犬冠状病毒N蛋白抗原截短体及其应用的制作方法

犬冠状病毒n蛋白抗原截短体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种犬冠状病毒n蛋白抗原截短体及其应用。


背景技术：

2.犬冠状病毒目前缺乏有效治疗药物，犬八联疫苗包括冠状病毒疫苗，但是由于冠状病毒的突变率很高，存在多种类型，疫苗很难形成足够的保护力，很少被使用。通过加强饲养管理，严格执行卫生措施来预防，发病后采取对症治疗措施从而减少疾病的发生。犬冠状病毒的症状和流行病学与轮状病毒感染相似，而且常与轮状病毒、犬细小病毒等混合感染，诊断较为困难，需要建立快速灵敏、特异性强、操作简单、经济实用的诊断方法。
3.犬冠状病毒主要由核衣壳蛋白n、膜蛋白m、刺突蛋白s和小膜蛋白e等组成。核衣壳蛋白n参与病毒核衣壳形成，介导宿主细胞免疫，相对比较保守。膜蛋白m主要在病毒出芽、组装和成熟过程中发挥作用。刺突蛋白s能够识别并与宿主受体相互作用，决定了感染力和宿主范围，能够刺激宿主产生中和抗体，容易发生变异。目前犬冠状病毒的诊断和研究主要针对核衣壳蛋白n蛋白。
4.目前针对冠状病毒的研究主要集中在人类疾病相关的sars、mers和covid-19等病毒，犬冠状病毒的研究相对较少。犬冠状病毒n蛋白序列比对显示，已发表结构中人冠状病毒hcov-nl63的2段n蛋白结构序列相似度最高，covid-19的n蛋白全长序列也较相似。这两个冠状病毒n蛋白的结构均包含n段结构域ntd和c端结构域ctd两部分，hcov-nl63的n蛋白全长未筛选到蛋白质晶体，两个结构域片段分别进行结晶和结构解析，该成果可以为犬冠状病毒的研究提供借鉴和支持。
5.犬冠状病毒血清学检测的方法主要包括酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附试验具有快速、简便、廉价、可自动批量检测的优点。胶体金免疫层析法与酶联免疫吸附试验原理类似，肉眼可直接观察结果，不需要仪器，更加适合单个样品的检测。两种方法的建立均需要提供特异性抗原蛋白，通过工艺优化，从而获得敏感性高、特异性强的诊断制品。
6.因此，本发明通过筛选活性高的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体，为建立犬冠状病毒抗体检测方法提供优质原料。


技术实现要素：

7.为此，本发明实施例提供犬冠状病毒n蛋白抗原截短体及其应用。
8.为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：本发明提供一种犬冠状病毒n蛋白抗原截短体，所述抗原截短体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还提供上述所述犬冠状病毒n蛋白抗原截短体的编码基因，其编码基因为如seq id no.4所示的dna分子。
10.本发明还提供下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：（a1）含有上述所述编码基因的表达盒；（a2）含有上述所述编码基因的重组载体；（a3）含有上述所述编码基因的重组菌；（a4）含有上述所述编码基因的转基因细胞系。
11.本发明还提供上述所述的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体和/或上述所述的抗原截短体编码基因和/或上述所述的生物材料在制备抗原中的应用。
12.本发明还提供一种用于犬冠状病毒抗体的检测试剂，其活性成分为上述所述的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体。
13.优选地，上述所述检测试剂为elisa抗体检测试剂或荧光微球抗体检测试剂或胶体金抗体检测试剂。
14.本发明实施例具有如下优点：本发明根据已有和预测的蛋白质三维结构，对犬冠状病毒核衣壳蛋白n蛋白的结构进行了分析，选择稳定性较好的片段，使用大肠杆菌原核表达系统进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白活性高，可以很好地结合抗体，制备的elisa抗体检测试剂盒抗原原料生产成本低，试剂盒检测效果好，特异性和稳定性强，可以应用于临床犬血清样本中犬冠状病毒抗体检测。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
16.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
17.图1为本发明实施例提供的犬冠状病毒n蛋白的蛋白序列比对结果；图2为本发明实施例提供的已发表的冠状病毒n蛋白结构；图3为本发明实施例提供的alphafold预测的犬冠状病毒n蛋白结构；图4为本发明实施例提供的犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa截短体表达纯化后电泳结果图。
18.图中：a为hcov-nl63 ntd（5n4k）；b为hcov-nl63 ctd（5epw）；c为covid-19 n（8fd5）。
具体实施方式
19.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做
出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.本发明中，合成截短体基因序列公司：武汉金开瑞生物工程有限公司；bl21（de3）感受态细胞：购自北京全式金生物技术有限公司；pet-32a表达载体：购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1、犬冠状病毒n蛋白序列比对及结构分析
21.犬冠状病毒核衣壳蛋白n蛋白的序列参考美国生物技术信息中心ncbi的wdw25666.1氨基酸序列，共395个氨基酸残基，无信号肽和跨膜区，全长对应的核苷酸序列为oq198019.1，1188bp。将该蛋白质序列在ncbi blast功能中与蛋白质结构数据库pdb中的结构数据进行比对，结果如图1所示。第一行覆盖全长是covid-19（sars-cov2）n蛋白全长结构8fd5，同源性28.65%。同源性最高的是hcov-nl63的两个片段，ntd结构域5n4k的同源性为38.82%，ctd结构域5epw的同源性为38.05%，都具有一定参考价值。
22.hcov-nl63 ntd（5n4k）结构如图2中a部分所示，中间是3个反向平行的β片层，两边分布着无规则卷曲和球状硫酸根离子。hcov-nl63 ctd（5epw）结构如图2中b部分所示，整体结构一侧是多个α螺旋，另一侧是2个较长的β片层。covid-19 n（8fd5）全长结构如图2中c部分所示，左半边ntd结构域是2个β片层围绕着许多无规则卷曲，右边ctd结构域主要是α螺旋结构。hcov-nl63和covid-19的n蛋白的二级结构分布具有一定相似性。
23.我们利用加利福尼亚大学旧金山分校ucsf开发的免费结构展示软件chimerax提供的alphafold结构预测功能，输入犬冠状病毒n蛋白的395位氨基酸残基序列，使用alphafold软件计算和预测该蛋白三维结构，最终获得的预测结构如图3所示。该预测结构应该是基于已有结构信息进行的预测和模型搭建，左侧ntd结构域是中心3个β片层围绕着无规则卷曲和小α螺旋，右边ctd结构域是多个α螺旋和2个β片层分布两边，与已发表结构的二级结构分布类似。该结构中ntd和ctd两个结构域之间缺乏稳定相互作用，相对位置不固定，推测全长结构不稳定，单独的ntd和ctd具有稳定空间结构。
24.通过对比已解析的hcov-nl63的ntd和ctd截短体，我们选择犬冠状病毒n蛋白的27-157aa作为n端结构域ntd，245-346aa作为c端结构域ctd分别进行纯化用于后续试验验证。
25.犬冠状病毒n蛋白全长氨基酸序列（seq id no.1）：mssnvswadqvdaanrrqrsrsrgrsqnrtnasiplswftsiidesngnftslmppsgvptgmgtaaqqcgywyraptfyqvrrgkrvplppvwyfyflgtgphsnaaygtamdgvfwvktkngqidpksikalgvrdsgtdprranipnlpeglrvsvpnasrpqsraqsqtrsqnnsrassasrngsrassvdrtkedlkavvaqllsemgvnkafkqnqtqsqskkkqkgstpaatphpnqegkpvwkkkpnkeetvtqcfgprsdsknfgdadlirlgvddprfktvsyyapgasaslfdsmvtvtdgsdgkkrvtfhttievdptkpgfevfmaqidafkkpatfqqtqnfwetqastqnsitdyfrgttpgaggsaveietfemtdetk。
26.犬冠状病毒n蛋白全长核苷酸序列（seq id no.3）：atgagttctaatgtctcctgggccgaccaagttgacgcagctaatcgccggcaacgttctcgatccaggggcagatctcaaaacagaaccaatgcttcaattccgttgtcttggtttacctcaatcattgatgagtctaatggaaacttcactagtcttatgcctcctagtggtgtacctactggtatgggcactgcagctcagcagtgtggttactggtatcgtgcgccaaccttctatcaggtgcgccgcggtaaaagagtacctctacctcctgtatggtacttctacttttt
gggtactggtcctcattctaatgccgcttacggaacagcaatggatggcgttttctgggttaagacgaaaaatggtcagattgaccctaagtctattaaagctcttggtgtacgtgacagtggtacagatcctaggcgcgctaacatacctaaccttcctgaagggttgcgtgtgagcgttcctaatgcttccagaccacaatctagggctcagtctcagacaaggtcccagaataattcacgtgcttcctctgccagcagaaatggttccagagcttccagcgttgataggactaaggaggatcttaaggctgttgttgctcaacttctttcagagatgggtgtaaataaggctttcaagcagaatcagactcagtcccagtctaagaagaaacagaagggctccactcctgctgctaccccccaccctaatcaggagggcaaaccagtttggaagaaaaagcctaacaaggaagaaactgttacgcagtgctttggccctcgcagtgacagtaaaaattttggtgatgcagatttgatcagactcggtgttgatgatccgcgttttaagaccgtttcatactacgcaccgggtgcttctgcttccttgtttgattccatggtaactgtgactgatggctcagatggtaaaaagagagtgacgtttcacaccacaattgaggttgatcccacaaaaccgggatttgaagtgtttatggctcagattgatgctttcaagaaacctgcaaccttccagcagactcagaatttttgggagactcaggcctcaacacagaatagtatcactgactattttagaggcactactcctggtgcgggtggttctgcagttgaaattgaaacttttgaaatgactgatgaaactaagtga。
实施例2、犬冠状病毒n蛋白截短体表达、纯化和抗原活性验证
27.根据实施例1相似结构对比和n蛋白结构预测的结果，分别选择犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa和ctd 245-346aa两个结构域的截短体进行表达纯化。在基因公司分别合成对应的核苷酸序列，通过分子克隆的方法，构建到pet-32a表达载体上，鉴定正确后转化bl21（de3）感受态细胞，分别进行两个截短体的原核表达尝试。结果表明，ntd 27-157aa和ctd 245-346aa两个截短体均得到可溶性表达的蛋白质。其中，ntd 27-157aa蛋白截短体的电泳结果如图4所示，在大约32kda大小处有目的条带，纯度较高，含有少量杂质。
28.分别将纯化获得的犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa和ctd 245-346aa蛋白截短体使用间接elisa方法验证抗原活性。间接elisa方法步骤为：（1）包被：分别将纯化的犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa和ctd 245-346aa蛋白截短体稀释至1μg/ml，100μl/孔包被于96孔酶标板中，4℃包被过夜。
29.（2）封闭：用含0.1%bsa的封闭液进行封闭，200μl/孔，37℃封闭2h。
30.（3）洗涤：250μl/孔的pbst洗液（0.1%）洗板3次，最后一次甩干。
31.（4）一抗孵育：加入稀释后的犬冠状病毒临床血清，100μl/孔，37℃孵育30min（其中阳性对照为犬冠状病毒阳性血清，阴性对照为犬冠状病毒阴性血清，每组做三次重复）。
32.（5）洗涤：250μl/孔的pbst洗液（0.1%）洗板3次，最后一次甩干。
33.（6）二抗孵育：加入hrp标记的兔抗犬二抗（用pbs稀释10000倍）100μl/孔，37℃孵育30min。
34.（7）洗涤：250μl/孔的pbst洗液（0.1%）洗板3次，最后一次甩干。
35.（8）显色：加入tmb显色液（商品化）100μl/孔，37℃显色10min。
36.（9）终止：加入0.5m硫酸，50μl/孔，终止反应，用酶标仪测定od
450nm
值。
37.结果如表1所示，犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa截短体包被抗原临床血清检测结果与阳性对照接近，od
450nm
值大于1.0，具有较好的抗原活性，ctd 245-346aa截短体包被抗原临床血清检测结果与阴性对照接近，可判定不具有抗原活性。因此选择ntd 27-157aa截短体蛋白作为后续elisa包被抗原原料使用。
38.表1抗原活性验证结果
39.犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa截短体氨基酸序列（seq id no.2）：qnrtnasiplswftsiidesngnftslmppsgvptgmgtaaqqcgywyraptfyqvrrgkrvplppvwyfyflgtgphsnaaygtamdgvfwvktkngqidpksikalgvrdsgtdprranipnlpeglrv。
40.犬冠状病毒n蛋白的ntd 27-157aa截短体核苷酸序列（seq id no.4）：caaaacagaaccaatgcttcaattccgttgtcttggtttacctcaatcattgatgagtctaatggaaacttcactagtcttatgcctcctagtggtgtacctactggtatgggcactgcagctcagcagtgtggttactggtatcgtgcgccaaccttctatcaggtgcgccgcggtaaaagagtacctctacctcctgtatggtacttctactttttgggtactggtcctcattctaatgccgcttacggaacagcaatggatggcgttttctgggttaagacgaaaaatggtcagattgaccctaagtctattaaagctcttggtgtacgtgacagtggtacagatcctaggcgcgctaacatacctaaccttcctgaagggttgcgtgtg。
实施例3、基于犬冠状病毒n蛋白ntd 27-157aa截短体作为抗原的elisa抗体检测试剂盒
41.1. 犬冠状病毒n蛋白ntd 27-157aa截短体作为抗原包被的elisa抗体检测试剂盒制备和检验步骤：（1）包被：利用实施例2制备的犬冠状病毒n蛋白ntd 27-157aa截短体作为抗原制备的间接elisa抗体检测试剂盒，用于检测犬血清中犬冠状病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其中，该检测试剂盒中包被纯化的犬冠状病毒n蛋白ntd 27-157aa截短体蛋白浓度为1μg/ml。
42.（2）加样：从检测试剂盒中取出包被犬冠状病毒n蛋白ntd 27-157aa截短体抗原包被板，在血清稀释板上用样品稀释液100倍稀释待检测的血清（198μl样品稀释液和2μl待检血清混合），取100μl混合液加入酶标板中，同时阳性血清和阴性血清各加2孔，每孔100μl。
43.（3）一抗孵育：轻轻振荡均匀各孔中样品，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。
44.（4）洗涤：弃去板孔中的溶液，每孔加入250μl工作洗涤液，重复3次，最后一次洗板后将液体彻底拍干。
45.（5）二抗孵育：每孔加入100μl酶标抗体，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。
46.（6）洗涤：弃去板孔中的溶液，每孔加入250μl工作洗涤液，重复3次，最后一次洗板后将液体彻底拍干。
47.（7）显色：每孔加入100μl底物溶液，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育10分钟。
48.（8）终止：每孔加入50μl终止液终止反应。
49.（9）结果：测定样品和对照于450nm波长的吸光值（od
450nm
）。阳性对照od
450nm
值≥0.6，阴性对照od
450nm
值≤0.2，试验成立。
50.判读标准：s/p=（待检样品od
450nm
均值-阴性对照od
450nm
均值）/（阳性对照od
450nm
均值-阴性对照od
450nm
均值）。s/p≥0.45为待检样品血清抗体阳性；s/p＜0.45为待检样品血清抗体阴性。
51.2. elisa抗体检测试剂盒特异性试验用制备的试剂盒检测犬细小病毒cpv、犬瘟热病毒cdv、犬传染性肝炎病毒cav i抗体阳性血清和犬冠状病毒ccv抗体阳性血清。检测结果见表2所示，除犬冠状病毒抗体阳性血清的s/p值显著大于0.45外，其余血清s/p值小于0.45，符合阴性血清的判定标准，表明本发明的检测试剂盒具有良好的特异性。
52.表2特异性血清检测结果
53.3. elisa抗体检测试剂盒敏感性试验将犬冠状病毒抗体阳性血清分别稀释2、4、8、16、32、64和128倍，使用本发明制备的elisa抗体检测试剂盒及商品化的犬冠状病毒elisa抗体检测试剂盒同时进行检测。结果见表3所示，两种方法均可检测至32倍稀释的犬冠状病毒抗体阳性血清，表明本发明的检测试剂盒具有良好的敏感性。
54.表3敏感性血清检测结果
55.4. elisa抗体检测试剂盒符合率试验使用本发明的elisa抗体检测试剂盒及商品化的犬冠状病毒elisa抗体检测试剂盒同时检测30份犬血清样本，结果进行对比，本发明的elisa抗体检测试剂盒与商品化试剂盒样本检测的符合率为96.7%，说明与外购试剂盒有良好的适应性，检测结果和分析结果如表4和表5所示。
56.表4符合率检测结果
57.表5符合率分析结果
58.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1. 一种犬冠状病毒n蛋白抗原截短体，所述抗原截短体的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.权利要求1所述的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体的编码基因。3. 如权利要求2所述的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体的编码基因，其特征在于，所述编码基因为如seq id no.4所示的dna分子。4.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：（a1）含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒；（a2）含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体；（a3）含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌；（a4）含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。5.权利要求1所述的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体和/或权利要求2-3所述的抗原截短体编码基因和/或权利要求4所述的生物材料在制备抗原中的应用。6.一种用于犬冠状病毒抗体的检测试剂，其活性成分为权利要求1所述的犬冠状病毒n蛋白抗原截短体。7.如权利要求6所述的用于犬冠状病毒抗体的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为elisa抗体检测试剂或荧光微球抗体检测试剂或胶体金抗体检测试剂。

技术总结
本发明公开了一种犬冠状病毒N蛋白抗原截短体及其应用，所述抗原截短体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明根据已有和预测的蛋白质三维结构，对犬冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白的结构进行了分析，选择稳定性较好的片段，使用大肠杆菌原核表达系统进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白活性高，可以很好地结合抗体，制备的ELISA抗体检测试剂盒所用抗原原料生产成本低，试剂盒特异性好、敏感性高，可以应用于临床犬血清样本中犬冠状病毒抗体检测。应用于临床犬血清样本中犬冠状病毒抗体检测。应用于临床犬血清样本中犬冠状病毒抗体检测。


技术研发人员：张琼林 巩玉洁 赵荣茂 袁婷婷 陈娟 赵方圆 杨晓霞
受保护的技术使用者：北京纳百生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.05
技术公布日：2023/10/11