的纳米粒子溶液置于微量高速均质机下均质处理5min，并使用0.22μm滤膜对其进行过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；
68.s4：将所述步骤s3制得的纯净纳米粒子溶液逐滴加入至所述步骤s1制备的水凝胶混合液中，搅拌30min后在37℃的温度下水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。
69.实施例3：
70.本实施例提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
71.s1：选取分子量300000的壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后进行30min的冰浴搅拌得到混合液，所述壳聚糖溶液与所述β-磷酸甘油钠溶液的体积比为6：2，将所述混合液进行37℃的水浴处理后得到水凝胶混合液；
72.s2：选取乳酸链球菌素作为活性物质，通过截留分子量为1000d的透析袋对乳酸链球菌素进行提纯，经过提纯处理后加水得到18mg/ml的乳酸链球菌素水溶液，将所述乳酸链球菌素水溶液与等量的4mg/ml得γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌30min得到混合溶液，将所述混合溶液逐滴加入至2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌30min后，得到纳米粒子溶液；
73.s3：将所述步骤s2制备得到的纳米粒子溶液置于微量高速均质机下均质处理3.25min，并使用0.22μm滤膜对其进行过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；
74.s4：将所述步骤s3制得的纯净纳米粒子溶液逐滴加入至所述步骤s1制备的水凝胶混合液中，搅拌30min后在31℃的温度下水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。
75.以下对本发明的上述技术方案进行解释与说明，并且包括本发明最优实施例的筛选以及对于实施例的技术表征，下述内容中，nisin为乳酸链球菌素，ngc为负载乳酸链球菌素的聚谷氨酸/壳聚糖，β-gp为β-磷酸甘油钠，mcs为壳聚糖：
76.1.水凝胶的制备及表征
77.(1)水凝胶的制备及较优凝胶条件的确定
78.称取2g干燥至恒重的mcs，在磁力搅拌的情况下加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，配置成2％的壳聚糖溶液，在室温搅拌24h至完全溶解，灭菌后置于4℃冰箱中备用。称取适量β-gp溶解于纯水中，37℃水浴下完全溶解后，得到45％的β-gp水溶液，用0.22μm一次性针式滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中备用。将45％的β-gp水溶液和2％mcs溶液按比例混合，在冰浴条件下持续搅拌30min，得到均匀透亮的mcs/β-gp混合液。混合液置于合适的温度下水水浴一定时间之后得到凝胶。
79.分别选取壳聚糖分子量、mcs/β-gp比例、水浴温度3个因素对水凝胶的凝胶条件进行探究，凝胶的状态图如图1所示。
80.筛选的过程如表1-3所示：
81.表1.不同分子量、不同体积比下的凝胶状态
[0082][0083]
表2.不同温度下的凝胶时间
[0084][0085]
综合以上结果，筛选得到凝胶效果最好的条件：
[0086]
表3.较优凝胶条件
[0087][0088][0089]
对上述较优凝胶条件进行进一步地实验：
[0090]
(2)水凝胶红外光谱分析
[0091]
将纯化cs/β-gp样品与kbr干粉压片，用傅里叶变换红外光谱仪测定样品的红外光谱，扫描波数范围为4000-400cm-1
，分辨率4cm-1
。
[0092]
测试的分析结果图如图2所示。
[0093]
(3)水凝胶形貌分析(sem)
[0094]
取cs/β-gp样品分散在贴有铝箔纸的载物台上，喷金制样，然后将样品置于s-4800扫描电镜中，在加速电压10kv下观察拍照，如图3、图4、图5所示，图3、图4、图5依次对应10w，37℃，7:3、10w，37℃，8:2、50w，37℃，8:2三个分组，由电镜结果可看出：水凝胶具有微观网状结构。
[0095]
(4)水凝胶流变学性能分析
[0096]
通过流变仪进行流变学分析，配备c35/1:angle＝1
°
的锥/板组合作为测量系统。将1ml水凝胶样品放入流变仪中，恒定频率1hz。
[0097]
1)在20℃～60℃的温度范围内以1℃/min的加热速率测量样品的流变性质，将储存模量g’(pa)和损耗模量g”(pa)的变化记录为温度的函数，以评估样品凝胶化的温度；
[0098]
2)将温度恒定在生理温度37℃，增加时间测量样品的流变性，将储存模量g’(pa)和损耗模量g”(pa)的变化记录为时间的函数，以评估样品凝胶化的时间。为防止水分蒸发，在温度(图6)和时间(图7)扫描的实验中，在样品周围加一层油。
[0099]
从图6、图7的曲线可以看出，上述筛选出的组别均可形分成凝胶，且从曲线交点处可以看出，10w分子量8:2体积比凝胶温度在38.0℃、凝胶时间为4min，50w分子量8:2体积比凝胶温度在22.7℃、凝胶时间为2min，均在37℃前或者左右凝胶。
[0100]
(5)抗菌性能分析
[0101]
取现制备的水凝胶混合液分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行了抑菌圈实验，如表4，结果显示水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑制作用很明显，但对大肠杆菌的抑菌效果并不明显，且水凝胶的抑菌效果与壳聚糖的含量具有一定的相关性，当壳聚糖比例较大的时候抑菌性能较强。
[0102]
表4.水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈数据
[0103][0104]
(6)水凝胶溶胀率
[0105]
取冻干后的水凝胶样品进行溶胀率测试，将水凝胶浸泡于1
×
的pbs缓冲液中，没隔一段时间取出水凝胶样品，用滤纸吸干表面水分之后测试水凝胶的质量，结果如图8所示，三组水凝胶均具有溶胀性质，且体积比为8:2的水凝胶的溶胀率达到200％以上，远远高于体积比为7:3的水凝胶。
[0106]
2.纳米粒子的制备及表征
[0107]
(1)乳酸链球菌素粗品的提纯
[0108]
乳酸链球菌素粗品来自洛阳奇泓生物科技有限公司，纯度为2％左右，将100g的乳酸链球菌素粗品溶解于70ml的蒸馏水中，得到黄棕色的黏稠溶液，分装到截留分子量为1000d的透析袋中，透析48小时后，透析袋中溶液分为明显的上清液和沉淀两层，将上清液收集并冻干得到乳酸链球菌素粉末，用bca试剂盒测定冻干后产品的浓度，结果显示乳酸链球菌素纯度提高至50％左右，后续实验均用提纯后的乳酸链球菌素样品进行。
[0109]
(2)负载乳酸链球菌素的聚谷氨酸/壳聚糖(ngc)纳米粒子的制备
[0110]
将一定量的10w分子量壳聚糖溶于体积分数为1％的醋酸溶液中，制备2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，可通过适当磁力搅拌加速壳聚糖的溶解，得到壳聚糖储备液。将一定量的乳酸链球菌素(nisin)溶解于无菌水中得20mg/ml的乳酸链球菌素溶液，配制4mg/ml的γ-聚谷氨酸水溶液，在搅拌条件下将等量的乳酸链球菌素溶液逐滴滴加至γ-聚谷氨酸水溶液中，形成乳酸链球菌素/聚谷氨酸纳米粒子，继续搅拌30min后，将上述乳酸链球菌素/聚谷
氨酸纳米粒子溶液逐滴滴加到等量的2mg/ml的壳聚糖储备溶液中，并继续搅拌30min。将上述所得ngc纳米粒子体系于均质机中低速均质3min后，用0.22μm滤膜过滤得到纯净的ngc(负载nisin的聚谷氨酸/壳聚糖)纳米粒子溶液。
[0111]
(3)粒径、pdi和zeta电势的测定
[0112]
采用激光粒度仪测定ngc纳米粒子的粒径分布和多分散系数(pdi)。激光粒度仪是通过衍射和散射的原理，分析纳米颗粒的大小以及粒径分布。ngc纳米粒子的zeta电势采用电位仪进行测定。实验重复三次取平均值得到ngc纳米粒子的z-均值为122.7nm，多分散系数(pdi)为0.473，电位测定显示ngc纳米粒子带正电荷，且电位为23.89mv，粒径分布图如图9所示，由图中峰的位置可以看出结果与z-均值保持一致，且基本无杂峰，纳米粒子比较均一。
[0113]
(4)包封率(ee)测定
[0114]
首先用上述方法制备出ngc纳米粒子，混合溶液搅拌后，将ngc纳米粒子体系于9659
×
g下离心40min，并将所得的上清液与bca法微量蛋白检测试剂盒反应，以测定未被包封的乳酸链球菌素的浓度。实验重复三次取平均值，在利用如下公式计算包封率得纳米粒子的平均包封率为86.18％，包封效果较好。
[0115][0116]
(5)ngc纳米粒子抗菌活性探究
[0117]
取现制备的纳米粒子溶液分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌圈实验，结果显示ngc纳米粒子抗菌作用很明显，抑菌圈直径达28.7
±
0.2mm，抑菌作用极佳。
[0118]
3.载乳酸链球菌素纳米粒复合温敏水凝胶的制备及表征
[0119]
(1)载乳酸链球菌素纳米粒复合温敏水凝胶的制备
[0120]
在磁力搅拌情况下，将具有优良特性的ngc纳米粒子固定到mcs/β-gp水凝胶上，搅拌均匀，制备成载纳米粒复合温敏水凝胶。
[0121]
(2)体外细胞毒性检测(cck-8)
[0122]
首先对raw细胞进行复苏并传代，进行细胞毒性实验的细胞一般保证传代10代以内，然后进行计数并铺板，将细胞以5000个细胞/孔的密度加100μl于96孔板中，在co2培养箱中于37℃培养12小时，使细胞贴壁。
[0123]
水凝胶浸提液的制备：将凝胶效果较好的3各组别的水凝胶混合液加入6孔板中，置于37℃下使其凝胶，凝胶后将等量的完全培养基加入孔板中，于37℃下接触12h，能明显观察到培养基颜色由粉红色转变为浅黄色。
[0124]
实验分组：空白组(只含有培养基)，对照组(含有细胞和培养基)，实验组(含有细胞、培养基和浸提液，共三组：10w分子量8:2体积比、10w分子量7:3体积比、50w分子量8:2体积比)，每组设置3个重复。
[0125]
细胞贴壁之后，移去原有培养液，按照实验分组每孔加入100μl对应的样品，分别在培养6h、12h、24h和48h时，换液并向孔中加入10μl cck-8溶液，加入cck-8溶液需要注意全程避光。将96孔板置于培养箱中继续培养1.5h后，观察到明显颜色变化，用酶标仪测量450nm处的吸光度。利用上述数据带入公式计算各组的相对细胞增殖率，结果显示当培养时间大于或者等于24h时，各组别的细胞增值率均大于100％，对细胞无毒性，结果如图10所
示。
[0126]
细胞增殖率(％)＝[(as-ab)/(ac-ab)]
×
100
[0127]
as＝实验孔吸光度(含有细胞，培养基，cck-8和浸提液的孔的吸光度)；
[0128]
ab＝空白孔吸光度(含有培养基和cck-8的孔的吸光度)；
[0129]
ac＝对照孔吸光度(含有细胞，培养基和cck-8的孔的吸光度)。
[0130]
(3)溶血活性检测
[0131]
取5ml抗凝的待测新鲜羊血，2000rpm室温离心10min，去掉上清；加入5ml生理盐水重悬细胞，2000rpm离心10min，去掉上清，重复洗涤三次。将细胞重悬于1
×
pbs溶液中，调整细胞浓度为1
×
108个细胞/ml(吸200μl沉淀，并加上10ml的1
×
pbs溶液，得到2％的血细胞悬液)。按上述制备浸提液的方法，制备水凝胶的水浸提液，先将100μl浸提液加入离心管中，再加入100μl血细胞充分混匀，用1
×
pbs溶液和曲拉通溶液作为0％和100％溶血的对照，设置3个重复。放至37℃培养箱，注意避光，1h后于575nm处测量吸光值，并用以下公式计算溶血活性。结果显示各组别的溶血活性均小于2％，溶血率结果图如图11所示。
[0132][0133]
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：s1：选取分子量100000-500000的壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后进行冰浴搅拌得到混合液，将所述混合液进行水浴处理后得到水凝胶混合液；s2：选取乳酸链球菌素作为活性物质，经过提纯处理后加水得到乳酸链球菌素水溶液，将所述乳酸链球菌素水溶液与γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌得到混合溶液，将所述混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌后，得到纳米粒子溶液；s3：将所述步骤s2制备得到的纳米粒子溶液进行均质处理并过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；s4：将所述步骤s3制得的纯净纳米粒子溶液加入至所述步骤s1制备的水凝胶混合液中，搅拌后在25℃-37℃的温度下水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。2.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中，所述壳聚糖溶液为2％壳聚糖的盐酸溶液，所述β-磷酸甘油钠溶液为45％的β-磷酸甘油钠溶液。3.根据权利要求2所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液与所述β-磷酸甘油钠溶液的体积比为(4-8)：2。4.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中，所述冰浴搅拌的时间为30min，所述水浴处理的温度为37℃。5.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中，所述提纯处理的条件为：通过截留分子量为1000d的透析袋对乳酸链球菌素进行提纯。6.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中，所述乳酸链球菌素水溶液与所述γ-聚谷氨酸水溶液的体积比为1:1，且所述γ-聚谷氨酸水溶液的γ-聚谷氨酸含量为4mg/ml，所述乳酸链球菌素水溶液中乳酸链球菌素的浓度为12-24mg/ml。7.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中，所述壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖醋酸的浓度为2mg/ml，且所述混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液的方式为逐滴加入，所述进行搅拌与所述再次搅拌的时间均为30min。8.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中，所述均质处理并过滤去杂质的条件为：将所述纳米粒子溶液置于微量高速均质机下均质处理1.5min-5min，并使用0.22μm滤膜对其进行过滤去杂质。9.根据权利要求1所述的负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中，所述纯净纳米粒子溶液的加入方式为逐滴加入，所述搅拌的时间为30min，所述水浴加热的温度为37℃。10.一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶，其特征在于：所述水凝胶由权利要求1-9任一项所述制备方法制备而得。

技术总结
本发明提供了一种负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：S1：选取壳聚糖溶液与β-磷酸甘油钠溶液混合后冰浴搅拌得到混合液，将混合液水浴处理后得到水凝胶混合液；S2：选取乳酸链球菌素经过提纯处理后加水得到乳酸链球菌素水溶液，与γ-聚谷氨酸水溶液溶液混合后，进行搅拌得到混合溶液，将混合溶液加入至壳聚糖醋酸溶液中，再次搅拌后，得到纳米粒子溶液；S3：将纳米粒子溶液进行均质处理并过滤去杂质后得到纯净纳米粒子溶液；S4：将纯净纳米粒子溶液加入至水凝胶混合液中，搅拌后水浴加热使溶液凝胶，即得到负载乳酸链球菌素纳米粒子的水凝胶。通过本发明制得的水凝胶稳定性和安全性好，具备较高的商业化价值。化价值。化价值。


技术研发人员：刘亚楠 黄月莹 郝姝婷 陈佳钰 王梦媛 林子恒
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/10/11