一株新根瘤菌（Neorhizobiumsp.）及其应用

一株新根瘤菌(neorhizobium sp.)及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株新根瘤菌(neorhizobium sp.)及其应用。


背景技术：

2.植物的健康生长离不开土壤提供的多种营养元素，其中氮元素是必需的营养元素之一，它在蛋白质、核酸已经其它各类营养元素的合成以及植物的生长和健康中起关键的作用。为贫瘠土壤施用化学氮肥可以有效补充氮营养元素，以改善土壤营养结构，促进植物生长速率以及增加作物产量，但是过量施用化肥也会带来土壤板结，养分失调，酸化加剧，有益微生物活性降低等一系列的问题。化解这些危机的有效方法之一就是广泛地种植豆科牧草作为绿肥作物。豆科植物与根瘤菌科的固氮细菌形成具有高效固氮功能的根瘤或茎瘤，可以将大气中的氮气固定转变为可被植物直接利用的铵态氮，部分铵态氮还可以从根瘤或茎瘤中析出进入土壤。
3.豆科植物田菁(sesbania herbacea)是我国田野间常见的优良夏季绿肥作物，植株养分含量丰富，可以适应温暖、湿润的环境，同时耐盐、耐涝、耐瘠、耐旱、抵抗病虫及风的能力强，在土壤含盐量0.3％的盐土上或ph值9.5的碱地上都能生长。田菁内生固氮根瘤菌种群多样性非常有限，文献报道主要为华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)。华特拉新根瘤菌与田菁的根或者茎结瘤产生根瘤或者茎瘤共生体，对田菁的生长起到了至关重要的作用。但是现有报道的田菁内生固氮菌在培养基上只能耐1.0％的nacl，并且尚无该菌株对其它植物的促生功能报道。


技术实现要素：

4.发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株能够耐盐且具有植物促生能力的新根瘤菌(neorhizobium sp.)，经过进一步鉴定，该菌株为华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)。
5.本发明还要解决的技术问题是提供了华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)制备得到的发酵液或其无菌上清或其制剂。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)、发酵液和/或其无菌上清和/或其制剂在植物固氮或在有机磷或无机磷降解中的应用。
7.本发明还要解决的技术问题是提供了华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)、发酵液和/或其无菌上清和/或其制剂在植物耐盐中的应用。
8.本发明最后要解决的技术问题是提供了华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)、发酵液和/或其无菌上清和/或其制剂在植物促生中的应用。
9.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21，所述新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21于2022年8月1日保藏
于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.25336。
10.本发明内容还包括含有所述的新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂。
11.本发明内容还包括所述的新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21或所述的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂在植物固氮或在有机磷或无机磷降解中的应用。
12.本发明内容还包括所述的新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21或所述的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂在植物耐盐中的应用。
13.其中，所述应用包括将所述的新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21在含有0～2％的nacl的培养基中生长。
14.其中，所述培养基为r2a培养基或yma培养基。
15.其中，所述r2a培养基包括r2a固体培养基和r2a液体培养基，所述r2a固体培养基包括胰蛋白胨0.25g、酸水解酪蛋白0.5g、酵母浸粉0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.1g、丙酮酸钠0.3g、蛋白胨0.25g、葡萄糖0.5g、琼脂15.0g，所述r2a液体培养基去除r2a固体培养基中的琼脂，其余成分相同。
16.其中，所述yma培养基包括yma固体培养基和yma液体培养基，所述yma固体培养基包括磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，甘露醇10.0g，酵母提取物1.0g，刚果红0.025g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，所述yma液体培养基去除yma固体培养基中的琼脂，其余成分相同。
17.本发明内容还包括所述的新根瘤菌(neorhizobium sp.)cnbg-pgpr-21或所述的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂在植物促生中的应用。
18.其中，所述植物包括但不仅限于大豆。
19.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)cnbg-pgpr-21 cgmcc no.25336生长快，稳定性好，可以在含2.0％nacl的根瘤菌培养基yma上生长传代，显示其独特的耐盐固氮能力。本发明的华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在6d内可降解无机磷平板培养基上的磷元素，在有机磷的降解方面，华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可在只含有卵磷脂作为磷源的固体培养基上正常生长。本发明的华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以显著增进大豆幼苗地上部分鲜重75.0％。同时华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21菌液还可以提高平均株长7.5％，提高植株地下部分鲜重13.8％。
附图说明
20.图1为华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在平板上的菌落形态；
21.图2为华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21细胞形态；
22.图3为华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在系统进化树上的位置；
23.图4为华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在含2％nacl yma固体培养基上生长；
24.图5为华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21对大豆幼苗促生实验结果。
具体实施方式
25.下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
26.实施例1华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21的分离、鉴定
27.(1)样品稀释与涂布
28.取江苏连云港连云新城临洪河口(北纬34
°
45’，东经119
°
13’)滩涂上采集的田菁样品一株，取根部，先在流水中清洗干净表面土壤，然后于无菌生理盐水中震荡清洗约30min。将根逐步移至50％、70％、90％、100％梯度酒精中振荡清洗各15分钟，将根部置于无菌培养皿中，放置于无菌超净工作台内待酒精充分挥发，取根部中段，剪至0.3-0.5cm长度若干段，将处理好的根放置于50ml离心管内，加入适量生理盐水及少量直径0.5cm锆石珠，放置于核酸提取仪(mp fastprep-24)内，最高频45s振荡一次，上清中吸取100μl，涂布于r2a固体培养基平板(r2a培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，琼脂15.0g，ph值7.2
±
0.2(25℃)，121℃高压灭菌20min。
29.)上，将上清稀释10倍后再平行制备1份，平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养至少24h，定时观察，直至菌落出现。
30.(2)菌株分离与纯化
31.将同一样品下所有长出菌落的平板取出，选出单菌落明显且数量适中的稀释度平板，将平板上形态不一样的菌落挑至新的r2a平板上，并进行分区纯化，重复纯化直至单菌落出现，后再重复划线培养至少5次。
32.(3)染色与保藏
33.挑取待检测菌株的菌落于载玻片中央区域，经过草酸铵-结晶紫染液初染、碘液媒染、75％乙醇脱色、番红复染四个步骤后，显微镜镜检观察，记录染色结果；将完成纯化和染色的单菌落从r2a固体培养基平板上挑至无菌r2a液体培养基中，200r/m、30℃下培养24
±
2h，震荡摇匀后，将60％无菌甘油∶菌液按v∶v＝1∶1进行混合，分装于无菌保菌管中，标记并置于-80℃冰箱中保藏。
34.(4)菌株鉴定
35.将含有对应编号菌株的平板从4℃冰箱中取出，挑取单菌落为dna模板，进行pcr扩增和16s rdna测序与序列比对，具体操作如下：
36.1)扩增体系50μl：
37.50μl体系有以下五部分组成：taq酶mix(25μl)、上游引物27f(1μl)、下游引物1492r(1μl)、dna模板(1μl)、ddh2o(22μl)。其中27f序列为：5
’‑
agagtt tga tcm tgg ctc ag-3’，1492r序列为：5
’‑
ggy tac ctt gtt acg act t-3’。扩增出的片段长度约为1413bp，扩增出的核苷酸序列见序列表seq id no.1所示。
38.2)扩增条件
39.预变性温度：94℃
40.第一步变性：94℃30s
41.第二步退火：56℃60s
42.第三步延伸：72℃45s
43.循环次数：30次
44.第四步最后延伸：72℃10min
45.第五步保存：4℃
46.3)琼脂糖凝胶电泳
47.称取1g琼脂糖溶解于100ml tbe电泳缓冲液，微波加热至溶液澄清透明，加入1
‰
的gelred核酸染料，摇晃均匀，静置至无气泡，缓慢倒入胶板，静置1h左右，取出凝固的胶块置于电泳槽中，在每个胶孔中加入4μl pcr扩增产物，120v 20min跑胶，取出胶块置于凝胶成像仪中，选择uv光照并拍照，记录胶块上1500bp处条带清晰的对应样品编号，将该样品的剩余pcr扩增产物置于4℃冰箱。
48.4)pcr产物纯化
49.将4℃冰箱中贮藏的pcr扩增产物取出，使用axyprep
tm pcr cleanup kit核酸纯化试剂盒纯化pcr产物得到纯化后的dna。
50.5)序列鉴定
51.将上述步骤得到的重悬dna，送至南京擎科生物科技有限公司测序，将测序结果与national center for biotechnology information(ncbi)genebank数据库比对，结果显示本发明提供的菌株为华特拉新根瘤菌(neorhizobium huautlense)。该菌株已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，该菌株的保藏编号为：cgmcc no.25336。
52.华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21 cgmcc no.25336为好氧菌，革兰氏阴性，不形成孢子。参见图1，菌落1-2天内在平板培养基表面形成，菌落较小，圆形，整体呈凸透镜状，奶白色，表面光滑半透明，粘液状。参见图2，于显微镜油镜下观察到的cnbg-pgpr-21的菌体呈长杆状，长度为1-3μm、宽度为0.3-1μm。在含2％nacl yma固体培养基培养若干天后菌落颜色呈淡粉色。华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在系统进化树上的位置参见图3。
53.实施例2华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在ashby无氮培养基上的生长情况
54.1)ashby无氮固体培养基(中国农业菌种目录，2001)：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌20min。ashby无氮液体培养基去除琼脂，其余成分相同。
55.2)划板培养：从鉴定正确的菌株平板上挑取单菌落，接种在ashby无氮固体培养基上，30℃恒温静置培养48h，观察平板上的生长状况。将菌落至少传代三次，并可以在液体培养基中也能正常培养，才能确定其固氮能力。
56.3)结果总结：华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以在ashby无氮固体及液体培养基上快速生长，证明其具有较强的固氮能力。从平板上挑取单菌落，接种至5ml ashby无氮液体培养基，30℃120rpm/min振荡培养72h，镜检计数确认菌液中细胞数可达1.0
×
108/ml。
57.实施例3华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21在根瘤菌培养基yma上的生长情况
58.1)yma根瘤菌固体培养基：磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，甘露醇10.0g，酵母提取物1.0g，刚果红0.025g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0
±
0.2(25℃)，121℃高压灭菌20min。yma根瘤菌液体培养基去除琼脂，其余成分相同。
59.2)划板培养：从鉴定正确的菌株平板上挑取单菌落，接种在yma无氮固体培养基上，30℃恒温静置培养48h，观察平板上的生长状况。将菌落至少传代三次，才能确定其固氮能力。
60.3)结果总结：华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以在yma无氮固体及液体培养基上
生长。
61.实施例4华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21的耐盐生长实验
62.1)r2a培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，琼脂15.0g，ph值7.2
±
0.2(25℃)，121℃高压灭菌20min。r2a液体培养基去除琼脂，其余成分相同。
63.2)液体培养基准备：分别配制含0％、1％、3％、4％、6％、8％nacl的r2a液体培养基，高温灭菌处理备用。
64.固体培养基准备：分别配制含0％、1％、3％、5％nacl的r2a和yma固体培养基，高温灭菌处理备用。
65.2)菌种活化：从4℃冰箱取出生长有所需菌株的培养基平板，无菌操作用接种环蘸取板子上单菌落到装有5ml r2a或yma液体培养基的离心管中，30℃条件下过夜培养。
66.3)耐盐度实验：
67.液体培养基：将过夜培养好的华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21菌液(菌液浓度大约5
×
108cfu/ml)按5％的接种量分别接种到5ml的分别含0％、1％、3％、4％、6％、8％nacl的r2a液体培养基中，30℃条件下震荡培养。之后分别在培养16h和23h观察测定每株菌不同梯度菌株的生长情况。
68.固体培养基：将活化的菌划板培养至含1％、2％、3％、5％nacl的r2a和yma固体培养基平板表面。30℃条件下过夜培养。
69.4)结果总结：
70.华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以在含1％naclr2a液体培养基内正常生长，无法在高于1％nacl盐度的r2a液体培养基内正常生长。
71.华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以在含1％naclr2a固体培养基内正常生长，无法在高于1％nacl盐度的r2a固体培养基内正常生长。
72.华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以在含2％nacl yma固体培养基上正常生长，无法在高于2％nacl盐度的yma固体培养基上正常生长。参见图4，在2％nacl的yma固体培养基上培养约1个月后，菌落颜色由乳白色转呈淡粉色。
73.实施例5华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21的无机磷降解能力
74.1)培养基的配置
75.分别配置无机磷固体培养基平板和无机磷液体培养基，其中无机磷固体培养基成分为葡萄糖10g，磷酸三钙5g，碳酸钙0.1g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸钙0.1g，氯化高铁0.005g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌20min。无机磷液体培养基去除琼脂成分，其余组分同无机磷固体培养基(注：碳酸钙需单独灭菌添加后倒平板)。
76.2)无机磷降解能力的定性实验
77.取出菌株cnbg-pgpr-21冻存在-80℃冰箱中的保菌管，冰上解冻至流体状，震荡混匀，用接种环挑取适量菌液于营养琼脂nutrient agar(na)固体培养基平板上上进行三区划线，将平板置于30℃下恒温培养24
±
2h。na培养基配方如下(每升)：10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，5.0g氯化钠，15.0g琼脂，ph值7.3
±
0.1。挑取单菌落纯化1-2次并作鉴定确认，确认无误后挑取单菌落至无机磷固体培养基平板上，将平板置于30℃下恒温培养1-9d，观察菌落周围是否出现解磷圈。
78.经实验可知，菌株cnbg-pgpr-21在无机磷固体培养基上生长较好，至6d时，即可出现解磷圈。
79.实施例6华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21的有机磷降解能力
80.1)培养基的配置
81.分别配置有机磷固体培养基平板和有机磷液体培养基，其中有机磷固体培养基成分为葡萄糖10g，卵磷脂5g，碳酸钙5g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸钙0.1g，氯化高铁0.005g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌20min。有机磷液体培养基去除琼脂成分，其余组分同有机磷固体培养基(注：碳酸钙需单独灭菌添加)。
82.2)有机磷降解能力的定性
83.取出菌株cnbg-pgpr-21冻存在-80℃冰箱中的保菌管，冰上解冻至流体状，震荡混匀，用接种环挑取适量菌液于na固体平板上进行三区划线，将平板置于30℃下恒温培养24
±
2h，挑取单菌落纯化1-2次并作鉴定确认，确认无误后挑取单菌落至有机磷固体平板上，将平板置于30℃下恒温培养1-9d，观察菌落周围是否出现解磷圈。
84.经实验可知，菌株cnbg-pgpr-21在有机磷固体平板上生长较好。
85.实施例7华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21促进大豆幼苗生长实验
86.1)发酵液制备：将本发明华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21接种到灭菌后的yma培养液中，在30℃、200r/min条件下，培养24小时，得到发酵液，将菌液稀释至浓度5
×
106cfu/ml备用，同时设置无菌水作为对照。
87.2)实验设计：大豆品种选用黑交00-1152，来自于南京农业大学。设置菌液处理组和对照组，每个处理设置8-9株重复，每株幼苗采用灌根方式进行浇菌50ml处理，在幼苗生长至两叶一心时期进行浇菌处理。两周后测定苗期生长发育指标，包括株高、根长、地上部/地下部鲜重。
88.实验结果：如图5所示，本发明华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21可以显著增进大豆幼苗地上部分鲜重75.0％。同时华特拉新根瘤菌cnbg-pgpr-21菌液还可以提高平均株长7.5％，提高植株地下部分鲜重13.8％，菌株对大豆幼苗根长无显著提升作用，但是可以观测到对植株侧根的丰度有一定的促进作用。

技术特征：
1.一株新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21，其特征在于，所述新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21于2022年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no. 25336。2.含有权利要求1所述的新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂。3.权利要求1所述的新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21 或权利要求2所述的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂在植物固氮或在有机磷或无机磷降解中的应用。4.权利要求1所述的新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21 或权利要求2所述的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂在植物耐盐中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1所述的新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21在含有0~2%的nacl的培养基中生长。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述培养基为r2a培养基或yma培养基。7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述r2a培养基包括r2a固体培养基和r2a液体培养基，所述r2a固体培养基包括胰蛋白胨0.25 g、酸水解酪蛋白0.5 g、酵母浸粉0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、磷酸氢二钾0.3 g、硫酸镁0.1 g、丙酮酸钠0.3 g、蛋白胨0.25 g、葡萄糖0.5 g、琼脂15.0 g，所述r2a液体培养基去除r2a固体培养基中的琼脂，其余成分相同。8.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述yma培养基包括yma固体培养基和yma液体培养基，所述yma固体培养基包括磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.1 g，甘露醇10.0 g，酵母提取物1.0 g，刚果红0.025 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 ml，所述yma液体培养基去除yma固体培养基中的琼脂，其余成分相同。9.权利要求1所述的新根瘤菌（neorhizobium sp.）cnbg-pgpr-21 或权利要求2所述的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂在植物促生中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括大豆。

技术总结
本发明公开了一株新根瘤菌及其应用，所述新根瘤菌CNBG-PGPR-21于2022年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.25336。本发明菌株CGMCC No.25336生长快，稳定性好，可以在含2.0%NaCl的根瘤菌培养基YMA上生长传代，显示其独特的耐盐固氮能力，在6 d内可降解无机磷平板培养基上的磷元素，在有机磷的降解方面，其可在只含有卵磷脂作为磷源的固体培养基上正常生长，也可以显著增进大豆幼苗地上部分鲜重75.0%，同时该菌株的菌液还可以提高平均株长7.5%，提高植株地下部分鲜重13.8%。提高植株地下部分鲜重13.8%。提高植株地下部分鲜重13.8%。


技术研发人员：于金平 吕世鹏 周冬琴 贾明云 李琦 侯炤琪 刘壮壮
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/10/11