一种改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法与流程

1.本发明主要涉及护理技术领域，特别是一种改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法。


背景技术：

2.在我们人类发展的进程当中，有很多的婴儿是通过剖腹产产生的，他们失去了从母亲的产道获得第一批微生物定殖的机会。我们现在大量抗生素的使用使得我们婴儿、儿童、少年甚至成人的肠道菌群受到破坏。在非医疗必须的相关情况之下，有过度的奶粉喂养的趋势，这也有可能造成一些婴幼儿的肠道菌群多样性受到影响。此外，在生命早期肠道菌群的紊乱可能影响神经系统的发育，对宿主行为产生长远的影响，增加神经发育和精神疾病的风险。所以说，生命早期菌群的建立是一个非常重要的过程，也是一个非常系统化的过程。目前急需一种饮食之外的方法，来帮助构建婴儿早期肠道菌群。
3.因鉴于此，特提出此发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的旨在提供一种通过饮食以外的因素改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一种改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，所述方法为使婴幼儿每天与宠物接触。
6.优选或可选地，所述宠物为带毛宠物。
7.优选或可选地，所述带毛宠物为猫科宠物和/或犬科宠物。
8.优选或可选地，所述与宠物接触的方式为和宠物处于同一房间内。
9.优选或可选地，所述接触的时间为12-16h。
10.优选或可选地，所述接触还包括对宠物进行抚摸和/或拥抱。
11.本发明所述的方法，通过使婴幼儿在生命早期接触宠物，可以明显的改善婴幼儿肠道菌群的组成，还可以促进婴幼儿大脑及神经系统的发育。
附图说明：
12.图1为在asvs水平上，pc组和npc组肠道微生物α多样性(chao1)分析结果图；
13.图2为在asvs水平上，pc组和npc组肠道微生物α多样性(shannon)分析结果图；
14.图3为在asvs水平上，pc组和npc组肠道微生物α多样性(simpson)分析结果图；
15.图4为在asvs水平上，pc组和npc组肠道微生物β多样性分析结果图；
16.图5为pc组和npc组肠道微生物在门水平上丰度柱状图；
17.图6为pc组和npc组肠道微生物在属水平上丰度柱状图；
18.图7为pc组和npc组肠道微生物在门水平分布差异对比图；
19.图8为pc组和npc组肠道微生物在属水平分布差异对比图；
20.图9为属水平微生物的代表性序列构建的系统发育树图；
21.图10为随机森林算法构建pc组微生物重要性排序图；
22.图11为pc组中10个属微生物的roc曲线；
23.图12为pc组与npc组肠道微生物功能预测图；
24.图13为pc组和npc组正离子模式下pls-da散点图；
25.图14为pc组和npc组负离子模式下pls-da散点图；
26.图15为pc组和npc组正离子模式下排序检验结果图；
27.图16为pc组和npc组负离子模式下排序检验结果图；
28.图17为pc组和npc组正离子模式下差异代谢物火山图；
29.图18为pc组和npc组负离子模式下差异代谢物火山图；
30.图19为pc组和npc组差异代谢物lauric acid的roc曲线；
31.图20为pc组和npc组差异代谢物docosahexaenoic acid的roc曲线；
32.图21为pc组和npc组差异代谢物decanoic acid的roc曲线；
33.图22为pc组和npc组在正离子模式下差异代谢物相关性图；
34.图23为pc组和npc组在负离子模式下差异代谢物相关性图；
35.图24为pc组和npc组在正离子模式下kegg富集气泡图；
36.图25为pc组和npc组在负离子模式下kegg富集气泡图；
37.图26为pc组和npc组在正离子模式下显著差异的菌属与代谢组学相关性分析热图；
38.图27为pc组和npc组在负离子模式下显著差异的菌属与代谢组学相关性分析热图。
具体实施方式
39.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
40.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
41.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1
43.本实施例中，作为宠物接触组的婴幼儿(pc)的入选标准为婴幼儿平均每天为猫科或犬科宠物生活在同一环境12h以上；作为非宠物接触组的婴幼儿(npc)的入选标准则为从未接触过宠物或平均每周与宠物生活在同一环境不超过4h；pc组和npc组婴幼儿的母亲在京至少居住5年，无孕前高血压、糖尿病、高脂血症、肝炎、肾炎、消化道疾病(慢性胃炎、肠炎、胃溃疡及十二指肠溃疡等)及感染性疾病史(肝炎、肺结核等)。婴幼儿近1个月服用抗生素；母亲规律吸烟、饮酒，辅助生育技术受孕，精神类疾病不能正确回答问题或不愿进行问卷调查者则直接排除。
44.收集各组婴幼儿的粪便样本以及对应的母亲和婴幼儿的基本资料调查表。
45.其中，粪便样本的采集方法为：从便盆中收集粪便，立即放入带有粪便dna稳定剂的粪便收集管中(stratec,germany)，并在-20℃保存，直到将其运送到-80℃冰箱后长期保
存，以便后续分析。
46.上述过程获得首都医科大学附属北京地坛医院医学伦理委员会批准(2017-ky-015-02)，所有实验组和对照组婴儿的母亲均签署知情同意书。
47.实施例2
48.本实施例检测了实施例1中获得的粪便样本中的微生物。
49.采用粪便基因组dna提取试剂盒(tiangen)，对粪便样本的基因组dna进行提取。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。引物对应区域：16sv4区引物(515f和806r)以鉴定细菌多样性。
50.所有pcr混合液加入15μlhigh-fidelitypcrmastermix(newenglandbiolabs)、0.2μm引物和10ng基因组dna模板，在98℃下进行1分钟的第一次变性，然后在98℃(10s)、50℃(30s)和72℃(30s)下进行30次循环，最后在72℃下保持5分钟。
51.pcr产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对检测合格的pcr产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带使用通用型dna纯化回收试剂盒(tiangen)回收产物。使用ultra
tm
iifsdnapcr-freelibraryprepkit建库试剂盒(newenglandbiolabs)进行文库构建，构建好的文库经过qubit和q-pcr定量，文库合格后，使用novaseq6000进行pe250上机测序。
52.根据barcode序列和pcr扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据。截去barcode和引物序列后使用flash(version1.2.11,http://ccb.jhu.edu/software/flash/)(magoctetal.,2011)，对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始tags数据(rawtags)。使用fastp软件(version0.23.1)对拼接得到的rawtags经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(cleantags)(bokulichnaetal.,2012)。去除嵌合体经过以上处理后得到的tags需要进行去除嵌合体序列的处理，tags序列通过与物种注释数据库(silvadatabase，https://www.arb-silva.de/for16s/18s,unitedatabasehttps://unite.ut.ee/forits)进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(effectivetags)。
53.对以上得到的effectivetags，使用qiime2(versionqiime2-202006)软件中的dada2模块或deblur进行降噪(默认使用dada2)，从而获得最终的asvs(ampliconsequencevariants，即扩增子序列变异)以及特征表。使用qiime2软件进行物种注释。对于16s，数据库为silva138.1，对于its，数据库为unitev8.2。使用qiime2软件进行快速多序列比对，得到所有asv序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，得到粪便样本中的微生物信息数据。
54.实施例3
55.本实施例检测了实施例1中获得的粪便样本中的代谢物。
56.称取100mg经添加液氮研磨后的粪便样本，置于ep管中，加入500μl的80％甲醇水溶液；涡旋震荡，冰浴静置5min，15000
×
g、4℃离心20min；取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为53％；15000
×
g、4℃离心20min，收集上清。qc样本：从每个实验样本中取等体积样本混匀作为qc样本。空白(blank)样本：53％甲醇水溶液代替实验样本，前处理过程与实验样本相同。
57.将上述预处理的样本进样至lc-ms进行分析。
58.色谱条件：色谱柱：hypersilgoldcolumn(c18)；柱温：40℃；流速：0.2ml/min；正模式：流动相a：0.1％甲酸；流动相b：甲醇；负模式：流动相a：5mm醋酸铵，ph9.0；流动相b：甲醇；色谱梯度洗脱程序如下表所示。
[0059][0060]
质谱条件：扫描范围选择m/z100-1500；esi源的设置如下：喷雾电压(sprayvoltage):3.5kv；鞘气流速(sheathgasflowrate):35psi；辅助气流速(auxgasflowrate):10l/min；离子传输管温度(capillarytemp):320℃；离子导入射频电平(s-lensrflevel):60；辅助气加热器温度(auxgasheatertemp):350℃；极性(polarity):positive,negative；ms/ms二级扫描为数据依赖性扫描(data-dependentscans)。
[0061]
将下机数据(.raw)文件导入cd3.1搜库软件中进行处理，对每个代谢物进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后设置保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm对不同样品进行峰对齐，使鉴定更准确，随后设置质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzcloud(https://www.mzcloud.org/)、mzvault和masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，将原始定量结果依据公式：样本原始定量值/(样本代谢物定量值总和/qc1样本代谢物定量值总和)，进行标准化处理，得到相对峰面积；并将qc样本中相对峰面积的cv大于30％的化合物删除，数据处理部分基于linux操作系统(centos版本6.6)以及软件r、python进行，得到粪便样本中代谢物的鉴定和相对定量结果。
[0062]
实施例4
[0063]
以实施例1中所述标准筛选实验对象，共有15名接触宠物的母亲(即pm组)及其婴儿(pc组)和20名不接触宠物的母亲(npm组)及其婴儿(npc组)参与本次研究。
[0064]
研究队列的临床信息如表1所示。结果显示，包括母亲年龄、bmi、过敏史、近一年抗生素使用、过敏症状指数评分；婴儿年龄、体重、过敏史、感冒史、近一年抗生素使用、婴儿过敏风险筛查评分在内的临床指标在两组之间无统计学差异。
[0065]
表1各组实验对象特征结果表
[0066][0067]
对上述的样本采用实施例2中所述的方法得到样本中的微生物信息数据，并对pc组和npc组进行α多样性(chaol,shannon,simpson)分析，结果如图1-3所示，pc组chao1指数值高于npc组，说明pc组肠道菌群丰富度高于npc组，但结果无统计学差异。同时，npc组和pc组的母乳喂养无统计学差异，因此不对最终结果产生影响(p＝0.51)。
[0068]
对pc组和npc组进行基于asvs水平的pcoa和adonis分析，结果如图4所示。结果表明，pc组与npc组物种组成结构具有显著差异(adonis，p＝0.02)。
[0069]
基于asvs注释结果，选取pc和npc在门和属水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看两组在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例，结果如图5-6所示。检测到主要的4个门为firmicutes(厚壁菌门)(53.9％)，proteobacteria(变形菌门)(11.0％)，bacteroidota(拟杆菌门)(27.8％)，fusobacteriota(梭杆菌门)(3.7％)。在属水平上，escherichia-shigella(志贺埃希氏菌)，bacteroides(拟杆菌属)，cetobacterium(鲸杆菌属)，blautia(真杆菌属)在婴儿肠道微生物属中最丰富。为研究两组之间的差异物种，利用lefse方法对组间物种丰富度进行数据分析，筛选出具有差异物种。在门水平上，如图7所示，pc组中synergistota(互养菌门)显著富集，gemmatimonadota(芽单胞菌门)，chloroflexli(绿弯菌门)，acidobacteriota(酸杆菌门)，crenarchaeota(泉古菌门)丰度显著降低(ldascore≥2.0且p《0.05)；如图8所示，属水平上，pc组methyloversatilis(嗜甲基菌属)，achromobacter(无色杆菌属)，delftia(代尔夫特菌属)，staphylococcus(葡萄球菌)，halomonas(盐单胞菌属)，stenotrophomonas(寡养单胞菌)丰度低；clostridium_sp(梭状芽孢杆菌)，faecalibacterium prausnitzii(普拉梭菌)，pantoea(泛菌)丰度高。(ldascore≥2.0且p《0.05)。为了进一步研究属水平物种的系统进化关系，通过多序列比对得到top100属的代表序列，如图9所示，其中escherichia-shigella，bacteroides在两组中的占比大(p《0.05)。
[0070]
通过随机森林回归分析建立婴儿肠道菌群与宠物的响应关系，并基于asvs特征构建属水平的随机森林预测模型并绘制roc曲线。之后对每个模型做交叉验证(默认10-fold)，再通过meandecreaseaccuracy筛选出重要的前10个物种，结果如图10所示。模型中10个属分别为methanosarcina(甲烷八叠球菌属)，alistipes(另支菌属)，methanobacterium(甲烷杆菌属)，megasphaera(巨球藻属)，bifidobacterium(双歧杆菌)，agathobacter(琼脂杆菌属)，anaerostipes(棒杆菌)，acidaminococcus(氨基酸球菌属)，methanosaeta(甲烷鬃菌属)，escherichia_shigella。绘制的roc曲线如图11所示，roc曲线的曲线下面积(auc)为0.9184(95％ci:0.807-1.000)，表明这10个属水平的微生物为接触宠物的婴儿特征肠道菌群的潜在生物标志物。
[0071]
采用picrust2对上述的10种重要肠道菌属进行功能预测，并使用ko数据库预测肠道菌群功能，结果如图12所示。结果显示pc组能量代谢通路，植物病原体相互作用通路和新生生物素生物合成通路显著增加；果糖与甘露糖代谢通路显著降低。
[0072]
实施例5
[0073]
对实施例1获得的样本采用实施例3中所述的方法进行非靶向代谢组学研究。
[0074]
离子和负离子模式下pc组和npc组样本的偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,pls-da)，结果如图13和14所示，pc组和npc组样本明显分离，且在正离子模式下差异更加明显。进一步通过置换检验(n＝200)对构建的pls-da模型进行可靠性验证，结果如图15和16所示，在正、负离子模式下r2数据均大于q2数据且q2回归线与y轴截距均小于0，表明该pls-da模型具有有效性。
[0075]
基于偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,pls-da)提取预测变量重要性(variable importance for the projection,vip)的数据，设定阈值为vip》1.0，p-value《0.05以筛选出pc组与npc组间重要差异代谢物。在正离子模式和负离子模式下，各取上下调重要代谢物，结果如表2所示，并进行火山图的展示，结果如图17-18所示，其中，pc组中类固醇激素生物合成通路中的四氢可的松和脂肪酸生物合成通路中的月桂酸浓度降低；pc组中不饱和脂肪酸生物合成通路中的二十二碳六烯酸和脂肪酸生物合成通路中的癸酸浓度增加，并进一步的绘制roc曲线评估上述的四种差异代谢物作为接触宠物的婴幼儿生物标志物的准确性，其中有3种代谢物roc曲线的auc值》0.7(如图19-21所示),1种代谢物roc曲线的auc值《0.7，因此月桂酸，二十二碳六烯酸和癸酸是可能性较大的生物标志物，与婴幼儿生长发育密切相关。
[0076]
表2差异代谢物结果表
[0077]
[0078]
[0079][0080]
为得到代谢物与代谢物变化趋势的一致性，通过计算所有代谢物两两之间的pearson相关系数来分析各个代谢物间的相关性。在正离子模式下，结果如图22所示，n-乙酰鸟氨酸与3-羟基-dl-正缬氨酸和4-胍基丁酸成负相关，与1,3-二甲基脲嘧啶和(1h-吲哚-3-基)(2,2,3,3-四甲基环丙基)成正相关；在负离子模式下，结果如图23所示，二十二碳六烯酸与山梨醇酐三硬脂酸酯成正相关；甘氨胆酸与去氧皮质酮，脂多糖18:0，和17α-羟基黄体酮成正相关；肌苷与二苯甲酰硫胺素成正相关。
[0081]
绘制气泡图确定差异代谢物中显著富集的kegg通路来确定差异代谢物行使的主要生物学功能。在正离子模式下，结果如图24所示，差异代谢物在味觉传导通路和cmap信号通路通路中显著富集。在负离子模式下，结果如图25所示，差异代谢物在甾类激素合成通路
和脂肪酸生物合成通路中显著富集。
[0082]
利用pearson相关性分析对10个差异菌属(top10)和20个差异代谢物(top20)进行分析，得出菌属与代谢物之间的相关性结果如图26-27所示，其中npc组富集的差异菌属与npc组富集的差异代谢物成正相关，而与pc组富集的差异代谢物成负相关，这表明肠道菌群与宿主代谢相互作用高度一致。
[0083]
由实施例4和实施例5的结果分析表明，采用本发明所述的方法能够改变婴儿肠道菌群的组成。肠道微生物群是能量获取的关键中介，可以将食物转化为宿主的营养，而与肥胖相关的肠道微生物群从饮食中获取能量的能力更强。在肥胖个体中，微生物组组成有明显变化，如faecalibacterium的含量明显下降，npc组中faecalibacterium丰度显著低于pc组，因此本发明所述的方法可能降低婴儿今后肥胖的风险。
[0084]
faecalibacterium，alistipes，bifidobacterium丰度降低与患哮喘等特应性喘息疾病风险增加密切相关。研究表明faecalibacterium存在潜在的免疫调节机制，能够产生具有抗炎特性的细菌代谢物——丁酸盐，能够降低呼吸道炎症。bifidobacterium作为婴儿肠道中最丰富的细菌之一，已被证明通过体外和体内的表面相关分子和微生物群衍生代谢物调节个体的全身免疫反应。婴儿双歧杆菌的肠道定植可调节th1和th2反应之间的平衡，从而减少诱导小鼠模型中特应性哮喘的症状，不仅如此肠道丰度较高的双歧杆菌和拟杆菌的小鼠通过增强的cd8 t细胞和调节良好的巨噬细胞反应来提高流感存活率，从而防止过多的气道中性粒细胞流入。因此本发明所述的方法能够预防和降低婴儿呼吸道疾病的风险。
[0085]
pc组中能量代谢显著增加，其在控制脂肪的生成和调节碳水化合物代谢中十分重要，能够降低婴儿肥胖的风险。pc组中果糖与甘露糖代谢显著降低，可降低婴儿患肠易激综合征的风险。
[0086]
pc组中类固醇激素生物合成通路中的四氢可的松和脂肪酸生物合成通路中的月桂酸浓度降低，其与婴幼儿肥胖和高胆固醇有关。因此本发明所述的方法能够降低婴幼儿发生肥胖的风险。
[0087]
pc组中不饱和脂肪酸生物合成通路中的二十二碳六烯酸和脂肪酸生物合成通路(中的癸酸浓度增加，其与婴幼儿神经系统的发育(如：抗癫痫)和抗炎作用有关。因此本发明所述的方法有利于婴幼儿生长发育。
[0088]
pc组婴幼儿体内n-乙酰鸟氨酸浓度高，n-乙酰鸟氨酸是精氨酸酶合成的中间物质，其缺乏会增加患精氨酸酶缺乏症的风险。精氨酸是婴幼儿体内的非必需氨基酸，婴幼儿体内的精氨酸以及精氨酸代谢物会在体内堆积后出现神经毒性作用，引起精氨酸酶缺乏症的现象，婴幼儿在早期时会出现神经运动发育退化，导致生长发育迟缓，还可能会引起共济失调，婴幼儿也可能会出现癫痫发作，引起强直阵挛的现象，对婴幼儿的身体造成影响。
[0089]
pc组婴幼儿体内二十二碳六烯酸的含量更高，二十二碳六烯酸被誉为“脑黄金”，是婴幼儿十分重要的营养物质之一，对婴幼儿的智力发育和视觉功能的完善至关重要。不仅如此二十二碳六烯酸与山梨醇酐三硬脂酸酯成正相关，其在降低胆固醇水平方面具有重要作用。
[0090]
综上所述，本发明所述的方法，通过使婴幼儿在生命早期接触宠物，可以明显的改善婴幼儿肠道菌群的组成，还可以促进婴幼儿大脑及神经系统的发育。
[0091]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0092]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一种改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，其特征在于，所述方法为使婴幼儿每天与宠物接触。2.根据权利要求1所述的改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，其特征在于，所述宠物为带毛宠物。3.根据权利要求2所述的改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，其特征在于，所述带毛宠物为猫科宠物和/或犬科宠物。4.根据权利要求1所述的改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，其特征在于，所述与宠物接触的方式为和宠物处于同一房间内。5.根据权利要求4所述的改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，其特征在于，所述接触的时间为12-16h。6.根据权利要求4所述的改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，其特征在于，所述接触还包括对宠物进行抚摸和/或拥抱。

技术总结
本发明涉及一种改善婴幼儿肠道微生物及促进大脑及神经系统发育的方法，所述方法为使婴幼儿每天与宠物接触。本发明所述的方法，通过使婴幼儿在生命早期接触宠物，可以明显的改善婴幼儿肠道菌群的组成，还可以促进婴幼儿大脑及神经系统的发育。脑及神经系统的发育。


技术研发人员：陈历俊 杨迪 赵军英 范小菲 刘彦品 乔为仓
受保护的技术使用者：北京三元食品股份有限公司
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/11