一株葡萄酒有孢汉逊酵母G2、包含葡萄酒有孢汉逊酵母G2的发酵菌剂及应用

一株葡萄酒有孢汉逊酵母g2、包含葡萄酒有孢汉逊酵母g2的发酵菌剂及应用
技术领域
1.本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一株葡萄酒有孢汉逊酵母g2、包含葡萄酒有孢汉逊酵母g2的发酵菌剂及应用。


背景技术：

2.葡萄酒是世界上仅次于啤酒的第二大酒精饮料，在世界区域经济和国际贸易中占有重要地位。在葡萄酒工业化生产中，通常使用选定的商业酵母菌进行发酵，以确保发酵过程的可控性和一致性。然而，商业酵母菌的广泛应用可能会降低葡萄酒的风味复杂性和典型性，并导致葡萄酒产品的同质化。随着葡萄酒行业的发展，消费者对葡萄酒的品质要求提出了更高的要求，优质葡萄酒的生产迫切需要具有产区特征、能体现当地特色和风格的葡萄酒。
3.近年来，国内外研究显示，非酿酒酵母在增强葡萄酒的产区特色和风味复杂性等方面具有积极作用，葡萄酒中的香气物质主要包括酯类和醇类等物质，它们会赋予葡萄酒果香和花香气味，给予人们舒适的愉悦感，如辛酸乙酯给予葡萄酒杏、梨和香蕉的风味；己酸乙酯具有绿色苹果的风味；苯乙醇赋予葡萄酒玫瑰香和桃子的风味。
4.此外，非酿酒酵母所分泌的β-葡萄糖苷酶可以将结合态芳香化合物水解，释放的糖苷及单萜等化合物也会增加葡萄酒的香气复杂度和化学复杂度，提高酒中挥发性化合物的含量，进而酿制出具有地域风味特色的葡萄酒产品。然而，葡萄酒发酵时高糖低ph环境会严重影响非酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的酶活。因此，筛选具有良好环境耐受性的高产β-葡萄糖苷酶的非酿酒酵母并应用于葡萄酒生产中，对于提升产区葡萄酒的风味品质具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.针对现有非酿酒酵母环境耐受性差会影响β-葡萄糖苷酶的酶活，以及葡萄酒产品的产区风格特征不明显的问题，本发明提供一株葡萄酒有孢汉逊酵母g2、包含葡萄酒有孢汉逊酵母g2的发酵菌剂及应用。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
7.第一方面，本发明提供一株葡萄酒有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)g2，其保藏编号为cgmcc no.25348。
8.所述葡萄酒有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)g2，分类命名为hanseniaspora uvarum，已于2022年07月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，菌种保藏号为cgmcc no.25348，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
9.本发明提供的葡萄酒有孢汉逊酵母g2的生物学特征为：在wl培养基上菌落呈圆形，边界整齐，菌落球形突起，周围浅绿色，中间深绿色，表面光滑。
10.优选的，葡萄酒有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)g2是由河北省张家口市怀来县葡萄产区的赤珠霞葡萄果实表层筛选出来的。
11.本发明提供的葡萄酒有孢汉逊酵母g2在传统的酿酒条件下依然可以高产β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶在传统酿酒条件下具有较高的酶活力，将其应用于葡萄酒酿造中，可显著提高葡萄酒中酯类物质和高级醇的含量，同时，还能增加葡萄酒中萜烯类物质的含量，从而有助于增加葡萄酒的风味复杂度，使葡萄酒具有浓郁的花香、香蕉、梨和苹果的果香味，从而使酿制葡萄酒具有产区特征、能体现当地特色和风格，满足人们对葡萄酒的品质的更高要求。
12.进一步地，本发明提供的葡萄酒有孢汉逊酵母g2的β-葡萄糖苷酶的酶活力为66.03
±
2.46u/ml。
13.第二方面，本发明还提供了一种发酵菌剂，包含所述的葡萄酒有孢汉逊酵母g2。
14.进一步地，所述发酵菌剂为液体菌剂、半液体菌剂或固体菌剂。
15.示例性的，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2接种至ypd液体培养基中，发酵至活菌数达到108cfu/ml以上，得到液体菌剂。
16.将上述液体菌剂进行浓缩，得到半液体菌剂。
17.上述浓缩可以采用本领域常规的浓缩方法，如离心，过滤等，本发明不做特殊要求。
18.向上述半液体菌剂中加入缓冲液，加入冻干保护剂，调整活菌数达到10
10
cfu/ml～10
12
cfu/ml，冻干，得到固体菌剂。
19.上述缓冲液可采用本领域常规的缓冲液，如pbs缓冲液或生理盐水。冻干保护剂也可以采用本领域常用的冻干保护剂，如脱脂乳粉、麦芽糊精、葡聚糖或甘油中至少一种。
20.进一步地，所述发酵菌剂中葡萄酒有孢汉逊酵母g2的活菌浓度为108cfu/ml～10
12
cfu/ml。
21.第三方面，本发明还提供了上述葡萄酒有孢汉逊酵母g2或发酵菌剂在酿造葡萄酒中的应用，尤其是在酿造马瑟兰葡萄酒或龙眼葡萄酒中的应用。
22.本发明提供的葡萄酒有孢汉逊酵母g2可广泛应用于中国产区各葡萄品种的葡萄酒的酿制，尤其是适用于河北省张家口怀来县产区的葡萄酒酿造。在葡萄酒的典型性方面，都显著优于商业酵母菌株，说明筛选的菌株能体现产地葡萄酒典型性，具备较高的应用价值。
23.本发明还提供了一种生产葡萄酒的方法，利用上述的葡萄酒有孢汉逊酵母g2或上述任一项所述的发酵菌剂发酵葡萄原料得到干红或干白葡萄酒。
24.具体地，干红葡萄酒的具体步骤如下：挑选健康的马瑟兰果实，除梗破碎后得到葡萄浆，以葡萄浆为原料，向其中加入焦亚硫酸钾和果胶酶，然后将上述葡萄酒有孢汉逊酵母g2或所述的发酵菌剂接种至葡萄汁中，混合均匀，在ph3～4、25℃～28℃条件下进行发酵，得干红葡萄酒。
25.上述生产干白葡萄酒的方法具体步骤如下：以破碎除梗压榨后的葡萄汁为原料，向葡萄汁中加入焦亚硫酸钾和果胶酶，然后将上述葡萄酒有孢汉逊酵母g2或所述的发酵菌剂接种至葡萄汁中，混合均匀，在ph3～4、12℃～16℃条件下进行发酵，得干白葡萄酒。
26.进一步地，所述葡萄酒有孢汉逊酵母g2的接种量为1
×
106cfu/ml～1
×
108cfu/ml。
27.通过葡萄酒有孢汉逊酵母g2的发酵产生一系列的代谢产物，可赋予葡萄酒令人愉悦的独特的风味，代谢产物中高级醇和酯类直接受葡萄酒有孢汉逊酵母g2细胞的繁殖密度影响。优选的接种量可使葡萄酒中的风味物质高级醇和酯含量适当，且可以使葡萄酒具有适当的酒精度和发酵度，使得葡萄酒的口感更加丰富协调。
28.进一步地，所述葡萄汁原料由河北省张家口市怀来县的马瑟兰或龙眼葡萄破碎除梗压榨得到。
29.需要说明的是，在发酵之前需要对葡萄酒有孢汉逊酵母g2进行活化。可采用本领域常规的活化方法，如，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2接种至ypd液体培养基中，28℃摇床培养过夜。
30.本发明提供的葡萄酒有孢汉逊酵母g2可高产β-葡萄糖苷酶(66.03
±
2.46u/ml)，且在耐受性方面表现优良。与商业非酿酒酵母nsd相比，本发明提供的葡萄酒有孢汉逊酵母g2可使酿造的干红葡萄酒中具有更高的酯类含量(1387.27
±
142.84mg/l)和高级醇含量(1020.09
±
94.71mg/l)，其中，乙酸乙酯的含量(224.50
±
15.08mg/l)是商业非酿酒酵母nsd的两倍以上，1-丙醇和苯乙醇的含量均显著高于商业非酿酒酵母nsd，可显著增加葡萄酒的果香和醇香味，此外，葡萄酒有孢汉逊酵母g2酿造的葡萄酒中萜烯类物质含量更高，是商业非酿酒酵母nsd的两倍以上，可显著增加葡萄酒的典型性和特性，使酿造葡萄酒具有浓郁的花香和水果香，香气优雅协调，入口圆润，具有明显的地域性的香气和风味特点，对促进葡萄酒的产业发展具有十分重要的意义。
31.对于干白葡萄酒，与单独的vl2接种发酵相比，g2和vl2顺序发酵可使葡萄酒产品中具有更高的酯类(2490.72
±
17.91mg/l)和高级醇(544.53
±
14.75mg/l)含量，增加了萜烯类物质种类(4-萜烯醇、香茅醇和橙花醇)，此外，还检测到其它挥发性化合物也仅存在于g2中(9-癸烯酸乙酯，乙酸苯乙酯，丁酸乙酯，苯乙醇，正庚醇和1-辛醇)，这些化合物增加了葡萄酒的花香和果香，增强了葡萄酒的品种香气，让葡萄酒更具有典型特点和产地特色。
附图说明
32.图1为葡萄酒有孢汉逊酵母g2在wl固体培养基上的菌落形态。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.实施例所用培养基：
35.wl培养基(1l)：酵母粉5g，酸水解酪蛋白5g，葡萄糖50g，琼脂17g，磷酸二氢钾0.55g，氯化钾0.425g，氯化钙0.125g，氯化铁0.0025g，硫酸镁0.125g，硫酸锰0.0025g，溴甲酚绿0.022g，ph值为5.3-5.7，121℃、高压灭菌20min后待用。
36.ypd液体培养基(1l)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，水1000ml，自然ph值，121℃灭菌20min后待用。
37.ypd固体培养基(1l)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂15g，氯霉素100mg(预先溶于少量乙醇中)，水1000ml，自然ph值，121℃灭菌20min后待用。
38.筛选培养基(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾4g，p-npg 1g，水1000ml，自然ph值，121℃灭菌20min后待用。
39.七叶苷培养基配方(1l)：七叶苷3g，柠檬酸铁0.5g，氯化钠2g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂20g，水1000ml，自然ph值，121℃灭菌20min后待用。
40.产酶培养基配方(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，硫酸3g，磷酸4g，水1000ml，自然ph值，121℃灭菌20min后待用。
41.实施例1
42.1.出发菌株的选育
43.1.1果表酵母的分离筛选
44.无菌称量5g张家口市怀来县成熟的赤珠霞葡萄，放入盛有45ml已灭菌的0.9％氯化钠溶液中，振荡摇匀，制成菌悬液，吸取1ml菌悬液放入高温灭菌的ypd液体培养基中，于恒温摇床中，28℃振荡培养2d(180r/min)，吸取1ml菌悬液加入9ml已灭菌的0.9％氯化钠溶液中，轻柔振荡，重复上述操作，依次梯度稀释102～107倍。用微量移液器吸取不同浓度梯度的菌液0.1ml加入ypd固体培养基中，使用涂布器均匀涂布，将ypd固体培养基置于恒温培养箱中，28℃倒置培养，每个浓度梯度设置三个平行。挑取ypd固体培养基中外观形态及颜色有差异的单菌落使用四区划线法在wl培养基上进行纯化，将得到的纯培养物编号记录，将制得的纯培养物与40％甘油溶液等比例混合，振荡均匀，于-80℃保藏。
45.1.2产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选
46.初筛：将上述筛选得到的酵母菌接种至ypd液体培养基上，于28℃振荡培养24h(180r/min)，将活化液稀释至104cfu/ml，接种至筛选培养基中，28℃恒温培养72h后，在培养基上喷洒1mol/l碳酸钠溶液。产霉菌株会分解p-npg得到对硝基苯酚(p-np)，p-np和碳酸钠发生显色反应生成黄色物质从而在菌落周围形成透明圈，透明圈直径越大和颜色越深说明酶活性越高。挑取目标单菌落富集培养48h，将菌液与40％甘油溶液等比例混合，振荡均匀，于-80℃保藏。
47.复筛：将上一步筛选得到的目标菌株接种至ypd液体培养基上，于28℃振荡培养24h(180r/min)，将活化后的菌液接种至含有七叶苷的培养基中，利用96孔板进行观察，每个菌株重复接种三次，覆盖封板膜使96孔板中的培养基及菌液不与外界接触，避免杂菌污染，然后于28℃静置培养1d，观察培养基颜色是否有颜色变化以及颜色深浅的变化程度。七叶苷在β-葡萄糖苷酶的作用下可以得到产物七叶苷元，而七叶苷元与三价铁离子发生化学反应会呈现棕黑色。因此，可以根据培养基颜色的深浅来判断菌株产酶活性的高低。
48.1.3β-葡萄糖苷酶的活性测定
49.将上步复筛得到的高产β-葡萄糖苷酶的菌株接种至ypd液体培养基上，于28℃振荡培养24h(180r/min)进行活化，按照5％的接种量接入产酶培养基中28℃摇床培养72h，将培养得到的菌液置于了冷冻高速离心机中，在4℃低温条件下8000r/min离心10min，吸取上清液，即粗酶液，用于下一步分析检测。
50.使用微量移液器准确吸取0.5ml粗酶液于15ml离心管中，之后加入1ml提前使用柠檬酸-磷酸盐缓冲液作为溶剂配制好的35mm p-npg溶液(ph5.0)，轻柔震荡混匀，使用水浴50℃反应10min，加入8ml 1mol/l碳酸钠溶液用以终止反应，等待5min显色稳定后，于400nm波长的紫外光下测定吸光值。空白为相同处理下未接菌的ypd液体培养基。
51.酶活力单位(u)定义为ph5.0，50℃反应条件下1min水解p-npg产生1nmol p-np所需要的酶量。
52.测定酶活力为66.03
±
2.46u/ml。
53.实施例2
54.产酶菌株的鉴定
55.1.1生态学观察
56.将菌株g2接种至wl培养基上，放入28℃恒温培养箱中培养48h左右，观察培养基上的菌落形态、菌落边缘、颜色和透明度等。
57.菌株g2在wl培养基上菌落呈圆形，边界整齐，菌落球形突起，周围浅绿色，中间深绿色，表面光滑，不透明，如图1所示。
58.1.2分子生物学鉴定
59.dna提取：根据plantzol基因组提取试剂盒说明书操作。
60.pcr扩增：采用its rdna通用引物its1(5'-tccgtaggtgaacctgcg g-3')和its4r(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')进行pcr扩增。
61.pcr扩增使用50μl反应体系，包括：10
×
ex taq buffer 5.0μl，2.5mm dntp mix 4.0μl，10p引物1 2.0μl，10p引物2 2.0μl，5u ex taq 0.5μl(5u/μl)，dna模板2.0μl(20μg/μl)和ddh2o 34.5μl。
62.pcr反应条件：首先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行24次循环，最后72℃延伸10min。pcr扩增产物检测及胶回收：产物在0.8％凝胶中电泳，电压150v，电泳20min。切胶回收pcr产物。pcr扩增和测序工作由睿博兴科生物技术有限公司完成，测序方法为sanger法，its rdna的测序结果为：
63.cctgattgatatcttgttgctcgagttcttgtttagatcttttacaataatgtgtatctttattgaagatgtgcgcttaattgcgctgcttctttagagtgtcgcagtgaaagtagtcttgcttgaatctcagtcaacgctacacacattggagttttttactttaatttaattctttctgctttgaatccaaagggtc aagggaaaaaacaaacacaaacaattttattttattataattttttaaactaaaccaaaattcctaacggaaattttaaaataatttaaaactttcaacaacggatctcttgggtctcccctccatgaaaaacctagccaattgccaaaagtaatgggaattgccgatactcctgaatcattgaatttttgaaccccccttgcccccttgaacattctcaggggcatgcctggttgaacctcatttccttctccaaagataatttattattttttgggtgggggccatactccagggtagcttggattggagactggttccgtccttattattccacattagcttcctggaacctggtttgctgatgtaatattgaatatccttacctacaggatggtacctaccttagcaaggtgcctcaatcatcagtttgacctcaatcaggagattacgtgacttagcatatctaaccgag。
64.将葡萄酒有孢汉逊酵母g2菌株的its rdna序列与genbank数据库中序列进行比较，确定g2菌株为葡萄酒有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)。
65.该葡萄酒有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)g2，已于2022年07月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，菌种保藏号为cgmcc no.25348，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
66.实施例3
67.复筛得到酵母菌株产的β-葡萄糖苷酶的耐高糖、耐乙醇、耐金属离子、耐酸、耐so2等抗逆性评价
68.3.1耐葡萄糖评价
69.配制不同浓度葡萄糖浓度(5％、10％、15％、20％)的ypd液体培养基，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2分别接种至不同葡萄糖浓度的ypd液体培养基中，接种量为106cfu/ml，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规ypd液体培养基(葡萄糖浓度2％)为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
70.3.2耐乙醇评价
71.配制不同乙醇浓度(3％、6％、9％、12％)的ypd液体培养基，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2分别接种至不同乙醇浓度的ypd液体培养基中，接种量为106cfu/ml，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。并以加菌液的常规ypd培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
72.3.3金属离子
73.在ypd液体培养基中分别加入5mmol/l的不同金属离子(zn
2+
，mg
2+
，cu
2+
，ca
2+
，fe
2+
，mn
2+
)，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2分别接种至不同金属离子的ypd液体培养基中，接种量为106cfu/ml，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规ypd培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
74.3.4ph
75.调节ypd液体培养基的ph值分别为2.0、2.5、3.0、3.5，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2分别接种至不同ph值的ypd液体培养基中，接种量为106cfu/ml，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规ypd培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。
76.3.5二氧化硫
77.向ypd液体培养基中加入偏重亚硫酸钾，调节so2浓度分别为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l，将葡萄酒有孢汉逊酵母g2分别接种至不同so2浓度的ypd液体培养基中，接种量为106cfu/ml，在恒温箱中28℃条件下振荡培养72h。以加菌液的常规ypd培养基为对照组。按照实施例1(1.3)的方法进行酶活测定。结果如表1所示。
78.表1
79.[0080][0081]
从表中可以看出，随着葡萄糖的浓度增加，g2菌株的相对酶活受到持续抑制，但是，当葡萄糖浓度为15％时，g2菌株的相对酶活仍然高达83.61％，当葡萄糖浓度为20％时，g2菌株的β-葡萄糖苷酶的相对酶活仍能保持原有，酶活的67.81％，验证了非酿酒酵母g2具有生产耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的能力。
[0082]
葡萄酒有孢汉逊酵母g2的生长繁殖会受到高浓度乙醇的强烈抑制，从而影响β-葡萄糖苷酶的酶活，当乙醇浓度为6％时，g2菌株的相对酶活仍可达到80％，但是乙醇浓度继续增加，其相对酶活则大幅度下降。
[0083]
对于葡萄酒有孢汉逊酵母g2，mg
2+
、mn
2+
和ca
2+
三种金属离子对其分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活有激活作用，而zn
2+
和fe
2+
两种金属离子则会抑制其分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活，但是，其相对酶活也能保持在75％以上。
[0084]
在ph为2时，g2菌株所分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活均降至25％以下，这是由于过低的酸碱度会改变酶蛋白的空间结构，从而影响酶活。随着培养基环境ph不断升高，酶活有不同程度的增加，当ph为3.5时，g2菌株所分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活达到了对照组的50％以上。一般葡萄汁和市售葡萄酒的ph在3-4之间，在此范围内菌株g2的酶活表现较好，说明其比较适合葡萄酒的低酸碱度发酵环境。
[0085]
当so2添加量为40mg/l时，g2菌株的酶活高于对照组；当so2添加量为60mg/l时，g2菌株的酶活有小幅度下降；随着so2添加量增加，其所分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活受到持续抑制，但相对酶活均保持在80％以上，说明该酵母菌株g2所分泌的β-葡萄糖苷酶对二氧化硫具有良好的耐受性。
[0086]
实施例4
[0087]
葡萄酒有孢汉逊酵母g2用于干红葡萄酒酿造
[0088]
1.发酵试验
[0089]
以张家口市怀来县多年生优质葡萄园为采样地点，选择健康且表皮无破损的新鲜
马瑟兰葡萄进行采摘，以除梗破碎后的马瑟兰葡萄汁为原料，采用葡萄酒有孢汉逊酵母g2为发酵剂，取8l马瑟兰葡萄汁置于洁净的12l玻璃瓶中，加入焦亚硫酸钾75g/t和果胶酶30g/t，混合均匀后于10℃下浸渍72h，接种活化后的葡萄酒有孢汉逊酵母g2菌悬液，接种量为106cfu/ml，商业活性非酿酒酵母nsd作为对照(20g/100l)。当酵母混合液添加进发酵容器后，要尽量使酵母液在发酵罐中混合均匀。在25℃、ph3.5条件下进行静置发酵，发酵至残糖小于7.5g/l，总糖与总酸差值小于或等于2.0g/l，发酵结束。
[0090]
2.挥发性化合物检测
[0091]
挥发性香气成分提取：吸取7.5ml酒液置于20ml玻璃顶空瓶中，加入10μl 3-辛醇水溶液(300mg/l)作为内标和2g nacl有助于香气挥发，采用半定量内标法测定香气。之后放入40℃水浴锅中平衡15min，spme纤维顶空恒温萃取40min，最后采取手动进样法于gc进样口解析6min。
[0092]
采用全扫描模式(scan)进行定性，离子扫描模式(sim)进行定量。将质谱图谱与nist 14谱库进行比对，对匹配度80％以上的组分进行分析。采用内标法对挥发性化合物进行半定量分析。结果如表2所示。
[0093]
表2
[0094][0095]
酯类和醇类在酒中是主要的挥发性呈香化合物，在几乎全部的葡萄酒中，酯类物质含量最多，其次是醇类和脂肪酸类。g2菌株酿造的干红葡萄酒中的酯类含量达到(1387.27
±
142.84)mg/l，显著高于商业酵母nsd(919.75
±
121.28)mg/l，属于高产酯的菌株。乙酸酯是随着高级醇的产生，通过氨基酸或糖和乙酰辅酶a的降解而形成。一般研究通
常认为，乙酸酯对葡萄酒果香的影响要比脂肪酸乙酯更大。g2菌株酿造的干红葡萄酒中检测出3种乙酸酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯)，其中，乙酸乙酯(224.50
±
15.08mg/l)的含量是商业酵母nsd(107.84
±
14.37mg/l)的两倍以上，相比商业酵母，更能增加葡萄酒中的果香风味；乙酸己酯(27.26
±
2.73mg/l)的含量是商业酵母nsd(6.27
±
0.51mg/l)的三倍以上，其可赋予葡萄酒苹果、樱桃和梨的香气。除此之外，g2菌株酿造的干红葡萄酒中的己酸乙酯和辛酸乙酯等脂肪酸乙酯含量也显著高于商业酵母nsd。
[0096]
g2菌株酿造的干红葡萄酒中的醇类含量(1020.09
±
94.71mg/l)高于商业酵母nsd，此外，g2菌株酿造的干红葡萄酒中的1-丙醇和苯乙醇的含量均显著高于商业酵母nsd，这会显著增强葡萄酒中的醇香味。此外，g2菌株酿造的干红葡萄酒中的苯乙烯含量是商业非酿酒酵母nsd的两倍以上，可以显著增加葡萄酒中梨的香气。
[0097]
实施例5
[0098]
葡萄酒有孢汉逊酵母g2用于干白葡萄酒酿造
[0099]
1.发酵试验
[0100]
以张家口市怀来县多年生优质葡萄园为采样地点，选择健康且表皮无破损的新鲜龙眼葡萄进行采摘，手工除梗破碎压榨出汁，加入焦亚硫酸钾80g/t和果胶酶15g/t，混合均匀6-8℃下澄清48h，取250ml葡萄汁置于无菌处理过的500ml锥形瓶中，70℃下灭菌20min，冷却至室温后重复操作两次以杀灭果汁中的杂菌。接种活化后的葡萄酒有孢汉逊酵母g2菌悬液，接种量为106cfu/ml，48h后接入商业活性干酵母vl2(20g/100l)。以单独商业活性干酵母vl2(20g/100l)发酵作为对照。当酵母混合液添加入发酵容器后，要尽量使酵母液在发酵容器中混合均匀。在14℃、ph3.5条件下进行静置发酵，发酵至残糖小于4.0g/l，发酵结束。
[0101]
2.挥发性化合物检测
[0102]
挥发性香气成分提取：吸取7.5ml酒液置于20ml玻璃顶空瓶中，加入10μl 3-辛醇水溶液(300mg/l)作为内标和2g nacl有助于香气挥发，采用半定量内标法测定香气。之后放入40℃水浴锅中平衡15min，spme纤维顶空恒温萃取40min，最后采取手动进样法于gc进样口解析6min。
[0103]
采用全扫描模式(scan)进行定性，离子扫描模式(sim)进行定量。将质谱图谱与nist 14谱库进行比对，对匹配度80％以上的组分进行分析。采用内标法对挥发性化合物进行半定量分析。结果如表3所示。
[0104]
表3
[0105][0106]
酯类和醇类在酒中是主要的挥发性呈香化合物，g2和vl2顺序发酵的酒样中酯类含量达到(2490.72
±
17.91)mg/l，显著高于商业酿酒酵母vl2(1063.79
±
21.34)mg/l，属于高产酯的菌株。乙酸酯是随着高级醇的产生，通过氨基酸或糖和乙酰辅酶a的降解而形成。一般研究通常认为，乙酸酯对葡萄酒果香的影响要比脂肪酸乙酯更大。g2菌株酿造的干白葡萄酒中检测出4种乙酸酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯)，均高于vl2单独发酵；此外，g2和vl2顺序发酵的酒样中辛酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯等脂肪酸乙酯含量也显著高于商业酵母nsd，显著增加了葡萄酒中的果香和花香风味。
[0107]
g2和vl2顺序发酵的酒样中醇类含量(544.53
±
14.75mg/l)显著高于商业酵母vl2(86.37
±
4.62mg/l)，并检测出3种萜烯类化合物，分别是4-萜烯醇、香茅醇、橙花醇，萜烯类化合物的感官阈值都很低，它们的存在使葡萄酒具有浓郁的花果香气，从而增强了葡萄酒的品种香气，赋予葡萄酒典型特征和产地风格。
[0108]
由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为cgmcc no.25348的菌株具有良好的耐酸、耐二氧化硫、耐高糖和耐酒精性能，且具有高产β-葡萄糖苷酶的优良特性，用其酿造的葡萄酒具有本土地域生化特性，能产生更突出丰富的地域香气成分，对于酿造特色优质干红和干白葡萄酒具有重要意义。
[0109]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一株葡萄酒有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)g2，其特征在于，其保藏编号为cgmcc no.25348。2.一种发酵菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的葡萄酒有孢汉逊酵母g2。3.如权利要求2所述的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂为液体菌剂、半液体菌剂或固体菌剂。4.如权利要求2或3所述的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂中葡萄酒有孢汉逊酵母g2的活菌浓度为108cfu/ml～10
12
cfu/ml。5.权利要求1所述的葡萄酒有孢汉逊酵母g2或权利要求2～4任一项所述的发酵菌剂在酿造葡萄酒中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述葡萄酒为干红或干白葡萄酒。7.一种生产葡萄酒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的葡萄酒有孢汉逊酵母g2或权利要求2～4任一项所述的发酵菌剂发酵葡萄原料得到干红或干白葡萄酒。8.如权利要求7所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，具体步骤如下：向葡萄汁中加入焦亚硫酸钾和果胶酶，混合均匀，然后将权利要求1所述的葡萄酒有孢汉逊酵母g2或权利要求2～4任一项所述的发酵菌剂接种至葡萄汁中，混合均匀，发酵，得干红或干白葡萄酒。9.如权利要求8所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，所述葡萄酒有孢汉逊酵母g2的接种量为1
×
106cfu/ml～1
×
108cfu/ml。10.如权利要求8或9所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，所述葡萄汁由河北省张家口市怀来县的马瑟兰或龙眼葡萄除梗破碎压榨得到。

技术总结
本发明涉及工业微生物技术领域，具体公开一株葡萄酒有孢汉逊酵母G2、包含其发酵菌剂及应用。所述葡萄酒有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)G2的保藏编号为CGMCC No.25348，具有高产β-葡萄糖苷酶(66.03


技术研发人员：刘亚琼 王颉 葛晓欣 党超 王美琪 锁然 孙剑锋 牟建楼 马倩云 王文秀
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/11