一种GDF-15检测卡的制备方法及其试剂盒与使用方法与流程

一种gdf-15检测卡的制备方法及其试剂盒与使用方法
技术领域
1.本发明涉及一种gdf-15检测卡的制备方法，属于样本检测技术领域。


背景技术：

2.生长分化因子-15(gdf-15)是一种能够反映心血管功能和疾病的独立炎症生化标志物，与急性冠脉综合征(acs)的发生、发展密切相关，在acs的风险分层方面具有极大价值，其可为acs后患者长期抗血栓治疗提供决策支持。gdf-15敏感性高，在心肌损伤早期即可检出，与传统心肌损伤标志物联合检测时可提升对acs的诊断能力。目前gdf-15的的检测技术有酶联免疫吸附法、电化学发光法，荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法等，其中酶联法、电化学发光法需要大型专业仪器；胶体金层析法方便快捷，可自测读数，但灵敏度不高；荧光免疫层析具有高灵敏度和稳定性，但需配套仪器且不能可视化。申请号为202111345701.5的专利解决了低检出范围、灵敏度不足的问题，但依然需要使用荧光设备进行配合处理，依然存在检出门槛。因此开发一种具有灵敏度高、快速测定、血清、血浆和全血样本中gdf-15检测准确度高、可进行肉眼读出的层析试剂盒及方法具有重要意义。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
4.s1：制备结合垫：将金八面体探针加入gdf-15单克隆抗体1，用bsa封闭后高速离心，用保存液洗涤并重悬，在结合垫上用金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1溶液喷涂微球线，烘干过夜；
5.s2：制备包被膜：分别采用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线和质控线平行划于所述硝酸纤维素膜上进行包被，烘干过夜；
6.s3：制备样品垫：用样品垫处理液浸泡样品垫烘干过夜；
7.s4：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割即得到所述gdf-15检测卡。
8.进一步地，所述步骤s1中的金八面体探针的成份为auno@4-mba，其中，auno为金八面体，@表示拉曼信号分子4-巯基苯甲酸修饰在auno表面。
9.进一步地，所述步骤s1中gdf-15单克隆抗体1的加入量为5～20μg/ml，所述bsa浓度为20％。
10.进一步地，所述步骤s3中样品垫处理液成份为0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl。
11.进一步地，所述检测线中gdf-15单克隆抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠igg抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
12.进一步地，所述gdf-15单克隆抗体1溶液成份为缓冲液和gdf-15单克隆抗体，所述微球稀释液成份为1％bsa、2％蔗糖的20～100mm，ph7.5～8.5，缓冲液：gdf-15单克隆抗体
＝1：(4～10)。
13.进一步地，本发明还提供所述金八面体探针的制备方法，其包括以下步骤：
14.a1：合成金纳米棒：磁力搅拌下将氯金酸加入到的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，加入硼氢化钠溶液溶解，搅拌后放置30min；
15.a2：制备生长液：将ctab和油酸钠加入到超纯水中溶解，注入氯金酸溶液，溶液呈无色后加入硝酸银溶液，搅拌后加入盐酸及抗坏血酸，反应后加入种子溶液，反应混合物静止12小时，离心清洗后在超纯水中进行分散；
16.a3：金纳米八面体的合成：ctab和氯金酸混合，在60℃水浴条件下加热，加入3-丁烯酸，反应为无色后加入金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时得到金八面体溶液；
17.a4：拉曼信号分子的修饰：向金八面体溶液中加入4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时，离心去除多余的4-mba，重悬于纯水中。
18.本发明还提供一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
19.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
20.采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：
21.(1)采用4-mba标记的金八面体探针标记的抗gdf-15的单克隆抗体，该免疫复合物将被固定在硝酸纤维素膜上的另一个抗gdf-15的单克隆抗体捕获，借助拉曼光谱仪读取检测线的特征峰强度或者根据显色强度，样品检测灵敏度高，可根据显色直接判读阴阳性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
22.(2)本发明利用较易制备的金纳米棒做核心，生长为金纳米八面体，可简便的制备出具有极强拉曼增强作用的金属基底，且制作工艺更为稳定、便捷，使高灵敏拉曼试纸条的产业化成为可能。
23.(3)本发明采用的纳米探针为金八面体探针，具有表面增强拉曼散射现象(sers)。与传统的生物分析方法相比，sers具有独特的生物分析优势，包括：高的灵敏度；与荧光相比，它具有抗光漂白和抗光降解的能力，适合于长期的监测；光谱的带宽窄,拉曼特征峰通常非常窄，比有机染料或量子点的荧光发射峰宽窄10-100倍。
附图说明
24.为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
25.图1为金八面体探针透射电镜图；
26.图2为本发明的gdf-15检测卡的结构示意图；
27.图3为拉曼特征峰平均值标准曲线；
28.图4为浓度检测结果的线性分析。
29.图5为试纸肉眼观测照片。
30.附图标记为：底衬1、包被膜2、检测线21、质控线22、结合垫3、样品垫4、吸水纸5。
具体实施方式
31.为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
33.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
35.在本发明实施例的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，或者是本领域技术人员惯常理解的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
36.在本发明实施例的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
37.(实施例1)
38.本实施例的一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
39.s1：制备结合垫3：对金八面体探针按照20μg/ml加入gdf-15单克隆抗体1，混匀，静置反应10min，加入10μl/ml的20％bsa封闭后，混匀，静置反应5min，10000rpm离心10min，用含1％bsa的20mm、ph8.0 pbs缓冲液洗涤并重悬至原体积的20％，在结合垫上用金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1含0.5％tween-20,2％bsa、5％蔗糖的20mm、ph8.0 pbs缓冲液微球稀释液稀释4倍均匀喷涂一条线，用量为2μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜37度烘干过夜；
40.s2：制备包被膜2：分别用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用含2.5％海藻糖的10mm pb包膜液将gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体调整浓度到0.5mg/ml，用量为0.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
41.s3：制备样品垫4：用含0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl的样品垫处理液靠近结合垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm，37度烘干过夜；
42.s4：在底衬1(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫4(尺寸为23*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫3(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜2(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸5(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的gdf-15检测卡。
43.所述结合垫2上喷涂的金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1的含量为5～20μg抗体/ml金八面体探针。
44.上述检测线包被gdf-15单克隆抗体2(1mg/ml)，质控线包被浓度为1mg/ml的羊抗鼠igg抗体(其中gdf-15单克隆抗体采购南京佰抗生物科技有限公司，羊抗鼠igg抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1μl包被液量/cm膜。
45.所述金八面体探针的制备方法包括：
46.a1：合成金纳米棒：在容器中，磁力搅拌下将250μl 10mm氯金酸加入到9.75ml0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，随后加入0.6ml 10mm的硼氢化钠溶液，搅拌2min后28℃条件下放置30min；
47.a2：生长液：7.2g ctab和0.987g的油酸钠加入到400ml超纯水中溶解，然后将20ml 10mm的氯金酸注入溶液中，当溶液为无色时，加入8ml 10mm的硝酸银溶液，搅拌5min后加入1.2ml的盐酸及600μl 0.1m的抗坏血酸，反应约30s后加入1ml的种子溶液，反应混合物在30℃条件下静止12小时，完成金纳米棒的合成。合成后9000rpm,离心15min,离心清洗2次后，分散在20ml的超纯水中；
48.a3：金纳米八面体的合成：50ml 10mm的ctab和500μl 0.05m的氯金酸混合，60℃水浴条件下加热2min，然后将220μl 3-丁烯酸加入混合物中，当溶液变为无色后加入300μl的金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时；
49.a4：拉曼信号分子的修饰：取5ml的金八面体溶液，向溶液中加入250μl 10-4
m的4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时后离心，去除多余的4-mba，然后重悬于纯水中。完成拉曼信号分子的修饰，即auno@4-mba。
50.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
51.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
52.(实施例2)
53.本实施例的一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
54.s1：制备结合垫3：对金八面体探针按照20μg/ml加入gdf-15单克隆抗体1，混匀，静置反应10min，加入10μl/ml的20％bsa封闭后，混匀，静置反应5min，10000rpm离心10min，用含1％bsa的20mm、ph8.0 pbs缓冲液洗涤并重悬至原体积的20％，在结合垫上用金八面体探
针标记的gdf-15单克隆抗体1含0.5％tween-20,2％bsa、5％蔗糖的20mm、ph8.0 pbs缓冲液微球稀释液稀释10倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜37度烘干过夜；
55.s2：制备包被膜2：分别用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用含2.5％海藻糖的10mm pb包膜液将gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体调整浓度到2mg/ml，用量为1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
56.s3：制备样品垫4：用含0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl的样品垫处理液靠近结合垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm，37度烘干过夜；
57.s4：在底衬1(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫4(尺寸为23*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫3(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜2(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸5(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的gdf-15检测卡。
58.所述结合垫2上喷涂的金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1的含量为20μg抗体/ml金八面体探针。
59.上述检测线包被gdf-15单克隆抗体2(2mg/ml)，质控线包被浓度为2mg/ml的羊抗鼠igg抗体(其中gdf-15单克隆抗体采购南京佰抗生物科技有限公司，羊抗鼠igg抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1.5μl包被液量/cm膜。
60.所述金八面体探针的制备方法包括：
61.a1：合成金纳米棒：在容器中，磁力搅拌下将250μl 10mm氯金酸加入到9.75ml0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，随后加入0.6ml 10mm的硼氢化钠溶液，搅拌2min后28℃条件下放置30min；
62.a2：生长液：7.2g ctab和0.987g的油酸钠加入到400ml超纯水中溶解，然后将20ml 10mm的氯金酸注入溶液中，当溶液为无色时，加入8ml 10mm的硝酸银溶液，搅拌5min后加入1.2ml的盐酸及600μl 0.1m的抗坏血酸，反应约30s后加入1ml的种子溶液，反应混合物在30℃条件下静止12小时，完成金纳米棒的合成。合成后9000rpm,离心15min,离心清洗2次后，分散在20ml的超纯水中；
63.a3：金纳米八面体的合成：50ml 10mm的ctab和500μl 0.05m的氯金酸混合，60℃水浴条件下加热2min，然后将220μl 3-丁烯酸加入混合物中，当溶液变为无色后加入300μl的金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时；
64.a4：拉曼信号分子的修饰：取5ml的金八面体溶液，向溶液中加入250μl 10-4
m的4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时后离心，去除多余的4-mba，然后重悬于纯水中。完成拉曼信号分子的修饰，即auno@4-mba。
65.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
66.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2
次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
67.(实施例3)
68.本实施例的一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
69.s1：制备结合垫3：对金八面体探针按照20μg/ml加入gdf-15单克隆抗体1，混匀，静置反应10min，加入10μl/ml的20％bsa封闭后，混匀，静置反应5min，10000rpm离心10min，用含1％bsa的20mm、ph8.0 pbs缓冲液洗涤并重悬至原体积的20％，在结合垫上用金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1含0.5％tween-20,2％bsa、5％蔗糖的20mm、ph8.0 pbs缓冲液微球稀释液稀释4倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜37度烘干过夜；
70.s2：制备包被膜2：分别用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用含2.5％海藻糖的10mm pb包膜液将gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体调整浓度到0.5mg/ml，用量为1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
71.s3：制备样品垫4：用含0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl的样品垫处理液靠近结合垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm，37度烘干过夜；
72.s4：在底衬1(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫4(尺寸为23*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫3(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜2(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸5(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的gdf-15检测卡。
73.其中，所述样品垫4喷涂有微球线，所述金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1；所述包被膜2上设置有检测线21和质控线22，所述检测线21靠近所述结合垫3，检测线21和质控线22相互平行，间隔距离为5mm；所述检测线21包被有gdf-15单克隆抗体2，质控线22包被有羊抗鼠igg抗体。
74.所述结合垫2上喷涂的金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1的含量为5μg抗体/ml金八面体探针。
75.上述检测线包被gdf-15单克隆抗体2(0.5mg/ml)，质控线包被浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠igg抗体(其中gdf-15单克隆抗体采购南京佰抗生物科技有限公司，羊抗鼠igg抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1.5μl包被液量/cm膜。
76.所述金八面体探针的制备方法包括：
77.a1：合成金纳米棒：在容器中，磁力搅拌下将250μl 10mm氯金酸加入到9.75ml0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，随后加入0.6ml 10mm的硼氢化钠溶液，搅拌2min后28℃条件下放置30min；
78.a2：生长液：7.2g ctab和0.987g的油酸钠加入到400ml超纯水中溶解，然后将20ml 10mm的氯金酸注入溶液中，当溶液为无色时，加入8ml 10mm的硝酸银溶液，搅拌5min后加入
1.2ml的盐酸及600μl 0.1m的抗坏血酸，反应约30s后加入1ml的种子溶液，反应混合物在30℃条件下静止12小时，完成金纳米棒的合成。合成后9000rpm,离心15min,离心清洗2次后，分散在20ml的超纯水中；
79.a3：金纳米八面体的合成：50ml 10mm的ctab和500μl 0.05m的氯金酸混合，60℃水浴条件下加热2min，然后将220μl 3-丁烯酸加入混合物中，当溶液变为无色后加入300μl的金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时；
80.a4：拉曼信号分子的修饰：取5ml的金八面体溶液，向溶液中加入250μl 10-4
m的4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时后离心，去除多余的4-mba，然后重悬于纯水中。完成拉曼信号分子的修饰，即auno@4-mba。
81.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
82.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
83.(实施例4)
84.本实施例的一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
85.s1：制备结合垫3：对金八面体探针按照20μg/ml加入gdf-15单克隆抗体1，混匀，静置反应10min，加入10μl/ml的20％bsa封闭后，混匀，静置反应5min，10000rpm离心10min，用含1％bsa的20mm、ph8.0 pbs缓冲液洗涤并重悬至原体积的20％，在结合垫上用金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1含0.5％tween-20,2％bsa、5％蔗糖的20mm、ph8.0 pbs缓冲液微球稀释液稀释4倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜37度烘干过夜；
86.s2：制备包被膜2：分别用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用含2.5％海藻糖的10mm pb包膜液将gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体调整浓度到0.5mg/ml，用量为0.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
87.s3：制备样品垫4：用含0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl的样品垫处理液靠近结合垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm，37度烘干过夜；
88.s4：在底衬1(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫4(尺寸为23*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫3(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜2(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸5(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的gdf-15检测卡。
89.其中，所述样品垫4喷涂有微球线，所述金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1；所述包被膜2上设置有检测线21和质控线22，所述检测线21靠近所述结合垫3，检测线21和质控线22相互平行，间隔距离为7mm；所述检测线21包被有gdf-15单克隆抗体2，质控线22包被有羊抗鼠igg抗体。
90.所述结合垫2上喷涂的金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1的含量为20μg抗体/ml金八面体探针。
91.上述检测线包被gdf-15单克隆抗体2(0.5mg/ml)，质控线包被浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠igg抗体(其中gdf-15单克隆抗体采购南京佰抗生物科技有限公司，羊抗鼠igg抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为0.5μl包被液量/cm膜。
92.所述金八面体探针的制备方法包括：
93.a1：合成金纳米棒：在容器中，磁力搅拌下将250μl 10mm氯金酸加入到9.75ml0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，随后加入0.6ml 10mm的硼氢化钠溶液，搅拌2min后28℃条件下放置30min；
94.a2：生长液：7.2g ctab和0.987g的油酸钠加入到400ml超纯水中溶解，然后将20ml 10mm的氯金酸注入溶液中，当溶液为无色时，加入8ml 10mm的硝酸银溶液，搅拌5min后加入1.2ml的盐酸及600μl 0.1m的抗坏血酸，反应约30s后加入1ml的种子溶液，反应混合物在30℃条件下静止12小时，完成金纳米棒的合成。合成后9000rpm,离心15min,离心清洗2次后，分散在20ml的超纯水中；
95.a3：金纳米八面体的合成：50ml 10mm的ctab和500μl 0.05m的氯金酸混合，60℃水浴条件下加热2min，然后将220μl 3-丁烯酸加入混合物中，当溶液变为无色后加入300μl的金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时；
96.a4：拉曼信号分子的修饰：取5ml的金八面体溶液，向溶液中加入250μl 10-4
m的4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时后离心，去除多余的4-mba，然后重悬于纯水中。完成拉曼信号分子的修饰，即auno@4-mba。
97.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
98.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
99.(实施例5)
100.本实施例的一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
101.s1：制备结合垫3：对金八面体探针按照20μg/ml加入gdf-15单克隆抗体1，混匀，静置反应10min，加入10μl/ml的20％bsa封闭后，混匀，静置反应5min，10000rpm离心10min，用含1％bsa的20mm、ph8.0 pbs缓冲液洗涤并重悬至原体积的20％，在结合垫上用金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1含0.5％tween-20,2％bsa、5％蔗糖的20mm、ph8.0 pbs缓冲液微球稀释液稀释7倍均匀喷涂一条线，用量为2μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜37度烘干过夜。
102.s2：制备包被膜2：分别用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用含2.5％海藻糖的10mm pb包膜液将gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体调整浓度到2mg/ml，用量为0.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔5mm，置于烘箱
中，45℃烘干过夜；
103.s3：制备样品垫4：用含0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl的样品垫处理液靠近结合垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2μl液量/cm，37度烘干过夜；
104.s4：在底衬1(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫4(尺寸为23*300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫3(尺寸为10*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜2(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸5(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的gdf-15检测卡。
105.所述结合垫2上喷涂的金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1的含量为5～20μg抗体/ml金八面体探针。
106.上述检测线包被gdf-15单克隆抗体2(2mg/ml)，质控线包被浓度为2mg/ml的羊抗鼠igg抗体(其中gdf-15单克隆抗体采购南京佰抗生物科技有限公司，羊抗鼠igg抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为2μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为0.5μl包被液量/cm膜。
107.所述金八面体探针的制备方法包括：
108.a1：合成金纳米棒：在容器中，磁力搅拌下将250μl 10mm氯金酸加入到9.75ml0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，随后加入0.6ml 10mm的硼氢化钠溶液，搅拌2min后28℃条件下放置30min；
109.a2：生长液：7.2g ctab和0.987g的油酸钠加入到400ml超纯水中溶解，然后将20ml 10mm的氯金酸注入溶液中，当溶液为无色时，加入8ml 10mm的硝酸银溶液，搅拌5min后加入1.2ml的盐酸及600μl 0.1m的抗坏血酸，反应约30s后加入1ml的种子溶液，反应混合物在30℃条件下静止12小时，完成金纳米棒的合成。合成后9000rpm,离心15min,离心清洗2次后，分散在20ml的超纯水中；
110.a3：金纳米八面体的合成：50ml 10mm的ctab和500μl 0.05m的氯金酸混合，60℃水浴条件下加热2min，然后将220μl 3-丁烯酸加入混合物中，当溶液变为无色后加入300μl的金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时；
111.a4：拉曼信号分子的修饰：取5ml的金八面体溶液，向溶液中加入250μl 10-4
m的4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时后离心，去除多余的4-mba，然后重悬于纯水中。完成拉曼信号分子的修饰，即auno@4-mba。
112.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
113.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
114.(实施例6)
115.本实施例的一种gdf-15检测卡的制备方法，包括以下步骤：
116.s1：制备结合垫3：对金八面体探针按照20μg/ml加入gdf-15单克隆抗体1，混匀，静置反应10min，加入10μl/ml的20％bsa封闭后，混匀，静置反应5min，10000rpm离心10min，用
巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时后离心，去除多余的4-mba，然后重悬于纯水中。完成拉曼信号分子的修饰，即auno@4-mba。
128.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用上述gdf-15检测卡的制备方法制成。
129.上述gdf-15检测试剂盒的使用方法为，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。
130.其中，实施例1制备的样品sem如图1所示，制备的gdf-15检测卡结构如图2所示。
131.采用实施例1中制备的样品，取抗原校准品用阴性临床样本分别稀释，得到30000，20000，12000，6000，1200，600，25pg/ml每个样品重复测量三次取t线拉曼特征峰均值与校准品浓度建立标准曲线，以抗原浓度和样本信号t线拉曼特征峰平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1：
132.表1gdf-15标准曲线
[0133][0134]
标准曲线如图3所示。其中gdf-15r值分别为0.9985，通过该标线对样品中所含gdf-15浓度进行浓度定量测定。下面对gdf-15检测卡进行性能测试：
[0135]
(1)最低检出限：用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值m与标准差sd，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(m+2sd)，gdf-15结果为21.54pg/ml，符合灵敏度标准25pg/ml。
[0136]
(2)线性范围：分别取gdf-1525～30000pg/ml 7个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值于理论浓度进行线性分析，得到gdf-15线性方程y＝0.9244x+382.29，r＝0.9970，表明本发明的gdf-15检测试剂盒在线性范围内相关性很好。
[0137]
(3)精密度：取三批本实施例的试剂盒，分别检测重复性质控品三批批内cv，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，其中gdf-15120000pg/ml三批批内cv分别为9.29％、7.58％、6.28％，批间cv为9.48％，1200pg/ml三批批内cv分别为7.16％、6.22％、7.95％，批
间cv为9.77％均在10％以内。
[0138]
(4)准确度：选择基础样本的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入不同浓度的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶液，制成基础样本。对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。计算回收率＝(分析样品浓度-基础样品浓度)/加入浓度
×
100％。gdf-15回收样本20000pg/ml的回收率为96.22％，12000pg/ml的回收率为91.49％，平均回收率为93.86％。偏差在10％以内。
[0139]
对实施例1的样品进行连续观察，其t线显色变化为图5。从左到右浓度为30000，20000，12000，6000，1200，600，25，0pg/ml。
[0140]
采集医院检测gdf-15血液样本各100份，用本发明实施例1～6的试剂盒和迈克生物股份有限公司的直接化学发光法检测生长分化因子-15测定试剂盒进行检测比较。本发明试剂盒中，取血液样本80μl加入到检测卡加样孔中，层析10min后通过拉曼光谱仪读取浓度，同一样本分别采用对比系统迈克生物股份有限公司的直接化学发光法的生长分化因子-15测定试剂盒(直接化学发光法)进行浓度检测。对检测结果进行线性分析，如图4所示，其相关性很好，gdf-15r＝0.9850,p》0.05，平均相对偏差小于10％，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。
[0141]
可见，本发明的试剂盒利用稀土纳米荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪，实现了高灵敏度、可准确定量、简便快捷的定量检测gdf-15抗体。
[0142]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：s1：制备结合垫：将金八面体探针加入gdf-15单克隆抗体1，用bsa封闭后高速离心，用保存液洗涤并重悬，在结合垫上用金八面体探针标记的gdf-15单克隆抗体1溶液喷涂微球线，烘干过夜；s2：制备包被膜：分别采用gdf-15单克隆抗体2和羊抗鼠igg抗体作为检测线和质控线平行划于所述硝酸纤维素膜上进行包被，烘干过夜；s3：制备样品垫：用样品垫处理液处理样品垫烘干过夜；s4：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割即得到所述gdf-15检测卡。2.根据权利要求1中所述的一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中的金八面体探针的成份为auno@4-mba，其中，auno为金八面体，@表示拉曼信号分子4-巯基苯甲酸修饰在auno表面。3.根据权利要求1中所述的一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中gdf-15单克隆抗体1的加入量为5～20μg/ml，所述bsa浓度为20％。4.根据权利要求1中所述的一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中样品垫处理液成份为0.5％nacl、0.5％s17、1％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph8.0的tris-hcl。5.根据权利要求1中所述的一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：所述检测线中gdf-15单克隆抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠igg抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。6.根据权利要求1中所述的一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：所述gdf-15单克隆抗体1溶液成份为缓冲液和gdf-15单克隆抗体，所述微球稀释液成份为1％bsa、2％蔗糖的20～100mm，ph7.5～8.5，缓冲液：gdf-15单克隆抗体＝1：(4～10)。7.根据权利要求1～6中任一所述的一种gdf-15检测卡的制备方法，其特征在于：所述金八面体探针的制备方法包括：a1：合成金纳米棒：磁力搅拌下将氯金酸加入到的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)中，加入硼氢化钠溶液溶解，搅拌后放置30min；a2：制备生长液：将ctab和油酸钠加入到超纯水中溶解，注入氯金酸溶液，溶液呈无色后加入硝酸银溶液，搅拌后加入盐酸及抗坏血酸，反应后加入种子溶液，反应混合物静止12小时，离心清洗后在超纯水中进行分散；a3：金纳米八面体的合成：ctab和氯金酸混合，在60℃水浴条件下加热，加入3-丁烯酸，反应为无色后加入金纳米棒，60℃水浴条件下静置12小时得到金八面体溶液；a4：拉曼信号分子的修饰：向金八面体溶液中加入4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液，静置4小时，离心去除多余的4-mba，重悬于纯水中。8.一种gdf-15检测试剂盒，其检测卡采用权利要求1～6中任一所述的一种gdf-15检测卡的制备方法制成。9.根据权利要求8所述的一种gdf-15检测试剂盒的使用方法，其特征在于：取样本80μl点在样品垫上，15分钟后肉眼判读并使用785nm激光的便携式拉曼光谱仪以8.4mw的激光功率、5s积分时间，2次累加次数的检测参数对试纸条的检测线进行拉曼信号的采集，测试；所
述测试过程中使用bwspec4.0软件对原始数据进行基线化、光滑降噪处理，使用origin软件对处理后的数据进行曲线拟合。

技术总结
本发明公开了一种GDF-15检测卡的制备方法及其试剂盒与使用方法，其采用金八面体探针作为标志物，金八面体探针的成份为AuNO@4-MBA，其中，AuNO为金八面体，@表示拉曼信号分子4-巯基苯甲酸修饰在AuNO表面。本发明采用4-MBA标记的金八面体探针标记的抗GDF-15的单克隆抗体，该免疫复合物将被固定在硝酸纤维素膜上的另一个抗GDF-15的单克隆抗体捕获，借助拉曼光谱仪读取检测线的特征峰强度或者根据显色强度，样品检测灵敏度高，可根据显色直接判读阴阳性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。可用于快速检测。可用于快速检测。


技术研发人员：张云 张肖 吴晨 洪茂椿
受保护的技术使用者：厦门稀土材料研究所
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15