一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白VP5来源的抗原及其应用

一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5来源的抗原及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫化学和分子生物学技术领域，具体涉及一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5来源的抗原及其应用。


背景技术：

2.伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)是导致仔猪高死亡率、成年猪生长迟缓和母猪繁殖障碍的一种高度接触性传染性病原，严重危害生猪养殖并造成了巨大的经济损失。prv还能感染牛、羊、犬、猫、狐狸、兔子等脊椎动物，近几年发现了多起猪场或屠宰场工作人员感染prv的病例，说明prv存在跨物种传播风险。
3.prv又称为猪疱疹病毒1型(suid herpesvirus 1，suhv-1)，属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属成员。prv为线性双链dna病毒，其基因组约143kb、(g+c)mol％含量高达73％，可编码70～100种蛋白。成熟病毒粒子直径为150nm～180nm，由基因组、衣壳、被膜和囊膜构成。
4.prv的衣壳为t＝16、直径约125nm的二十面体，由150个六邻体和12个五邻体壳粒排列组成，其中vp5(pul19)是其主要衣壳蛋白，其序列在所有疱疹病毒中高度保守。在侵染细胞的过程中，衣壳与动力蛋白相互作用，沿着微管从细胞外周向细胞核运行，并通过核孔将基因组释放入核，在保护病毒基因组及核靶向运输过程中发挥重要作用([1]granzow h，weiland f，jons a，et al.ultrastructural analysis of the replication cycle of pseudorabies virus in cell culture：a reassessment.journal of virology，1997，71(3)：2072-2082.[2]granzow h，klupp b g，mettenleiter t c.entry of pseudorabies virus：an immunogold-labeling study.journal of virology，2005，79(5)：3200-3205.[3]laval k，enquist l w.the neuropathic itch caused by pseudorabies virus.pathogens，2020，9(4).)。开展vp5结构和功能的研究有助于深入了解病毒感染机制。


技术实现要素：

[0005]
基于此，本发明提供了一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5来源的抗原及其应用。申请人采用抗原表位预测和原核表达目的蛋白两种策略制备免疫原，比较两种策略所得兔多克隆抗体的特性，探究出一种成功率高、特异性好的抗体制备方法，为vp5等病毒相关蛋白的分子生物学研究提供了工具。
[0006]
本发明的具体技术方案如下：
[0007]
本发明提供了一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5来源的抗原，包含以下任意一种：
[0008]
(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽；
[0009]
(2)氨基酸序列如seq id no.4所示的蛋白分子。
[0010]
本发明还提供了编码所述抗原的核酸分子。
[0011]
本发明又提供了所述的抗原在制备伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体中的应用。
[0012]
其中，所述伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体为多克隆抗体。
[0013]
本发明又提供了一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体的制备方法，将所述的抗原对非人动物进行免疫获得。
[0014]
其中，所述伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体为多克隆抗体。
[0015]
当制备伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5多克隆抗体时，将所述的抗原与弗氏佐剂进行乳化，采用背部皮内多点注射免疫非人动物，首次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂；免疫剂量为0.3mg～0.5mg/只，共免疫三次，免疫后，采血并分离收集血清。免疫三次后第7天进行采血。
[0016]
所述非人动物为兔、大鼠、小鼠、鸡或山羊。
[0017]
本发明根据vp5蛋白抗原表位预测结果，得到vp5-1多肽(氨基酸序列如seq id no.1所示)，为vp5蛋白氨基酸第1255-1275个氨基酸序列。vp5蛋白c端375个氨基酸序列(vp5-c375)(氨基酸序列如seq id no.4所示)和klh偶联vp5-1免疫兔后获得的血清抗体与prv感染的样品具有优良的反应性。然而，vp5-c375对应抗体在检测prv感染样品时存在较高的非特异性，应为vp5-c375蛋白序列较长，抗原决定簇多，制备得到的多抗，其识别的抗原表位多，容易与宿主或病毒自身其他蛋白发生非特异性结合。而vp5-1暴露在蛋白表面，其ifa反应性优良，wb检测特异性强，非特异性反应弱，说明抗原表位相对单一，且其抗原决定簇对应的抗体能同时适用于wb和ifa。
[0018]
本发明的有益效果：
[0019]
本发明提供了免疫原并高效地制备了vp5抗体，得到同时满足ifa和wb实验需求，特异性反应强而非特异性反应弱的抗体，制备获得的抗体可作为prv内参抗体，亦为vp5功能研究提供了工具。
附图说明
[0020]
图1为vp5全长蛋白的抗原性预测图。
[0021]
图2为vp5蛋白c端375aa的抗原性预测。
[0022]
图3为vp5-1、vp5-2和vp5-3序列在蛋白三维结构中的空间位置情况。
[0023]
图4为原核表达质粒pet-28a-vp5-c375酶切鉴定图，其中，m：dna分子质量标准；1：pet-28a-vp5-c375双酶切产物。
[0024]
图5为vp5-c375蛋白的原核表达、纯化和鉴定；其中，a为考马斯亮蓝染色，b为wb验证结果；m：蛋白质分子质量标准；1：his-vp5-c375菌液诱导前样品；2：his-vp5-c375菌液诱导后样品；3：buffer a洗脱蛋白样品；4：buffer b洗脱蛋白样品；5：buffer c洗脱蛋白样品；6：buffer d洗脱蛋白样品。
[0025]
图6为不同vp5多抗血清的elisa效价检测结果。
[0026]
图7为prv vp5兔多抗ifa反应性鉴定及效价检测结果。
[0027]
图8为prv vp5兔多抗wb反应性鉴定结果；m：蛋白质分子质量标准；mock：没有用病毒感染组；pk-15细胞样品或prv hd/c株感染细胞样品分别与klh-vp5-1(a)、klh-vp5-2(b)、klh-vp5-3(c)、his-vp5-c375(d)多抗血清反应。
c375经10g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行割胶回收，送杭州擎科生物技术有限公司进行测序。
[0040]
3、质粒构建
[0041]
将pet-28a(+)载体和目的片段vp5-c375分别经ecor i和xho i酶切后，用t4 dna连接酶进行连接。连接产物转化至dh5α感受态细胞，并均匀涂布在含卡那霉素的lb平板上。37℃培养12h～16h后，挑取多个单菌落，分别置于含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养2h后，取2μl菌液进行pcr鉴定，阳性菌液送测。将测序结果与预期序列一致的菌液进行扩培，抽提质粒，命名为pet-28a-vp5-c375。
[0042]
结果表明，以prv hd/c基因组为模板，利用特异性引物将vp5第2866bp～3993bp基因进行扩增(图4)，并将其构建至pet-28a(+)载体，成功构建pet-28a-vp5-c375原核表达质粒。
[0043]
4、vp5-c375原核诱导表达与纯化
[0044]
将pet-28a-vp5-c375转化至bl21(de3)感受态细胞，菌液接种于含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养，当od
600nm
值在0.5左右时加入终浓度为1mmol/l的iptg进行诱导表达，37℃振荡培养4h后离心收集细菌。在变性条件下纯化蛋白：对诱导后菌液进行超声裂解后，与ni-nta于4℃摇床结合4h；依次用buffer a(0.1mol/l nah2po4·
2h2o、0.01mol/l tris-hcl、8mol/l尿素、20mmol/l咪唑，ph＝8.0)、buffer b(0.1mol/l nah2po4·
2h2o、0.01mol/l tris-hcl、8mol/l尿素、20mmol/l咪唑，ph＝6.3)、buffer c(0.1mol/l nah2po4·
2h2o、0.01mol/l tris-hcl、8mol/l尿素，ph＝5.9)洗去非特异性蛋白，最后用buffer d(0.1mol/l nah2po4·
2h2o、0.01mol/l tris-hcl、8mol/l尿素，ph＝4.5)洗脱并收集目的蛋白。取诱导前、后菌液以及洗脱蛋白进行sds-page后分别通过考马斯亮蓝染色和wb实验验证蛋白表达情况。
[0045]
向转化pet-28a-vp5-c375质粒的菌液中加入终浓度为1mmol/l的iptg进行蛋白诱导，对诱导前后细菌样品进行sds-page，通过考马斯亮蓝染色和使用his抗体对蛋白表达情况进行验证。结果显示，与对照组相比，加入iptg后，诱导组在预期分子质量处存在差异性蛋白条带，表明成功诱导vp5-c375蛋白表达(图5a)。利用ni-nta对vp5-c375蛋白进行纯化后，用融合蛋白的标签抗体(his抗体)进行wb检测，在buffer d洗脱样品中检测到约42ku预期分子质量条带，说明纯化得到预期的vp5-c375蛋白(图5b)。
[0046]
实施例2
[0047]
1、多抗的制备
[0048]
将实施例1中原核表达获得的0.5mg/ml vp5-c375蛋白或与5mg/ml klh偶联的表位多肽溶液与弗氏佐剂进行乳化，首次免疫用弗氏完全佐剂，两周后加强免疫时使用弗氏不完全佐剂；采用背部皮内多点注射法免疫新西兰大白兔，每次免疫剂量0.25mg/kg体重，每两周免疫一次，共免疫三次。三免后第7天耳缘静脉注射15ml～25ml生理盐水配制的200g/l乌来糖溶液以麻醉兔子，手术分离颈动脉，动脉插管进行采血，血样于37℃放置30min后，4℃静置过夜，4℃ 3000r/min离心5min，收集上层血清。
[0049]
2、多抗elisa效价检测
[0050]
将纯化的vp5-c375蛋白样品用抗原包被液稀释至2μg/ml，以100μl/孔加入elisa酶标板内，4℃包被过夜；弃孔内液体，pbst洗5遍，50g/l脱脂奶37℃封闭1h；弃孔内液体，
pbst洗5遍，将多抗血清用50g/l脱脂奶进行二倍比稀释，即1∶200～1∶409600，100μl/孔，37℃孵育2h；弃孔内液体，pbst洗5遍，加入1：5000稀释的hrp羊抗兔二抗，37℃孵育1h；弃孔内液体，pbst洗5遍，加入tmb显色，100μl/孔，37℃避光反应15min后，每孔加入50μl终止液，立即进行od
450nm
值的读取；计算阳性血清与阴性血清od
450nm
的比值(p/n)，当p/n≥2.1时判定为阳性，将阳性结果对应的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。
[0051]
采用间接elisa方法对三免后的兔多抗血清进行效价测定，结果发现四种多抗的elisa效价各不相同，其中vp5-c375的血清抗体效价最高，不低于1∶409600，推测是由于vp5-c375序列较长，抗原决定簇较多，因此抗体效价也最高；其次为klh-vp5-1的血清抗体，其效价可达1∶204800；klh-vp5-2和klh-vp5-3的血清抗体效价分别为1∶25600和1∶12800(图6)。
[0052]
整体而言，与以蛋白为抗原制备的抗体效价相比，抗原表位多肽制备的抗体效价要低一些，这与抗原决定簇的数量有直接关系。klh-vp5-1制备的抗体效价远超另外两个抗原表位多肽制备的抗体，表明该多肽是一个较为理想的抗原决定簇，能有效刺激机体产生免疫应答。
[0053]
3、多抗ifa反应性鉴定
[0054]
将prv hd/c以moi＝1感染pk-15细胞，24h后弃培养上清，每孔加入100μl v(甲醇)∶v(丙酮)＝1∶1固定液，-20℃固定20min，弃去固定液；每孔加100μl 50g/l脱脂奶，室温封闭1h；弃封闭液，用50g/l脱脂奶按1∶200～1∶6400稀释多抗，每孔加100μl，37℃孵育2h，pbst洗3遍；避光，每孔加100μl 50g/l脱脂奶稀释的fitc羊抗兔抗体(1∶500稀释)，37℃孵育30min，pbst洗3遍；荧光显微镜观察实验结果。
[0055]
将兔多抗血清按二倍比稀释后分别与prv hd/c株感染的细胞样品进行孵育，对各多抗的ifa反应性进行鉴定，结果发现vp5-c375的血清抗体与prv感染样品有较强的反应性，其ifa效价可达1∶3200；其次为klh-vp5-1抗体，其ifa反应效价可达1∶800，当1∶200稀释时可以获得理想的荧光信号；klh-vp5-2、klh-vp5-3抗体在1∶200的稀释倍数下与prv的反应性仍然较弱(图7)。上述结果表明，虽然这四种抗体的wb反应性和效价均较好，但只有vp5-c375和klh-vp5-1抗体具有较好的ifa反应性，说明klh-vp5-1对应的多肽不仅位于蛋白表面(图3)，而且还是vp5蛋白的抗原决定簇。
[0056]
4、多抗wb反应性鉴定
[0057]
将prv hd/c以moi＝1感染pk-15细胞，24h后收集细胞样品，加入120μl细胞裂解液(50g/l sds+10ml/l tritonx-100)，吹打混匀后再加入40μl 4
×
loading buffer，混匀后100℃处理样品15min。将蛋白样品于4℃ 12000r/min离心10min，取10μl上样用于sds-page；半干法25v 1.2ma/cm2转0.45μm硝酸纤维素膜30min；50g/l脱脂奶室温封闭1h；将兔多抗血清以1∶5000体积进行稀释，于4℃孵育5h；pbst洗膜3次；用hrp羊抗兔二抗(1∶5000稀释)室温孵育1h；pbst洗膜3次；加ecl反应液显色并观察结果。
[0058]
将兔多抗血清按1∶5000稀释后分别与prv hd/c株感染的细胞样品或未感染的pk-15细胞样品反应，wb检测结果发现klh-vp5-1、klh-vp5-2、klh-vp5-3、vp5-c375血清抗体均与prv感染样品有较好的反应性(图8)，进一步表明klh-vp5-1和vp5-c375的抗体在prv感染样品的检测中具有良好的wb反应性。
[0059]
作为α疱疹病毒亚科成员，prv具有广泛的宿主谱，能感染多种脊椎动物。prv可侵
入被感染部位的外周神经，并借助衣壳沿神经元轴突逆行至中枢神经系统，导致宿主产生严重的神经症状甚至死亡。因此，对病毒衣壳结构和功能的研究有助于了解病毒感染细胞的机制。本研究以prv主要衣壳蛋白vp5为目标抗原进行了抗体制备，利用两种策略制备了免疫原，并获得了可用于ifa和wb的兔多克隆抗体。
[0060]
由于多抗能够识别抗原的多个表位，存在非特异性强的风险，为此，本研究采用抗原表位多肽法来制备多抗，其优势在于：若抗原表位预测准确，制备抗体的特异性等同于单克隆抗体，但其制备周期短，试验难度低。本研究选择vp5蛋白c端的375个氨基酸为目标抗原，根据抗原表位预测结果，兼顾不同抗原表位在冷冻电镜三维结构的具体空间位置，共预测得到3个抗原表位多肽序列。
[0061]
制备的血清抗体效价不逊于商品化抗体，如vp5-c375血清抗体的效价在ifa、wb和间接elisa实验中分别达到1∶3200、1∶5000和1∶409600，优于常规商品化抗体。就抗体效价层面而言，ifa、wb和间接elisa实验中各抗体效价的规律性基本一致，其效价由高到低依次为vp5-c375、klh-vp5-1、klh-vp5-2、klh-vp5-3。这四种抗体的elisa抗体效价虽然高，wb反应性也良好，但仅vp5-c375和klh-vp5-1的血清抗体与prv感染的样品具有较强的反应性，推测原因应为vp5-c375对应的蛋白序列较长，抗原决定簇多，囊括多个空间表位。klh-vp5-1暴露在蛋白表面的比例最高，其与ifa反应性相对最好，而其余2个多肽序列则可能因为表面可及性较差或空间抗原表位预测不佳而影响ifa的反应性。此外，vp5-c375对应抗体在检测病毒感染样品时存在较高的非特异性，可能是由于抗原决定簇多，有些抗原决定簇和宿主蛋白相同或类似，从而导致非特异性的产生。而klh-vp5-1因为抗原表位单一，非特异性弱，表明基于空间构象的抗原表位法是一种成功率高、特异性好的抗体制备方法。
[0062]
综上，本研究采用两种免疫原制备策略并高效地制备了vp5抗体，筛选到同时满足ifa和wb实验需求及非特异性弱的抗体，制备获得的抗体可作为prv内参抗体，亦为vp5功能研究提供了工具。这种基于空间构象的抗原表位法可用于抗体的高效制备，为蛋白的功能研究提供良好的工具。

技术特征：
1.一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5来源的抗原，其特征在于，包含以下任意一种：(1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽；(2)氨基酸序列如seq id no.4所示的蛋白分子。2.编码如权利要求1所述抗原的核酸分子。3.如权利要求1所述的抗原在制备伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体为多克隆抗体。5.一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的抗原对非人动物进行免疫获得。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5抗体为多克隆抗体。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，当制备伪狂犬病病毒衣壳蛋白vp5多克隆抗体时，将权利要求1所述的抗原与弗氏佐剂进行乳化，采用背部皮内多点注射免疫非人动物，首次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂；免疫剂量为0.3mg～0.5mg/只，共免疫三次，免疫后，采血并分离收集血清。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，免疫三次后第7天进行采血。9.如权利要求5～8任一所述的制备方法，其特征在于，所述非人动物为兔、大鼠、小鼠、鸡或山羊。

技术总结
本发明公开了一种伪狂犬病病毒衣壳蛋白VP5来源的抗原及其应用，涉及免疫化学和分子生物学技术领域。本发明提供了免疫原并高效地制备了VP5抗体，得到同时满足IFA和WB实验需求、特异性强而非特异性弱的抗体，制备获得的抗体可作为PRV内参抗体，亦为VP5功能研究提供了工具。了工具。了工具。


技术研发人员：颜焰 董伟仁 周继勇 顾金燕 金玉兰 彭曦冉
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/10/11