一种便隐血粪便样本保存液、测试方法及其保存装置与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种便隐血粪便样本保存液、测试方法及其保存装置。


背景技术：

2.在临床消化道恶性肿瘤早期20%的患者可出现隐血试验阳性，晚期病人的隐血阳性率可达到90%以上，并且可呈持续性阳性；消化道出血、消化道溃疡病人粪便隐血试验多呈间断性阳性；痢疾、直肠息肉、痔疮出血等也可使粪便中出现较多红细胞，导致隐血试验阳性。因此，大便隐血检查可作为检测各种原因所致的消化道出血的重要检测试验。
3.大肠癌（结直肠癌）是常见的恶性肿瘤，和其他恶性肿瘤一样，早期发现、早期治疗是提高大肠癌远期生存率的最有效途径。早期大肠癌手术后5年生存率可高达90%以上，晚期癌则不足10%，可见早期诊治的重要性。普查和筛选是发现早期癌的有效途径，其方法选择上既要考虑敏感性、特异性，又要考虑依从性。目前比较简单、经济、无创而有一定阳性发现的检查方法，首选便隐血（fob）检测。美国癌症学会2006年检测早期癌症指南中建议将fob检测作为50岁以上人群筛查结直肠癌的首选方法。临床研究证实，粪便潜血阳性是早期结直肠癌惟一可以查出的异常现象，所以粪便中微量血红蛋白的检出对其诊断具有十分重要的意义。《中国大肠肿瘤筛查、早诊早治和综合预防共识意见》中将fob检测列为初筛手段。
4.有研究报道，粪便中血红蛋白稳定性差（尤其是粪便样本经样稀提取、稀释后），容易受到各种环境因素影响（如温度、湿度、照射等及各种物理、化学及生物因素），进而降解，致使血红蛋白失去天然结构，导致其抗原特性降低或丧失，使用便隐血检测试剂测试容易出现假阴性现象，影响检测的准确度，失去产品早筛的作用。
5.文献报道，粪便样本中血红蛋白在5℃保存超过7d，20℃保存超过4d，37℃保存4d即出现明显降低，血红蛋白在高温环境中容易出现的不稳定现象，影响检测结果。鉴于此，在设计基于fob的筛选工程时，需要认真考虑使用的环境温度及采样和测试评估之间的时间周期，以尽可能的防止血红蛋白衰减对测试造成的影响。


技术实现要素：

6.本发明目的是针对现有血红蛋白在高温环境中出现的不稳定现象的问题，设计一种便隐血粪便样本保存液、测试方法及其保存装置，适配于便隐血检测试剂胶体金免疫层析法产品，用于粪便样本中血红蛋白的快速筛选测试。本保存液除用于客户即时检测外，可以保证已收集粪便样本中血红蛋白在常规环境下的相对稳定性，可在37℃高温下保存三天且不影响其检测结果。具体采用如下技术方案：
7.一种便隐血粪便样本保存液，包括缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂；保存液还包括糖类、氨基酸和硫代硫酸钠；缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂、糖类、氨基酸和硫代硫酸钠这七种成分的质量比为100：1：0.5：0.01：2：0.1：1。
8.优选的，缓冲液为tris三羟甲基氨基甲烷配制，纯度为分析纯级别，并经盐酸调节ph到7.0
±
0.2，其离子浓度为0.1m/l；
9.保护剂具体为bsa牛血清白蛋白，第五组分，不含脂肪酸，纯度为分析纯级别，其使用浓度为1%w/v；
10.糖类为甘露醇，纯度为分析纯级别，其使用浓度为2%w/v；
11.活性剂为tx-100，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.5%v/v；
12.氨基酸为甘氨酸，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.1%w/v；
13.防腐剂为蛋清溶菌酶，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.01%w/v；
14.硫代硫酸钠，纯度为分析纯级别，其使用浓度为1%w/v。
15.一种便隐血粪便样本保存液的测试方法，步骤包括：
16.s1：首先分别向权利要求1所述的便隐血粪便样本保存液和灭菌生理盐水中加入天然提纯人血红蛋白或人血红蛋白与粪便样本混合或临床阳性样本，测试各样本的实验液， 并利用标准比色卡判定显色等级；
17.s2：各样本分别在2～8℃，20～30℃，37℃的环境下保存21d，测试各样本的实验液，并利用标准比色卡判定显色等级；
18.s3：统计、整理各实验液在3种保存温度环境中1～21d的显色等级，并绘制成图。
19.优选的，步骤s1中测试各样本实验液的具体步骤为：以移液器添加80μl样本到试纸条s孔内，计时5分钟，判读结果。
20.优选的，标准比色卡的数字越大代表试纸条显色越深，其显色等级也越高。
21.一种便隐血粪便样本保存液的保存装置，装置包括塑料上盖、塑料杆、塑料管、塑料底盖；塑料上盖和塑料杆通过螺纹连接，塑料管的上部与塑料杆和塑料上盖连接，塑料管的下部与塑料底盖连接，塑料管内部设置有便隐血样本保存液和便隐血测试条。
22.优选的，保存装置的使用体积为1～2ml/人份，置于2～40℃下保存。
23.与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
24.1、本发明便隐血粪便样本保存液配方合理，所用组分经济、易得，无环境及生物危害性，批量配制容易，可使用常规滤膜过滤除菌，可仅在tris溶液中加入少量盐酸调节ph，适合生物行业批量生产制备；与现有的保存液相比，本保存液配方中的糖类及氨基酸属创新成分，也是本保存液能在高温下保存的关键所在，本发明保存液可以保证粪便样本中血红蛋白在2～8℃保存14d，20～30℃保存7d，37℃保存3d；
25.2、当若收集样本量大，来不及全部检测时候，可以选用本发明的便隐血粪便样本保存液对粪便进行预处理并予常规保存，在3天内测试完毕即可；在即时检测的同时，兼顾样本送检可能遇到的运输条件、时间周期等因素，兼顾我国不同地域温差较大的现实情况，兼顾样本复测的可能预期，兼顾大筛、普查项目无法即时检测的现象等，由此可以很好的保证检测结果的准确性，降低漏检率，提高筛查的检出率；
26.3、本发明在粪便检测预处理中的应用简单，配合保存装置使用更加方便，除医疗机构、体检机构等应用外，可以实现家庭自检。
附图说明
27.图1为本发明实施1-4和对照组在2～8℃温度下在保存液中加入血红蛋白样本的
测定结果图；
28.图2为本发明实施1-4和对照组在2～8℃温度下在保存液中加入人血红蛋白与粪便样本混合的测定结果图；
29.图3为本发明实施1-4和对照组在2～8℃温度下在保存液中加入阳性样本的测定结果图；
30.图4为本发明实施1-4和对照组在室温下在保存液中加入血红蛋白样本的测定结果图；
31.图5为本发明实施1-4和对照组在室温下在保存液中加入人血红蛋白与粪便样本混合的测定结果图；
32.图6为本发明实施1-4和对照组在室温下在保存液中加入阳性样本的测定结果图；
33.图7为本发明实施1-4和对照组在37℃温度下在保存液中加入血红蛋白样本的测定结果图；
34.图8为本发明实施1-4和对照组在37℃温度下在保存液中加入人血红蛋白与粪便样本混合的测定结果图；
35.图9为本发明实施1-4和对照组在37℃温度下在保存液中加入阳性样本的测定结果图；
36.图10为本发明便隐血粪便样本保存液的保存装置的实物图。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，请参阅图1-9。
38.一种便隐血粪便样本保存液，包括缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂；保存液还包括糖类、氨基酸和硫代硫酸钠；缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂、糖类、氨基酸和硫代硫酸钠这七种成分的质量比为100：1：0.5：0.01：2：0.1：1。
39.进一步的，缓冲液为tris三羟甲基氨基甲烷配制，纯度为分析纯级别，并经盐酸调节ph到7.0
±
0.2，其离子浓度为0.1m/l；
40.保护剂具体为bsa牛血清白蛋白，第五组分，不含脂肪酸，纯度为分析纯级别，其使用浓度为1%w/v；
41.糖类为甘露醇，纯度为分析纯级别，其使用浓度为2%w/v；
42.活性剂为tx-100，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.5%v/v；
43.氨基酸为甘氨酸，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.1%w/v；
44.防腐剂为蛋清溶菌酶，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.01%w/v；
45.硫代硫酸钠，纯度为分析纯级别，其使用浓度为1%w/v。
46.实施例1：
47.便隐血样本保存液包含0.1m/l tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液（ph为7.0
±
0.2），其中包含1%牛血清白蛋白（w/v）、0.5% tx-100活性剂（v/v）、0.01%蛋清溶菌酶（w/v）。
48.实施例2：
49.便隐血样本保存液包含0.1m/l tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液（ph为7.0
±
0.2），其中包含1%牛血清白蛋白（w/v）、0.5% tx-100活性剂（v/v）、0.01%蛋清溶菌酶（w/v）以及2%甘露醇（w/v）
50.实施例3：
51.便隐血样本保存液包含0.1m/l tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液（ph为7.0
±
0.2），其中包含1%牛血清白蛋白（w/v）、0.5% tx-100活性剂（v/v）、0.01%蛋清溶菌酶（w/v）以及2%甘露醇（w/v）、0.1%甘氨酸（w/v）。
52.实施例4：
53.便隐血样本保存液包含0.1m/l tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液（ph为7.0
±
0.2），其中包含1%牛血清白蛋白（w/v）、0.5% tx-100活性剂（v/v）、0.01%蛋清溶菌酶（w/v）以及2%甘露醇（w/v）、0.1%甘氨酸（w/v）、1%硫代硫酸钠（w/v）。
54.对照组：
55.便隐血样本保存液包含0.9%氯化钠溶液（生理盐水），经高压灭菌。
56.为了检测实施例1-4和对比例的便隐血粪便样本保存液对血红蛋白保存的效果，将实施例1-4和对比例的保存液进行测试。
57.s1：首先分别向便隐血粪便样本保存液和灭菌生理盐水中加入天然提纯人血红蛋白或人血红蛋白与粪便样本混合或临床阳性样本，测试实施例1-4的保存液，并利用标准比色卡判定显色等级；
58.s2：各样本分别在2～8℃，20～30℃，37℃的环境下保存21d，测试各样本的实验液，并利用标准比色卡判定显色等级；
59.s3：统计、整理各实验液在3种保存温度环境中1～21d的显色等级，并绘制成图。根据上述方法测定了实施例1-4和对比例的便隐血测试结果，结果统计如图1-9和表1所示，可以看出实施例1-4对血红蛋白均有一定保护效果，经分析、测试、调试、验证，实施例4对血红蛋白在不同保存温度条件下的保护效果最好，可以满足本发明的技术要求指标即在2～8℃保存14d，20～30℃保存7d，37℃保存3d。
[0060][0061]
表1 实施例1-4和对比例在不同保存温度下的检测结果表
[0062]
对于便隐血粪便样本保存液保存装置的应用，本发明提供了两个实施例，具体如下：
[0063]
实施例5
[0064]
如图10所示，一种便隐血粪便样本保存液保存装置，装置包括塑料上盖、塑料杆、塑料管、塑料底盖；塑料上盖和塑料杆通过螺纹连接，塑料管的上部与塑料杆和塑料上盖连接，塑料管的下部与塑料底盖连接，塑料管内部设置有便隐血样本保存液1～2ml，还设置有便隐血测试条。
[0065]
便隐血粪便样本保存液保存装置，包括实施例4的便隐血粪便样本保存液以及盛放保存液的保存装置，保存装置可以是粪便采集管、粪便保存管、粪便提取管或者实验用pe管，保存装置的作用是为了盛放保存液以及待测粪便样本。使用时，直接收集或者取新鲜粪便按照25
±
5mg∶1.5ml的比例加入到粪便样本保存装置中混匀，放置于常规条件下保存，保存效果与统计图的结果一致，可以将粪便样本中的血红蛋白有效保存，可以保证粪便样本中血红蛋白在2～8℃保存14d，20～30℃保存7d，37℃保存3d。
[0066]
需要说明的是，若是常规保存装置一般会有相应刻度，使用时按照刻度指示收集均可，稍有偏差不会影响其保存效果及测试结果，本实施例的25
±
5mg∶1.5ml是为了实验室检测的确定性设置的相对量化指标，具体实际操作过程参照保存装置的刻度说明直接采样即可，也可依据实际需要，做相应调整。
[0067]
实施例6：
[0068]
便隐血粪便样本保存液保存装置，操作时实施例4的便隐血粪便样本保存液除了可以用在粪便保存装置中外，还可以直接作为粪便检测前预处理试剂使用，使用时将新鲜粪便与便隐血粪便样本保存液按照25
±
5mg∶1.5ml的比例混合均匀后置于常规条件下保存，保存效果与统计图的结果一致，可以保证粪便样本中血红蛋白在2～8℃保存14d，20～30℃保存7d，37℃保存3d。
[0069]
《中国结直肠癌筛查与早诊早治指南》中关于筛查和早期诊断方法中提出：可以使用免疫层析类产品进行早期快速筛查，考虑到实际情况，若收集样本量大，来不及全部检测，则可以选用本发明便隐血粪便样本保存液对粪便进行预处理并予常规保存，在3天内测试完毕即可。另一方面，考虑到粪便样本的特殊属性，采样时很难做到准确定量，本发明实施例允许粪便与保存液的比例在一定范围内调整，不影响最终的检测结果。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。

技术特征：
1.一种便隐血粪便样本保存液，包括缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂；其特征在于：所述保存液还包括糖类、氨基酸和硫代硫酸钠；所述缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂、糖类、氨基酸和硫代硫酸钠这七种成分的质量比为100：1：0.5：0.01：2：0.1：1。2.根据权利要求1所述的一种便隐血粪便样本保存液，其特征在于：所述缓冲液为tris三羟甲基氨基甲烷配制，纯度为分析纯级别，并经盐酸调节ph到7.0
±
0.2，其离子浓度为0.1m/l；所述保护剂具体为bsa牛血清白蛋白，第五组分，不含脂肪酸，纯度为分析纯级别，其使用浓度为1%w/v；所述糖类为甘露醇，纯度为分析纯级别，其使用浓度为2%w/v；所述活性剂为tx-100，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.5%v/v；所述氨基酸为甘氨酸，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.1%w/v；所述防腐剂为蛋清溶菌酶，纯度为分析纯级别，其使用浓度为0.01%w/v；所述硫代硫酸钠，纯度为分析纯级别，其使用浓度为1%w/v。3.一种如权利要求1-2任一项所述的一种便隐血粪便样本保存液的测试方法，其特征在于：所述步骤包括：s1：首先分别向权利要求1所述的便隐血粪便样本保存液和灭菌生理盐水中加入天然提纯人血红蛋白或人血红蛋白与粪便样本混合或临床阳性样本，测试各样本的实验液， 并利用标准比色卡判定显色等级；s2：各样本分别在2～8℃，20～30℃，37℃的环境下保存21d，测试各样本的实验液，并利用标准比色卡判定显色等级；s3：统计、整理各实验液在3种保存温度环境中1～21d的显色等级，并绘制成图。4.根据权利要求3所述的一种便隐血粪便样本保存液的测试方法，其特征在于：所述步骤s1中测试各样本实验液的具体步骤为：以移液器添加80μl样本到试纸条s孔内，计时5分钟，判读结果。5.根据权利要求3所述的一种便隐血粪便样本保存液的测试方法，其特征在于：所述标准比色卡的数字越大代表试纸条显色越深，其显色等级也越高。6.一种如权利要求1所述的一种便隐血粪便样本保存液的保存装置，其特征在于：所述装置包括塑料上盖、塑料杆、塑料管、塑料底盖；塑料上盖和塑料杆通过螺纹连接，塑料管的上部与塑料杆和塑料上盖连接，塑料管的下部与塑料底盖连接，塑料管内部设置有便隐血样本保存液和便隐血测试条。7.根据权利要求6所述的一种便隐血粪便样本保存液的保存装置，其特征在于：所述保存装置的使用体积为1～2ml/人份，置于2～40℃下保存。

技术总结
本发明一种便隐血粪便样本保存液、测试方法及其保存装置，保存液包括缓冲液、保护剂、活性剂、防腐剂、糖类、氨基酸和硫代硫酸钠。测试方法包括S1：分别在保存液和灭菌生理盐水中加入天然提纯人血红蛋白或人血红蛋白与粪便样本混合或临床阳性样本，测试各样本的实验液，并利用标准比色卡判定显色等级；S2：各样本分别在3种保存温度环境下保存21d，测试各样本并判定显色等级；S3：统计整理各实验液的显色等级，并绘制成图。本发明确定了简单、有效、经济、实用的保存液配方及其保存装置，明确了其在便隐血快速测试中的应用及效果，可以保证粪便样本中血红蛋白在2～8℃保存14d，20～30℃保存7d，37℃保存3d。37℃保存3d。37℃保存3d。


技术研发人员：鲁晓雄 张海娟 王春香
受保护的技术使用者：江苏康为世纪生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/15