一种靶向ARHGAP36促进同质CIC形成抑制乳腺肿瘤生长的方法

一种靶向arhgap36促进同质cic形成抑制乳腺肿瘤生长的方法
技术领域
1.本发明属于乳腺癌靶向治疗领域，具体为一种靶向arhgap36促进同质cic结构形成抑制乳腺肿瘤生长的方法。


背景技术：

2.乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，因此，针对乳腺癌患者制定合理的协同治疗方案仍然是该领域研究的难点和热点。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，通过靶向增强arhgap36基因表达促进hocic结构形成，达到抑制乳腺肿瘤生长的目的。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.本发明的一方面提供一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，是通过促进靶细胞中arhgap36基因的表达来实现的，具体是通过靶向增强arhgap36基因表达促进hocic结构形成，从而得到所述hocic细胞模型，所述hocic结构形成可以抑制乳腺肿瘤生长的目的。具体的，所述arhgap36基因在染色体的位置为xq26.1，包含12个外显子，gene id为158763，其核苷酸序列如genebank：nc_000023.11的第131058346-131089885所示。
6.具体的，所述靶细胞为乳腺癌细胞。所述促进靶细胞arhgap36基因的表达的方法可以是本文所述的通过病毒感染的方式，也可以是通过其它的方法促进该基因的表达。靶细胞可以是arhgap36基因表达或功能缺失的细胞。
7.所述靶细胞也可为arhgap36低表达的细胞系或单克隆细胞系。
8.进一步地，在上述方法中，靶细胞为arhgap36基因有效表达的细胞。具体的，所述靶细胞为通过qpcr或western blot检测出arhgap36的mrna或蛋白表达量高的细胞，比如：可以是通过qpcr或western blot检测出arhgap36的mrna或蛋白表达量高的细胞。
9.在本发明的具体实施方式中，所述靶细胞具体为mda-mb-436-2细胞(简称mm436-2细胞)，所述mm436-2细胞为发明人所在实验室通过有限稀释法筛选出来的乳腺癌mda-mb-436细胞系的单克隆细胞系。
10.进一步地，促进所述靶细胞中arhgap36基因的表达可通过如下方式实现：促进所述靶细胞中arhgap36基因的五个转录本中除isoform1(iso1，uniprotkb:q6zri8-1)之外剩余四个转录本中至少一个的表达，所述arhgap36基因的四个转录本为isoform2(iso2，uniprotkb:q6zri8-2)、isoform3(iso3，uniprotkb:q6zri8-3)、isoform4(iso4，uniprotkb:q6zri8-4)以及isoform5(iso5，uniprotkb:q6zri8-5)。
11.在本发明的具体实施方式中，促进所述靶细胞中arhgap36基因的四个转录本iso2、iso3、iso4或iso5中任意一个转录本的重组载体表达是通过病毒感染实现的；其中，
所述重组表达载体以逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1为骨架，将arhgap36基因的iso2，iso3、iso4或iso5四个转录本中任意一种的蛋白编码区(sequence coding for amino acids in protein，cds)插入到pqcxip-egfp-n1的酶切位点xho i和bamhi之间，得到arhgap36基因不同转录本iso2、iso3、iso4或iso5的重组表达载体；通过hek293ft细胞包装生产逆转录病毒颗粒，将表达基因的逆转录病毒颗粒分别感染靶细胞并通过嘌呤霉素(puromycin)筛选阳性细胞，即可实现靶细胞中过量表达arhgap36基因。
12.本发明的另一方面提供了一种arhgap36诱导hocic细胞模型，由上述任意一种方法得到，所述hocic细胞模型能抑制乳腺肿瘤生长。如在琼脂糖凝胶悬浮培养获得或者通过悬浮后贴壁培养获得，通过促进arhgap36表达，诱导hocic结构形成，从而抑制乳腺肿瘤生长。
13.本发明的还一方面提供了一种检测hocic细胞模型的方法，能通过如下技术手段实现：通过收集悬浮培养的靶细胞、甩片、显微拍照后统计hocic形成率；或通过活细胞工作站长时程地拍摄经过悬浮后又贴壁培养的靶细胞，观察统计hocic形成率。
14.在本发明的具体实施方式中，是通过收集悬浮培养6h之后的乳腺肿瘤细胞，进一步甩片、染色，显微拍照后统计hocic结构形成率实现的。
15.本发明的又一方面提供一种arhgap36诱导hocic细胞模型在如下任一中的应用：
16.(1)通过所述hocic细胞模型评价待测物对肿瘤发生或疾病进程的影响；
17.(2)利用所述hocic细胞模型评价待测物的生物安全性；
18.(3)利用所述hocic细胞模型建立肿瘤治疗方法；
19.(4)通过或借助所述hocic细胞模型建立动物模型。
20.上述待测物可以是：化合物、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等。
21.本发明还提供一种以arhgap36作为靶点在如下的应用：以arhgap36为靶点制备肿瘤治疗药物。
22.与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
23.1、本发明提供一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，通过靶向增强arhgap36基因表达促进hocic结构形成，达到抑制乳腺肿瘤生长的目的。此技术方法的建立和应用为乳腺肿瘤的治疗提供了新靶点，并为发展新型乳腺肿瘤治疗策略奠定基础。
24.2、过表达arhgap36能够诱导hocic结构形成，该结构的形成可以抑制乳腺肿瘤细胞的克隆形成能力。并且，过表达arhgap36可以显著抑制小鼠体内乳腺肿瘤细胞移植瘤的形成。
25.3、本发明提供了一种靶向arhgap36促进同质cell-in-cell结构形成抑制乳腺肿瘤生长的方法。本发明所研究的arhgap36对同质cell-in-cell结构形成具有正向调控作用，提高arhgap36基因的表达水平可以促进同质cell-in-cell结构形成率。依据arhgap36上述作用，应用体外克隆形成模型和体内小鼠移植瘤模型研究显示，通过靶向arhgap36促进同质cell-in-cell结构形成过程，可以达到抑制乳腺肿瘤生长的目的。本发明提供的方法为靶向干预arhgap36和同质cell-in-cell发展新的肿瘤治疗策略提供新的靶标分子和理论依据。
附图说明
26.图1为在乳腺癌细胞中过表达arhgap36(gap36)促进hocic结构形成。a：hocic结构的免疫荧光示意图，比例尺10μm。b：实时荧光定量pcr检测乳腺癌细胞mm436-2中arhgap36不同转录本的相对mrna表达水平。c：乳腺癌细胞中不同arhgap36转录本表达之后hocic结构形成率的统计结果。
27.图2为arhgap36抑制乳腺癌细胞的增殖。a：显微镜下细胞计数法统计arhgap36过表达对乳腺癌细胞mm436-2增殖的影响。b：cck-8试剂盒测定吸光度法统计arhgap36过表达对乳腺癌细胞mm436-2增殖的影响。c：实时细胞分析监测arhgap36过表达对乳腺癌细胞mm436-2增殖的影响。
28.图3为arhgap36通过促进hocic形成抑制乳腺癌细胞克隆形成能力。a：image j处理后的碘硝基四氮唑氯化铵染色mm436-2克隆图片。b：y27632(y27)处理抑制hocic结构形成前后对照组(mm436-2-nc)和实验组(mm436-2-gap36-iso2)克隆数目的统计结果。c：y27处理抑制hocic结构形成前后对照组(mm436-2-nc)和实验组(mm436-2-gap36-iso2)克隆面积的统计结果。d：y27处理前后对照组(mm436-2-nc)和实验组(mm436-2-gap36-iso2)hocic结构形成率。
29.图4为arhgap36抑制小鼠体内乳腺移植瘤的生长。a：对照组(mm436-2-nc)和实验组(mm436-2-gap36-iso2)移植瘤对比。b：对照组(mm436-2-nc)和实验组(mm436-2-gap36-iso2)移植瘤体积统计结果。
具体实施方式
30.为详细说明本发明的技术内容，所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详细说明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实际上，这些发明可以以多种不同的形式来实施并且不应将其解读为受限于本文所述的实施方式，而提供这些实施方式是为了使本公开满足适用的法律要求。此外应理解，在阅读了本发明的授权之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围
31.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
32.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.同质cell-in-cell(homotypiccell-in-cell，hocic)结构作为一种一个或多个活细胞存在于另一细胞内的独特细胞结构，其常见于乳腺癌患者组织中。作为肿瘤细胞间的一种竞争方式，hocic可以介导内部细胞发生entosis形式的细胞死亡，与肿瘤的发生发展以及预后密切相关，是调节肿瘤进化的重要机制和潜在治疗靶标。因此，靶向干预hocic形成有望达到抑制乳腺肿瘤生长的目的。
34.arhgap36作为rho gtp酶激活蛋白(rhogtpase activatingproteins,rhogaps)家族的一员，关于其功能的研究报道相对较少。arhgap36被发现在多种人类肿瘤中表达上调，并且其高表达是乳腺癌患者预后的正向因素。提示，arhgap36在乳腺癌发生发展过程中起到关键作用，但是其对乳腺肿瘤生长的作用以及其是否通过调控hocic结构形成在乳腺癌发生发展中起作用有待进一步研究。
35.本发明实施方式一提供一种靶向arhgap36促进同质cic结构形成抑制乳腺肿瘤生
长的方法，是通过促进靶细胞中arhgap36基因的表达来实现的，具体是通过靶向增强arhgap36基因表达促进hocic结构形成，从而得到所述hocic细胞模型，所述hocic结构形成可以抑制乳腺肿瘤生长的目的。具体的，所述arhgap36基因在染色体的位置为xq26.1，包含12个外显子，gene id为158763，其核苷酸序列如genebank：nc_000023.11的第131058346-131089885所示。
36.进一步地，在上述方法中，靶细胞为arhgap36基因有效表达的细胞。具体的，所述靶细胞为通过qpcr或western blot检测出arhgap36的mrna或蛋白表达量高的细胞，比如：可以是通过qpcr或western blot检测出arhgap36的mrna或蛋白表达量高的细胞。
37.在本发明的具体实施方式中，所述靶细胞具体为mda-mb-436-2细胞(简称mm436-2细胞)，所述mm436-2细胞为发明人所在实验室通过有限稀释法筛选出来的乳腺癌mda-mb-436细胞系的单克隆细胞系。
38.进一步地，促进所述靶细胞中arhgap36基因的表达可通过如下方式实现：促进所述靶细胞中arhgap36基因的五个转录本中除isoform1(iso1，uniprotkb:q6zri8-1)之外剩余四个转录本中至少一个的表达，所述arhgap36基因的四个转录本为isoform2(iso2，uniprotkb:q6zri8-2)、isoform3(iso3，uniprotkb:q6zri8-3)、isoform4(iso4，uniprotkb:q6zri8-4)以及isoform5(iso5，uniprotkb:q6zri8-5)。
39.在本发明的具体实施方式中，促进所述靶细胞中arhgap36基因的四个转录本iso2、iso3、iso4或iso5中任意一个转录本的重组载体表达是通过病毒感染实现的；其中，所述重组表达载体以逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1为骨架，将arhgap36基因的iso2，iso3、iso4或iso5四个转录本中任意一种的蛋白编码区(sequence coding for amino acids in protein，cds)插入到pqcxip-egfp-n1的酶切位点xho i和bamhi之间，得到arhgap36基因不同转录本iso2、iso3、iso4或iso5的重组表达载体；通过hek293ft细胞包装生产逆转录病毒颗粒，将表达基因的逆转录病毒颗粒分别感染靶细胞并通过嘌呤霉素(puromycin)筛选阳性细胞，即可实现靶细胞中过量表达arhgap36基因。
40.本发明实施方式二提供了一种arhgap36诱导hocic细胞模型，由上述任意一种方法得到，所述hocic细胞模型能抑制乳腺肿瘤生长。具体的，通过促进arhgap36表达，诱导hocic结构形成，从而抑制乳腺肿瘤生长。
41.本发明实施方式三提供了一种检测hocic细胞模型的方法，能通过如下技术手段实现：通过收集悬浮培养的靶细胞、甩片、显微拍照后统计hocic形成率；或通过活细胞工作站长时程地拍摄经过悬浮后又贴壁培养的靶细胞，观察统计hocic形成率。
42.在本发明的具体实施方式中，是通过收集悬浮培养6h之后的乳腺肿瘤细胞，进一步甩片、染色，显微拍照后统计hocic结构形成率实现的。
43.本发明实施方式四提供一种arhgap36诱导hocic细胞模型在如下任一中的应用：
44.(1)通过所述hocic细胞模型评价待测物(如化合物、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)对肿瘤发生或疾病进程的影响；
45.(2)利用所述hocic细胞模型评价待测物(如特定化合物、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)的生物安全性；
46.(3)利用所述hocic细胞模型建立肿瘤治疗方法；
47.(4)通过或借助所述hocic细胞模型建立动物模型。
48.本发明实施方式五提供一种以arhgap36作为靶点在如下的应用：以arhgap36为靶点制备肿瘤治疗药物。
49.以下提供具体实施例。
50.实施例1、过表达arhgap36诱导cic细胞模型的建立
51.一、试剂和材料
52.mda-mb-436-2(mm436-2)细胞：发明人在实验室通过有限稀释法筛选分离mda-mb-436细胞得到的单克隆细胞株。有限稀释法是一种常用的克隆方法。
53.pcdna-harhgap36-(iso1-iso5)质粒：斯坦福大学james k.chen馈赠。
54.pcmv-vsv-g质粒：addgene，#8454。
55.gag/pol质粒：addgene，#14887。
56.pqcxip-egfp-n1质粒：记载于“wang m,ning x,chen a,huang h,ni c,zhou c,et al.impaired formation of homotypic cell-in-cell structures in human tumor cells lacking alpha-catenin expression.scientific reports.2015；5:12223”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实施例实验使用。
57.二、mm436-2-arhgap36(iso1-iso5)过表达细胞系的建立
58.(1)构建逆转录病毒表达质粒pqcxip-arhgap36(isoforms)-egfp
59.首先依据arhgap36的5个转录本分别设计两端携带酶切位点xho i和bgl ii(与bamh i为同尾酶)的上下游引物(下游引物相同)，序列如表1所示：
60.表1.arhgap365个转录本的上下游引物序列
[0061][0062][0063]
之后以pcdna-harhgap36-(iso1-iso5)为模板进行pcr扩增得到arhgap36各个转录本的片段，参照q5超保真dna聚合酶(neb，m0491s)推荐条件和步骤进行实施。同时，应用xhoi和bamhi两个限制性内切对载体pqcxip-egfp-n1进行酶切，得到线性化的载体片段。应用t4 dna连接酶将arhgap36各个转录本和线性化载体片段进行连接，具体实施步骤参照t4(m0203s neb)说明书。之后将连接质粒转化至感受态细胞，随后涂板，挑选单克隆测序。将测序结果正确的菌液扩大培养，随后进行质粒提取并放置于-20℃存储备用。
[0064]
(2)pqcxip-arhgap36(isoforms)-egfp逆转录病毒包装
[0065]
病毒包装前一天将hek 293ft细胞按照1
×
106个/孔的密度均匀铺在预先包被过鼠尾胶原的六孔板中。以gag/pol和vsvg-r为包装质粒，参照lipofectamine 2000(thermo，11668-019)说明书进行对照质粒和arhgap365个转录本的病毒包装，分别收集24h和48h的
病毒，将两个时间点的病毒混合离心过滤，之后用于感染目的细胞。
[0066]
(3)逆转录病毒感染mm436-2细胞系
[0067]
病毒感染前一天将适量待感染细胞mm436-2均匀铺在6孔板中。次日，将已包装好的1ml逆转录病毒、0.5ml dmem完全培养基和1.5μl polybrene混合后加入弃去培养基的6孔板中。隔天更换完全培养基，使细胞正常生长。细胞正常生长次日更换含有终浓度为1μg/ml puromycin的完全培养基，筛选含有arhgap36各个转录本的阳性细胞克隆。
[0068]
(4)实时荧光定量pcr检测arhgap36各转录本的表达水平
[0069]
提取相同数目的mm436-2 nc细胞和mm436-2-arhgap36(iso1-iso5)细胞的总rna。然后，应用全式金的反转录试剂盒transscript one-step gdna removal and cdna synthesis supermix(全式金，at311)将rna反转录成cdna，具体步骤完全按照说明书操作。随后应用sybr green realtime pcr master mix(toyobo，qpk-201)进行rt-pcr体系配置，即4.5μl sybr green master mix、0.25μl 10μm forward primer、0.25μl 10μm reverse primer、0.5μl cdna、4μl ddh2o，混匀上述体系，放入实时荧光定量pcr仪(abi 7500)反应。使用2-δδct法计算各细胞内基因的相对mrna水平。实时荧光定量pcr引物如表2所示，其中hprt为内参基因。
[0070]
表2.实时荧光定量pcr引物
[0071][0072]
三、hocic结构形成实验
[0073]
将适量构建好的对照组细胞和arhgap36各个转录本细胞分别接种于铺有1ml 0.5％的琼脂糖凝胶(已室温凝固)的12孔板中，37℃悬浮培养6h。转移细胞悬液至新的离心管中1000rpm离心3min弃上清，之后加入适量pbs将细胞适当吹打成单细胞悬液。应用离心甩片机(美国wescor，cytopro 7620)400rpm离心3min，将细胞甩至粘附载玻片上。取出粘附载玻片放置于装有4％多聚甲醛的立式染缸中，常温固定10min。结束后用pbs洗涤，用纸巾擦拭干净载玻片上细胞周围的液体，向细胞滴加20ul含dapi的封片剂。最后，将盖玻片覆盖封片剂封片结束。最后，使用宽场荧光显微镜(nikon rclipse ti)对制备好的片子进行图片采集，随机选取8-10个视野，采用20
×
物镜进行三通道(405、568、dic)拍摄。cic结构形成率统计：统计3个以上的视野，每个视野至少统计200个细胞。cell-in-cell(％)＝形成cell-in-cell的细胞数/总细胞数
×
100的平均值
±
sd
[0074]
hocic结构如图1a所示。统计结果表明，通过病毒包装感染细胞的方法在mm436-2细胞中过表达arhgap36 5个转录本，可以达到过表达的目的(图1b)，并且过表达之后，除arhgap36-iso1对hocic结构形成无显著影响之外，其余4个转录本均可以促进hocic结构形成，而且arhgap36-iso2的这种促进作用最为显著。因此，在本发明实施例后续的研究中仅选用arhgap36-iso2进行。
[0075]
实施例2、arhgap36通过促进hocic形成抑制乳腺癌细胞克隆形成
[0076]
一、试剂和材料
[0077]
y27632：abcam，#ab120129
[0078]
碘硝基氯化四氮唑蓝：solarbio，#i8150
[0079]
二、细胞增殖实验
[0080]
为确定arhgap36表达对乳腺癌细胞增殖的影响，本发明实施例主要采用显微细胞计数、cck-8试剂盒(日本同仁化学，ck04)测定法和实时细胞分析(rtca)icelligence系统(acea biosciences)三种方法进行细胞计数。对于显微镜下细胞计数，mm436-2 nc和mm436-2-arhgap36-iso2细胞以2.5
×
105个细胞/孔的密度接种在6孔板。分别在培养1天(d)、3d和5d后，收集细胞，在显微镜下用血细胞计数板进行计数。对于cck-8试剂盒测定方法，同样用上述两种细胞以3000个/孔的密度接种在96孔板中。具体测定方法参照制造商给的说明书进行，每隔一天评估细胞增殖能力，持续5d。对于rtca方法，上述两种细胞以3000个/孔密度接种，使用集成的微电子传感器阵列，根据制造商的建议，在rtca系统的实时模式下监测60h。每种测量方法均进行三次重复。
[0081]
细胞增殖实验结果如图2所示，其中图2a代表显微镜下细胞计数的结果，图2b代表cck-8试剂盒测定的结果，图2c代表实时细胞分析监测的结果。由图中可知，无论用哪种方法arhgap36过表达都能够抑制乳腺癌细胞mm436-2的增殖。
[0082]
三、乳腺癌细胞克隆形成
[0083]
克隆形成实验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，并且此过程中细胞处于非贴壁状态，可以在一定程度上形成hocic结构。本发明实施例实施过程中，约5000个mm436-2 nc或mm436-2-arhgap36-iso2细胞分别嵌入1ml 0.4％的低熔点琼脂糖中，制成细胞琼脂糖混悬液，之后将混悬液加入事先铺好并凝固的含有0.5％的琼脂糖凝胶六孔板中。待上层混悬液室温凝固后，加入含y27632或不含y27632(10μmol/l)的培养基1ml。次日，对6孔板中的hocic结构形成率进行计数绘图。培养基每3天更换一次，持续3周。最后，弃掉上层培养基，用0.02％碘硝基氯化四氮唑蓝对克隆进行染色，然后用imagej软件进行拍照和定量。对于每个细胞样本的每次处理，分别建立三个重复孔。
[0084]
乳腺癌细胞克隆形成分析结果如图3所示，结合图3a的图片以及图3b的hocic结构形成统计结果以及图3c的克隆数目和克隆面积可知，arhgap36过表达可以显著抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力，而这种抑制作用依赖于hocic结构形成。当用y27632抑制hocic结构形成时，arhgap36对乳腺细胞克隆形成的抑制作用会部分减弱。
[0085]
实施例3、arhgap36抑制小鼠体内乳腺肿瘤生长
[0086]
一、试剂和材料
[0087]
小鼠：北京华阜康
[0088]
雌二醇：sigma，#50-28-2
[0089]
二、小鼠皮下荷瘤
[0090]
本发明实施例实施过程中为了确定在体内条件下arhgap36在对乳腺肿瘤生长的影响，在nod/scid小鼠的下侧皮下两侧分别注射mm436-2 nc和mm436-2-arhgap36-iso2细胞，建立异种移植模型。5-7周龄雌性小鼠(n》8)，分别接种1
×
107mm436-2-arhgap36细胞(右)和相同数量的对照mm436-2nc细胞(左)。每3-4d腹腔注射雌二醇(1mg/ml)40μl。每周用
数字卡尺测量肿瘤长度和宽度2-3次，肿瘤体积用公式计算，体积(mm3)＝l
×
w2/2(长度l,mm；宽度w,mm)。七周后，小鼠被处死，肿瘤被收集、称重并拍照。
[0091]
arhgap36对小鼠体内乳腺癌细胞移植瘤生长的影响如图4所示，由图4a小鼠体内肿瘤实体图和4b肿瘤体积统计结果可知，arhgap36过表达可以显著抑制小鼠皮下移植乳腺肿瘤的生长。
[0092]
需要说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，通过促进靶细胞中arhgap36基因的表达来实现。2.根据权利要求1所述的一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，所述靶细胞为arhgap36基因有效表达的细胞。3.根据权利要求2所述的一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，所述靶细胞为乳腺癌细胞。4.根据权利要求1所述的一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，促进靶细胞arhgap36基因的表达的方法可以是通过病毒感染的方式，或者是通过其它的方法促进该基因的表达。5.根据权利要求4所述的一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，所述靶细胞可以是arhgap36基因表达或功能缺失的细胞；所述靶细胞也可为arhgap36低表达的细胞系或单克隆细胞系。6.根据权利要求1或2所述的一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，促进所述靶细胞中arhgap36基因的表达可通过如下方式实现：促进所述靶细胞中arhgap36基因的五个转录本中除isoform1(iso1，uniprotkb:q6zri8-1)之外剩余四个转录本中至少一个的表达，所述arhgap36基因的四个转录本为isoform2(iso2，uniprotkb:q6zri8-2)、isoform3(iso3，uniprotkb:q6zri8-3)、isoform4(iso4，uniprotkb:q6zri8-4)以及isoform5(iso5，uniprotkb:q6zri8-5)。7.根据权利要求1所述的一种arhgap36诱导hocic细胞模型的制备方法，其特征在于，促进所述靶细胞中arhgap36基因的四个转录本iso2、iso3、iso4或iso5中任意一个转录本的重组载体表达是通过病毒感染实现的；其中，所述重组表达载体以逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1为骨架，将arhgap36基因的iso2，iso3、iso4或iso5四个转录本中任意一种的蛋白编码区(sequence coding for amino acids in protein，cds)插入到pqcxip-egfp-n1的酶切位点xho i和bamhi之间，得到arhgap36基因不同转录本iso2、iso3、iso4或iso5的重组表达载体；通过hek293ft细胞包装生产逆转录病毒颗粒，将表达基因的逆转录病毒颗粒分别感染靶细胞并通过嘌呤霉素(puromycin)筛选阳性细胞，即可实现靶细胞中过量表达arhgap36基因。8.一种由权利要求1-7任一种方法得到的hocic细胞模型，所述hocic细胞模型能抑制乳腺肿瘤生长。9.一种如权利要求8所述的hocic细胞模型在如下任一中的应用：1)通过所述hocic模型评价待测物对肿瘤发生发展的作用；2)将待测物靶向hocic模型评价待测物的生物安全性；3)利用所述hocic模型制备肿瘤治疗药物；4)以arhgap36为靶点制备肿瘤治疗药物；5)通过或借助所述hocic模型建立新的动物模型。10.一种以arhgap36作为靶点在如下的应用：以arhgap36为靶点制备肿瘤治疗药物。

技术总结
本发明提供一种靶向ARHGAP36促进同质cell-in-cell结构形成抑制乳腺肿瘤生长的方法，通过促进靶细胞中ARHGAP36基因的表达来实现。本发明公开了一种靶向ARHGAP36促进同质cell-in-cell结构形成抑制乳腺肿瘤生长的方法。本发明所研究的ARHGAP36对同质cell-in-cell结构形成具有正向调控作用，提高ARHGAP36基因的表达水平可以促进同质cell-in-cell结构形成率。依据ARHGAP36上述作用，应用体外克隆形成模型和体内小鼠移植瘤模型研究显示，通过靶向ARHGAP36促进同质cell-in-cell结构形成过程，可以达到抑制乳腺肿瘤生长的目的。本发明提供的方法为靶向干预ARHGAP36和同质cell-in-cell发展新的肿瘤治疗策略提供新的靶标分子和理论依据。靶标分子和理论依据。靶标分子和理论依据。


技术研发人员：孙强 王晨曦 阮班展 张波
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/11