一株多功能微生物菌株和有机污染修复菌剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株多功能微生物菌株和有机污染修复菌剂及其应用，属于微生物菌剂技术领域。


背景技术：

2.随着石油开采量的不断增加和石油污染的日益严重，石油污染土壤的修复成为目前研究的热点。目前修复石油污染的方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。物理修复方法与化学修复方法成本高，对土壤环境扰动大，易破坏土壤生态；生物修复方法具有成本低，无二次污染等优点，因而受到人们的重视。土壤微生物修复技术是一种利用土著微生物或人工驯化或筛选的具有特定功能的微生物，在适宜环境条件下，通过自身的代谢作用，降低土壤中有害污染物活性或降解成无害物质的修复技术。有机污染土壤的微生物修复原理主要包括微生物的降解和转化，其通常是依靠氧化作用、还原作用、基因转移作用、水解作用等反应模式来实现的。土壤微生物修复技术应用成本低，对土壤肥力和代谢活性负面影响小，可以避免因污染物转移而对人类健康和环境产生影响。因此，土壤微生物修复技术的研究具有重要意义。
3.爱尔兰专利文献ies20140311a2（申请号ies20140311）公开了一种修复有害有机物和/或重金属污染基质的方法，用以修复有机污染和/或重金属污染的土壤、沉积物和/或污泥。该方法包含了生物刺激、生物添加、根际修复、植物修复和原始生态堆等过程。该方法的步骤为：a.设计包含污染物降解菌、植物促生菌和/或生物表面活性剂产生菌的微生物菌剂；b.基质预处理；c.生态堆的建设；d.在生态堆顶部播种修复植物。上述专利通过多种微生物配合共同实现促进植物生长和修复有机污染和重金属污染的作用。但由于其采用多株微生物共同作用，导致协调多株微生物生长特性的条件复杂，对搭配的微生物种类及数量的技术要求很高。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一株多功能微生物菌株和有机污染修复菌剂及其应用，该有机污染修复菌剂具有良好的降解石油烃、多环芳烃以及苯系物等的作用，从而实现对有机污染土壤快速修复的目的。
5.本发明的技术方案如下：一株恶臭假单胞菌(pseudomonas putida) am21，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27033。
6.所述恶臭假单胞菌(pseudomonas putida) am21，下述简称为恶臭假单胞菌am21。
7.上述恶臭假单胞菌am21的培养方法，包括如下步骤：（1）取恶臭假单胞菌am21接种于固体活化培养基，活化培养，制得活化后菌株；（2）取步骤（1）制得的活化后菌株接种至液体培养基中培养，制得种子液；
（3）取步骤（2）制得的种子液，按体积百分比2%～10%转接至扩大培养基中，扩大培养，制得恶臭假单胞菌am21菌液。
8.根据本发明优选的，步骤（1）中所述恶臭假单胞菌am21划线接种于固体活化培养基上。
9.根据本发明优选的，步骤（1）中所述固体活化培养基的组份如下：蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂20g/l，余量水，ph自然。
10.根据本发明优选的，步骤（1）中所述活化培养的条件为：33～37℃条件下培养1～2天。
11.根据本发明优选的，步骤（2）中所述液体培养基和步骤（3）中所述扩大培养基的组份如下：蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，余量水，ph自然。
12.根据本发明优选的，步骤（2）中所述培养的条件为：33～37℃、100～200转/分钟的条件下，培养1～2天。
13.根据本发明优选的，所述步骤（3）中所述扩大培养的条件为：33～37℃、溶氧20～30%的条件下，扩大培养1～2天。
14.一种有机污染修复菌剂，包括上述恶臭假单胞菌am21。
15.根据本发明优选的，所述有机污染修复菌剂还包括有机质载体。
16.进一步优选的，所述有机污染修复菌剂是由恶臭假单胞菌am21菌液与有机质载体混合制得。
17.进一步优选的，所述有机质载体为草炭土。
18.根据本发明优选的，所述有机污染修复菌剂的活菌浓度为（2～5）
×
109cfu/g。
19.在本发明优选的技术方案中，所述有机污染修复菌剂为恶臭假单胞菌am21菌液与有机质载体混合制得，由于有机质载体可以为菌株提供一定的营养物质，所以菌株在有机质载体中能够繁殖，保持活性。
20.上述有机污染修复菌剂在修复石油和/或焦化污染土壤中的应用。
21.根据本发明优选的，所述应用包括如下步骤：向含油量为3～8%石油和/或焦化污染土壤中接种所述有机污染修复菌剂，有机污染修复菌剂与污染土壤的质量比为（1～5）︰100，调节含水率为20～30%，混合混匀，在温度30
±
5℃下堆置进行降解。
22.上述恶臭假单胞菌am21在修复石油污染土壤中的应用。
23.上述恶臭假单胞菌am21在修复焦化污染土壤中的应用。
24.上述恶臭假单胞菌am21在修复石油及焦化复合污染土壤中的应用。
25.有益效果：1、本发明从石油污染土壤中筛选获得了一株具有高效修复石油污染土壤能力的菌株恶臭假单胞菌am21，该菌株还能够降解多种多环芳烃以及苯系物。由恶臭假单胞菌am21制备的菌剂能有效修复石油污染土壤以及焦化污染土壤。
26.2、本发明由恶臭假单胞菌am21制备的修复菌剂对石油及焦化复合污染土壤具有良好的修复效率，对含油量为3～8%的石油及焦化复合污染土壤的石油烃降解率在60d内可达60%以上，且对其中多种多环芳烃及苯系物的降解率可达到70%以上。因此，本发明的有机
污染修复菌剂对石油烃及焦化厂高浓度有机物复合污染的土壤有较好的修复效果，能同时降解复合污染土壤中的石油烃、多环芳烃、苯系物等，且具有较高的修复效率。
附图说明
27.图1为恶臭假单胞菌am21的16s rdna琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及原料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
29.实施例1一株恶臭假单胞菌am21的分离和鉴定：采集胜利油田高浓度石油污染土壤5 g，置于250 ml无菌三角瓶中，加入无菌无机盐培养基100 ml，在30℃、150 rpm条件下培养5 d，吸取菌液，用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
倍，各取100 μl涂布至无菌的石油-无机盐固体培养基，在30℃条件下静置培养3 d，挑取生长快、菌落大的克隆至100 ml石油-无机盐液体培养基，在30℃、150 rpm条件下培养3 d，吸取100 μl菌液涂布至无菌的石油-无机盐固体培养基，挑取单菌落。
30.其中，无机盐培养基，每升包括如下组分：kno31.5g，(nh4)2so41.5g，k2hpo41g，kh2po41g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 130g，feso4·
7h2o 0.01 g，dh2o定容至1 l；石油-无机盐固体培养基，每升包括如下组分：kno31.5g，(nh4)2so41.5g，k2hpo41g，kh2po41g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 130g，feso4·
7h2o 0.01 g，石油20g，琼脂20 g，dh2o定容至1 l；石油-无机盐液体培养基，每升包括如下组分：kno31.5g，(nh4)2so41.5g，k2hpo41g，kh2po41g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 130g，feso4·
7h2o 0.01 g，石油20g，dh2o定容至1 l。
31.将挑取的单菌落送测序公司进行测序，经检测，16s rdna序列含有1390 bp，核苷酸序列如seq id no.1所示。
32.菌种鉴定过程如下：样品：上述挑取的单菌落培养得到的细菌菌液；细菌基因组dna提取试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；tae 缓冲液（50
×
，1l）：tris 242g、冰醋酸 57.1ml、na2edta
·
2h2o 37.2g、加水至1l；琼脂糖：biowet，agarose g-10；2
×
pfu pcr mastermix、d2000 dna marker、核酸染料，loading buffer等：生工生物工程（上海）股份有限公司；dna纯化回收试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；离心管、枪头等耗材：美国gene era biotech公司；引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，按照合成单加入ddh2o，制成10μ
m溶液。
33.1、基因组dna提取，按细菌基因组dna提取试剂盒说明书操作。
34.2、pcr扩增2.1通用引物信息，见表1：表1.通用引物信息2.2 pcr扩增体系组分及构成，见表2：表2.pcr扩增体系组分及构成2.3 pcr扩增循环参数预变性：94℃，3min；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸，72℃，1.5min（共35个循环）；延伸72℃，10min；4℃保存。
35.3、琼脂糖凝胶电泳检测制备1.0%的琼脂糖凝胶，电泳时电压设置为18v/cm，电泳时间为20min。采用核酸染料进行琼脂糖电泳染色，采用紫外凝胶成像系统进行拍照。结果如图1所示。
36.4、纯化回收使用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
37.测序拼接序列及blast比对结果见表3：表3. 测序拼接序列blast比对结果通过序列16s rdna进行序列比对，发现遗传关系最接近的菌株为pseudomonas putida。
38.经上述菌种鉴定，本发明筛选的菌种属于pseudomonas putida，命名为恶臭假单胞菌am21，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27033。
39.实施例2恶臭假单胞菌am21的培养方法，步骤如下：（1）取恶臭假单胞菌am21划线接种于固体活化培养基上，35℃倒置活化培养2天，制得活化后菌株；其中，固体活化培养基每升包括如下组分：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1l，ph自然；（2）取步骤（1）制得的活化后菌株接种至液体培养基中，35℃、转速为150转/分钟的条件下，摇床培养2天，制得种子液；其中，液体培养基每升包括如下组分：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，水定容至1l，ph自然；（3）取步骤（2）制得的种子液，按体积百分比2%转接至扩大培养基中，35℃、溶氧30%的条件下，扩大培养2天，制得恶臭假单胞菌am21菌液，活菌浓度为4
×
109cfu/ml；其中，扩大培养基每升包括如下组分：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，水定容至1l，ph自然。
40.实施例3一种有机污染修复菌剂，由实施例2制得的恶臭假单胞菌am21菌液与草炭土按质量比1︰10的比例混合，自然放置两天后得有机污染修复菌剂。
41.经检测，所述有机污染修复菌剂中的活菌浓度为3.3
×
109cfu/g。
42.实施例4含有恶臭假单胞菌am21的有机污染修复菌剂在修复石油污染土壤中的应用，步骤如下：（1）将含油率4.3%的石油污染土壤与实施例3制得的有机污染修复菌剂按照质量比50:1的比例混合均匀，得菌土混合物，用灭菌蒸馏水调节含水率为25%；（2）保持菌土混合物含水率为25%，在温度30
±
5℃下堆置降解30 d。
43.降解完成后，采用红外分光光度法（hj1051-2019）测土壤中石油烃的降解率，由恶臭假单胞菌am21制备的有机污染修复菌剂对含油量为4.3%的石油污染土壤降解处理30d后，土壤的含油率为2.05%，石油烃的降解率可达52.3%。
44.实施例5含有恶臭假单胞菌am21的有机污染修复菌剂在修复焦化污染土壤中的应用，步骤如下：（1）取焦化污染土壤与实施例3制得的有机污染修复菌剂按照质量比50:1的比例混合均匀，得菌土混合物，用灭菌蒸馏水调节含水率为25%；（2）保持菌土混合物含水率为25%，在温度30
±
5℃下堆置降解40 d。
45.降解完成后，检测土壤中的主要污染物含量，并与修复前的土壤进行对比，计算有机污染物的降解率，结果如下表：表4. 焦化污染土壤中有机污染物的降解情况
由表4可知，本发明的有机污染修复菌剂对焦化污染土壤中的多种污染物都具有较强的降解能力；其中，对于芴、菲、荧蒽、芘的降解率达到90%以上，对于萘的降解率达到80%以上，对于蒽、苯、甲苯的降解率达到70%以上，对于间二甲苯、对二甲苯、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(a)芘也具有良好的降解能力。
46.实施例6含有恶臭假单胞菌am21的有机污染修复菌剂在修复石油及焦化复合污染土壤中的应用，步骤如下：（1）取石油污染土壤（含油率4.3%）和焦化污染土壤，按质量比1:1的比例混合，搅拌均匀；（2）取实施例3制备的有机污染修复菌剂，按1:50的质量比例添加至步骤（1）搅拌均匀的土壤中；（3）用灭菌蒸馏水调节含水率为25%，在30
±
5℃条件下堆置降解60d，降解过程中保持含水率为25%。
47.降解完成后，检测土壤中的主要污染物含量，并与修复前的土壤进行对比，计算有机污染物的降解率，结果如下表：表5. 石油及焦化复合污染土壤中有机污染物的降解情况
由表5可知，土壤修复60d后，石油烃的降解率达到64.1%，而且对多种多环芳烃都能进行有效降解，最高降解率为荧蒽，达到97.03%。对苯系物的降解率达到了74.3%~83.4%。结果显示，本发明的有机污染修复菌剂对石油及焦化复合污染土壤具有良好的修复效果。
48.结果分析：通过上述实施例的降解数据可以看出，本发明所公开的恶臭假单胞菌am21可以快速修复油田的石油污染土壤，对焦化厂的多环芳烃（pahs）污染土壤也有良好的修复作用，且对石油及焦化复合污染的土壤能进行快速有效的修复，拓宽了本发明中有机污染修复菌剂的应用范围，有较为广阔的应用前景。

技术特征：
1. 一株多功能微生物菌株，其特征在于，所述多功能微生物菌株为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)am21，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：cgmcc no. 27033。2.权利要求1所述的一株多功能微生物菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)am21接种于固体活化培养基，活化培养，制得活化后菌株；（2）取步骤（1）制得的活化后菌株接种至液体培养基中培养，制得种子液；（3）取步骤（2）制得的种子液，按体积百分比2%～10%转接至扩大培养基中，扩大培养，制得恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)am21菌液。3.如权利要求2所述的一株多功能微生物菌株的培养方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：i. 步骤（1）中所述恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)am21划线接种于固体活化培养基上；ii. 步骤（1）中所述固体活化培养基的组份如下：蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂20g/l，余量水，ph自然；iii. 步骤（1）中所述活化培养的条件为：33～37℃条件下培养1～2天；iv. 步骤（2）中所述液体培养基和步骤（3）中所述扩大培养基的组份如下：蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，余量水，ph自然；v. 步骤（2）中所述培养的条件为：33～37℃、100～200转/分钟的条件下，培养1～2天；vi. 所述步骤（3）中所述扩大培养的条件为：33～37℃、溶氧20～30%的条件下，扩大培养1～2天。4.权利要求1所述的一株多功能微生物菌株的应用，其特征在于，应用于修复石油和/或焦化污染土壤。5. 一种有机污染修复菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)am21。6.如权利要求5所述的一种有机污染修复菌剂，其特征在于，所述有机污染修复菌剂还包括有机质载体。7.如权利要求6所述的一种有机污染修复菌剂，其特征在于，所述有机质载体为草炭土。8.如权利要求5所述的一种有机污染修复菌剂，其特征在于，所述有机污染修复菌剂的活菌浓度为（2～5）
×
109cfu/g。9.权利要求5所述的一种有机污染修复菌剂的应用，其特征在于，应用于修复石油和/或焦化污染土壤。10.如权利要求9所述的一种有机污染修复菌剂的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：向含油量为3～8%石油和/或焦化污染土壤中接种权利要求5所述的有机污染修复菌剂，有机污染修复菌剂与污染土壤的质量比为（1～5）︰100，调节含水率为20～30%，混合混匀，在温度30
±
5℃下堆置进行降解。

技术总结
本发明涉及一株多功能微生物菌株和有机污染修复菌剂及其应用，属于微生物菌剂技术领域。本发明从石油污染土壤中筛选获得了一株具有高效修复石油污染土壤能力的菌株恶臭假单胞菌AM21，该菌株还能够降解多种多环芳烃以及苯系物，由恶臭假单胞菌AM21制备的菌剂能有效修复石油污染土壤以及焦化污染土壤。本发明由恶臭假单胞菌AM21制备的修复菌剂对含油量为3～8%的石油及焦化复合污染土壤的石油烃降解率在60d内可达60%以上，且对其中多种多环芳烃及苯系物的降解率可达到70%以上。及苯系物的降解率可达到70%以上。及苯系物的降解率可达到70%以上。


技术研发人员：刘雪梅 刘雪峰 张强
受保护的技术使用者：山东迈科珍生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.04
技术公布日：2023/10/11