一种合成核苷酸中间体的方法与流程

1.本发明属于医药领域，特别是涉及一种合成核苷酸中间体的方法。


背景技术：

2.基因测序是医学和生物学发现的重要推动力，随着基因测序技术的迅猛发展，高通量基因测序技术已深入生命科学的各个领域，高通量基因测序采用克隆扩增和边合成边测序（sbs）的测序化学技术，可以实现了快速、准确的测序，经过近十年来的迅猛发展，已经深入到生命科学的各个领域，不仅有力地推动了基础研究的发展，在临床应用阶段也占据重要的角色。在目前最为流行的高通量基因测序平台中，为了测定碱基类型，将荧光染料标记的四种可逆终止核苷酸（reversible termination nucleotide，nrt）和不带荧光染料标记的四种可逆终止核苷酸加入反应体系，通常的，每个修饰nrt的荧光染料标记通过可切割链连接在碱基上，并在3
’‑
oh端加以可切割的保护基团，不同的nrt会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定dna序列的顺序。
3.g-m是合成不带荧光染料标记的可逆终止核苷酸的重要中间体，g-m通过如下反应步骤可以合成得到可逆终止核苷酸；但是现有技术中g-m的合成方法步骤繁琐，并且会产生与g-m极性非常相似的副产物，导致分离纯化非常困难，较难得到高纯度的中间体g-m。因此，发展高效合成g-m中间体的新方法对于合成可逆终止核苷酸，以及基因测序均具有非常重要的意义。
[0004][0005]


技术实现要素：

[0006]
基于此，本发明的目的是提供一种反应步骤简单、后处理纯化简便，更容易得到高纯度核苷酸中间体g-m的新合成方法。
[0007]
为了达到上述发明目的，本发明包括如下技术方案。
[0008]
一种合成核苷酸中间体的方法，包括如下步骤：（1）化合物g-1在碱的作用下与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到化合物g-2；（2）化合物g-2、二甲基亚砜、乙酸和乙酸酐的混合体系进行pummerer重排反应，得到化合物g-3；（3）化合物g-3在碱的作用下进行水解反应，得到化合物g-4；（4）化合物g-4在碱的作用下与异丁酰氯反应，得到核苷酸中间体g-m；步骤（3）中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的一种或多种；其反应路线如下：
[0009][0010]
。
[0011]
本发明具有以下有益效果：发明提供的一种合成核苷酸中间体的方法，其反应步骤简单、后处理纯化非常简便，能够以较高收率和非常简便的纯化工艺制备得到高纯度的中间体g-m。
[0012]
本发明的合成方法所设计的新线路巧妙的利用水解保护基的方法，使反应液中g-4和g-2的极性大大分开，极易纯化得到高纯度的中间体g-4；同时副产物g-3’水解后即中间体g-2，可以回收利用，实现降本增效，大大降低了合成成本。
具体实施方式
[0013]
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0014]
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
[0015]
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
[0016]
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在 b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0017]
本发明的发明人在对核苷酸中间体g-m的合成研究过程中发现，核苷酸中间体g-m的一般合成路线都存在如下问题：一般异丁酰基保护嘌呤环的氨基前，需要先用tmscl对糖环上的羟基先进行保护，嘌呤环的氨基被异丁酰基保护之后，需脱除tms基团使羟基裸露，步骤繁琐；并且，会产生与中间体g-m极性非常相近的副产物（g-3’），使用硅胶柱分离纯化困难，很难得到高纯度中间体g-m。针对这些问题，本发明的发明人通过大量研究提出了一种反应步骤简单、后处理纯化简便，更容易得到高纯度中间体g-m的制备方法。
[0018]
在本发明的一个实施方式中，提供了一种合成核苷酸中间体的方法，包括如下步骤：（1）化合物g-1在碱的作用下与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到化合物g-2；（2）化合物g-2、二甲基亚砜、乙酸和乙酸酐的混合体系进行pummerer重排反应，得到化合物g-3；（3）化合物g-3在碱的作用下进行水解反应，得到化合物g-4；（4）化合物g-4在碱的作用下与异丁酰氯反应，得到核苷酸中间体g-m；步骤（3）中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的一种或多种；其反应路线如下：
[0019][0020]
。
[0021]
本发明新设计的合成路线巧妙的利用水解保护基的方法，使中间体g-4与主要副产物水解后的g-2的极性相差变大（参见如下含有副产物的合成路线），大大降低后处理纯化难度，极易纯化得到高纯度的中间体g-4；中间体g-4再进一步与异丁酰氯反应即可得到高纯度的核苷酸中间体g-m；并且上异丁酰基前无需使用tmscl保护羟基，简化了合成步骤，降低了合成成本；另外，副产物g-3’水解后变成g-2，可作为反应原料回收，实现降本增效，降低原料用量，在一定程度上提高了最终产物g-m的收率，并且进一步降低了制备成本。
[0022][0023]
[0024][0025]
。
[0026]
在本发明的一些实施例中，步骤（1）所述化合物g-1与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：1-1.5，优选为1：1.1-1.2。
[0027]
在其中一些实施例中，步骤（1）所述化合物g-1与碱的摩尔比为1：1-1.5，优选为1：1.1-1.2。
[0028]
在本发明的一些实施例中，步骤（1）所述碱为咪唑和/或吡啶。
[0029]
在本发明的一些实施例中，步骤（1）所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺和/或吡啶。
[0030]
在本发明的一些实施例中，步骤（1）所述反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为8h-16h。
[0031]
在本发明的一些实施例中，步骤（2）所述化合物g-2、二甲基亚砜、乙酸和乙酸酐的配比为1g：10ml-15ml：2ml-5ml：10ml-15ml。
[0032]
在本发明的一些实施例中，步骤（2）所述pummerer重排反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为8h-16h。
[0033]
在本发明的一些实施例中，步骤（3）所述碱以浓度为0.8mol/l-1.2mol/l的水溶液加入反应体系中。
[0034]
在本发明的一些实施例中，步骤（3）所述水解反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为1h-3h。
[0035]
在本发明的一些实施例中，步骤（3）包括：取化合物g-3用溶剂溶解，在0℃-5℃下加入含有所述碱的水溶液，在18℃-30℃温度下搅拌为1h-3h，得到化合物g-4。
[0036]
在本发明的一些实施例中，所述化合物g-3、溶剂和水溶液的配比为1g：6ml-10ml：4ml-6ml。
[0037]
在本发明的一些实施例中，步骤（3）所述溶剂为甲醇和/或乙醇。
[0038]
在本发明的一些实施例中，步骤（4）所述化合物g-4与异丁酰氯的摩尔比为1：1-1.5，优选为1：1.1-1.2。
[0039]
在本发明的一些实施例中，步骤（4）所述碱为吡啶。
[0040]
在本发明的一些实施例中，步骤（4）所述反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为1h-3h。
[0041]
在本发明的一些实施例中，步骤（4）包括：取化合物g-4用吡啶溶解，在0℃-5℃下滴加所述异丁酰氯，在18℃-30℃温度下搅拌为1h-3h，得到化合物g-m。
[0042]
在本发明的一些实施例中，步骤（4）所述化合物g-4和吡啶的配比为1g：8ml-12ml。
[0043]
以下为具体实施例。
[0044]
实施例1核苷酸中间体g-m的合成
[0045][0046][0047][0048]
步骤1：化合物g-2的合成
称取5g化合物g-1，用25mldmf溶解，之后加入1.1当量的咪唑和1.1当量的叔丁基二甲基氯硅烷，25℃搅拌12h，tlc检测，原料消耗完全。
[0049]
后处理：将反应液体倒入到200ml水中，有白色固体析出，抽滤、干燥后得到6.09g目标产物，收率85.3%。
[0050]
lrms(esi-)calc’d for c
16h27
n5o4si[(m-h)-]:380.51,found:380.38。
[0051]
步骤2：化合物g-3的合成称取6.09g化合物g-2，用80ml dmso溶解，之后加入20ml乙酸和80ml乙酸酐，25℃搅拌12h，tlc检测，原料消耗完全。
[0052]
后处理：将反应液体倒入到100ml冰水中，有白色固体析出，抽滤后得到粗品6.2g，粗品中包括产物g-3和副产物g-3’。
[0053]
lrms(esi-)calc’d for c
20h33
n5o5ssi[(m-h)-]:483.66,found:482.45；c
20h31
n5o6si[(m-h)-]:464.58,found:464.42。
[0054]
步骤3：化合物g-4的合成取上述粗品6.2g，用40ml甲醇溶解，之后在冰浴下加入25ml 1m 氢氧化钠水溶液，25℃搅拌2h，tlc检测，原料消耗完全。
[0055]
后处理：将反应液体中的甲醇通过减压蒸馏除去，用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水各洗一次，干燥浓缩得到粗品。
[0056]
纯化：取20g规格的硅胶柱，二氯甲烷溶解样品上样，用乙酸乙酯和正己烷体系洗脱，(ea:he=1:1 200ml)、(ea:he=2:1 500ml 该比例产物被洗脱)，浓缩后得到4.37g目标产物，两步收率62.0%。
[0057]
lrms(esi-)calc’d forc
18h31
n5o4ssi[(m-h)-]:440.62,found:440.38。
[0058]
lrms(esi-)calc’d for c
16h27
n5o4si[(m-h)-]:380.51,found:380.38。
[0059]
步骤4：化合物g-m的合成称取4.37g化合物g-4，用40ml吡啶溶解，冰浴下滴加1.1当量的异丁酰氯，25℃搅拌2h，tlc检测，原料消耗完全。
[0060]
后处理：将反应液体倒入到200ml冰水中，有白色固体析出，抽滤，将所得固体用100ml乙酸乙酯溶解，再用50ml饱和碳酸氢钠溶液洗3次、饱和氯化钠溶液洗一次，干燥浓缩得到4.4g目标化合物g-m，纯度为99.20%，收率87.8%。
[0061]
lrms(esi-)calc’d for c
22h37
n5o5ssi[(m-h)-]:510.71,found:510.38;
[0062]
对比例1核苷酸中间体g-m的合成
[0063][0064][0065][0066]
步骤1：化合物a2的合成称取5g化合物a1，用25ml 吡啶溶解，之后加入5当量的tmscl，25℃反应3小时，tlc检测，原料消耗完全。
[0067]
步骤2：化合物a3的合成将步骤1所得反应液置于冰浴中搅拌10分钟，用注射器量取1.2当量的异丁酰氯，滴加加入上述反应液中，冰浴反应2小时，tlc检测，原料消耗完全。
[0068]
步骤3：化合物a4的合成
量取10ml 浓度为25%的氨水加入步骤2所得反应液中，室温搅拌2h，tlc检测，原料消耗完全。
[0069]
后处理：将反应液缓慢倒入100ml乙酸乙酯中，析出固体，抽滤，干燥得到5g目标产物，三步收率：80.0%。
[0070]
lrms(esi-)calc’d for c
14h19
n5o5[(m-h)-]:336.34,found:336.28。
[0071]
步骤4：化合物a5的合成取5g化合物a4，用40ml dmf溶解，加入1.1当量咪唑和1.1当量叔丁基二甲基氯硅烷，25℃搅拌12小时，tlc检测，原料消耗完全。
[0072]
后处理：将反应液体倒入到200ml水中，有白色固体析出，抽滤、干燥后得到5.69g目标产物，收率85.1%。
[0073]
lrms(esi-)calc’d for c
20h33
n5o5si[(m-h)-]:450.60,found:450.38。
[0074]
步骤5：化合物g-m的合成称取5.69g化合物a5，用80ml dmso溶解，之后加入20ml乙酸和80ml乙酸酐，25℃搅拌12小时，tlc检测，发现原料消耗完全。
[0075]
后处理：将反应液体倒入到150ml冰水中，有白色固体析出，抽滤后得到所需的产物粗品。
[0076]
纯化：取80g规格的硅胶柱，二氯甲烷溶解样品上样，在乙酸乙酯和正己烷体系洗脱，(ea:he=1:3 500ml)、(ea:he=1:2 500ml)、(ea:he=1:1 1500ml 该比例产物被洗脱)，干燥浓缩后得到3.86g目标产物g-m，纯度95%，收率60.0%。
[0077]
lrms(esi-)calc’d for c
22h37
n5o5ssi[(m-h)-]:510.71,found:510.38;c
22h35
n5o6si[(m-h)-]:492.64,found:492.52。
[0078][0079]
对比例2核苷酸中间体g-m的合成步骤1：化合物g-2的合成同实施例1。
[0080]
步骤2：化合物g-3的合成同实施例1。
[0081]
步骤3：化合物g-4的合成取步骤2得到的粗品1g，用10ml甲醇溶解，加入10ml浓度为25%的氨水水解，25℃搅拌12h，tlc检测发现大量原料剩余。
[0082]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0083]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）化合物g-1在碱的作用下与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到化合物g-2；（2）化合物g-2、二甲基亚砜、乙酸和乙酸酐的混合体系进行pummerer重排反应，得到化合物g-3；（3）化合物g-3在碱的作用下进行水解反应，得到化合物g-4；（4）化合物g-4在碱的作用下与异丁酰氯反应，得到核苷酸中间体g-m；步骤（3）中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的一种或多种；其反应路线如下：其反应路线如下：其反应路线如下：。2.根据权利要求1所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（1）所述化合物g-1与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：1-1.5；和/或，步骤（1）所述化合物g-1与碱的摩尔比为1：1-1.5。3.根据权利要求1所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（1）所述碱为咪唑和/或吡啶；和/或，步骤（1）所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺和/或吡啶；和/或，步骤（1）所述反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为8h-16h。
4.根据权利要求1所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（2）所述化合物g-2、二甲基亚砜、乙酸和乙酸酐的配比为1g：10ml-15ml：2ml-5ml：10ml-15ml；和/或，步骤（2）所述pummerer重排反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为8h-16h。5.根据权利要求1所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（3）所述碱以浓度为0.8mol/l-1.2mol/l的水溶液加入反应体系中；和/或，步骤（3）所述水解反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为1h-3h。6.根据权利要求1-5任一项所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（3）包括：取化合物g-3用溶剂溶解，在0℃-5℃下加入含有所述碱的水溶液，在18℃-30℃温度下搅拌为1h-3h，得到化合物g-4。7.根据权利要求6所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，所述化合物g-3、溶剂和水溶液的配比为1g：6ml-10ml：4ml-6ml；和/或，步骤（3）所述溶剂为甲醇和/或乙醇。8.根据权利要求1-5任一项所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（4）所述化合物g-4与异丁酰氯的摩尔比为1：1-1.5；和/或，步骤（4）所述碱为吡啶；和/或，步骤（4）所述反应的温度为18℃-30℃，反应的时间为1h-3h。9.根据权利要求8所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（4）包括：取化合物g-4用吡啶溶解，在0℃-5℃下滴加所述异丁酰氯，在18℃-30℃温度下搅拌为1h-3h，得到化合物g-m。10.根据权利要求9所述的合成核苷酸中间体的方法，其特征在于，步骤（4）所述化合物g-4和吡啶的配比为1g：8ml-12ml。

技术总结
本发明公开了一种反应步骤简单、后处理纯化简便，更容易得到高纯度核苷酸中间体G-M的新合成方法，其包括如下步骤：（1）化合物G-1在碱的作用下与叔丁基二甲基氯硅烷反应，得到化合物G-2；（2）化合物G-2、二甲基亚砜、乙酸和乙酸酐的混合体系进行Pummerer重排反应，得到化合物G-3；（3）化合物G-3在碱的作用下进行水解反应，得到化合物G-4；（4）化合物G-4在碱的作用下与异丁酰氯反应，得到核苷酸中间体G-M；步骤（3）中所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾；其反应路线如下。路线如下。路线如下。路线如下。路线如下。


技术研发人员：邱鑫 陈德遐 刘二凯 王谷丰 赵陆洋
受保护的技术使用者：深圳赛陆医疗科技有限公司
技术研发日：2023.09.01
技术公布日：2023/10/11