一种间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物的制备方法与应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物的制备方法与应用。


背景技术：

2.溶瘤病毒(oncolytic virus，ovs)已成为肿瘤治疗的一种新型策略，无论是天然存在的还是基因工程改造的ovs，都能在不损害正常细胞的情况下特异性感染和杀伤肿瘤细胞。在众多ovs中呼肠孤病毒(reovirus，reo)比较特殊，reo是一种天然存在的非致病性双链rna(dsrna)病毒，可选择性在肿瘤细胞内大量增殖,已证实其对多种来源的肿瘤细胞均可发挥显著的杀伤作用。作为ovs研究及应用领域的领跑者,reo作为抗肿瘤制剂已在全球范围内开展了30余项临床试验,其中对头颈部麟状细胞癌的研究已进入ⅲ期临床试验。虽然reo可以通过瘤内或静脉注射给药，但是瘤内注射不适用于血液性肿瘤，而静脉给药又使reo的抗肿瘤疗效受到体内中和抗体等的限制。
3.因此，寻找一种可增强reo在体内的肿瘤靶向性，能够帮助reo逃避体液免疫应答及中和抗体对病毒的阻碍作用的策略是目前急需解决的问题。


技术实现要素：

4.为了解决目前存在的上述技术问题，本发明提供了一种间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物及制备方法与应用。
5.一种间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物，是用间充质干细胞外泌体包载呼肠孤病毒。
6.进一步的，所述包载，是用挤压法进行包载。
7.所述间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物的制备方法，采用挤压法进行制备。
8.进一步的，所述挤压法，包括如下步骤：
9.将间充质干细胞来源外泌体与呼肠孤病毒混合均匀，取混合液用挤压器挤压至包载完成。
10.进一步的，所述挤压法，具体步骤如下：间充质干细胞来源外泌体与呼肠孤病毒按1：1体积比在离心管中混合，用移液器充分吹打混匀；按要求将挤压器(mini-extruder set，美国avanti公司)组装好并配备100nm的膜，随后使用注射器吸取适量pbs检漏；注射器吸取外泌体与病毒的混合物在挤压装置中来回挤压30～50次循环至包载完成。
11.进一步的，所述间充质干细胞来源外泌体，具体是通过如下方法制备得到的：
12.脐带间充质干细胞生长汇合至60％时换含无外泌体血清的培养基中培养，48h后收集上清至离心管中，300g离心10min后取上清液2000g离心20min，随后10000g离心30min并通过0.22μm的滤器以去除较大尺寸的囊泡。然后使用超高速离心机将上清通过100000g
离心70min，小心弃去上清后用pbs洗涤一次，随后100000g再次离心70min，以上所有离心步骤均在4℃条件下进行。最后用pbs重悬外泌体颗粒，放置-80℃保存。
13.所述间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物在作为/制备肿瘤药物方面的应用。
14.进一步的，所述的肿瘤所述肿瘤是包括结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌等实体瘤，以及血液肿瘤，特别是对呼肠孤病毒的溶瘤作用不敏感的肿瘤。
15.一种药物制剂，含有所述的间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物。
16.进一步的，所述药物制剂是抗肿瘤药物制剂。
17.由于呼肠孤病毒(reovirus,reo)瘤内注射不适用于血液肿瘤，而静脉给药又使reo抗肿瘤疗效受到体内中和抗体等因素的限制。本发明利用了递送载体来将reo靶向运载到肿瘤部位，这个策略不仅可以克服体内中和抗体的阻碍作用，还能帮助reo进行肿瘤靶向性传递，目前用于病毒递送的载体类型主要有细胞载体(干细胞、免疫细胞或灭活的肿瘤细胞)、脂质体以及外泌体等。
18.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一种具有自我更新和可以分化成多种细胞类型的多能基质细胞。研究表明mscs可以作为ovs的细胞载体，这种策略可能是提高ovs疗效的有效方法。由于mscs具有肿瘤趋向性，负载ovs的mscs可帮助病毒递送到肿瘤细胞，此外mscs还具有低免疫原性，可以保护ovs免受中和抗体的阻碍从而增强溶瘤作用。
19.外泌体(exosome,exo)是几乎所有细胞类型都分泌的纳米级胞外囊泡，具有脂质双层结构，可储存核酸、蛋白质、酶和代谢物等生物分子，它们可将功能性物质转移到相邻或远处的细胞，在细胞间通讯中发挥关键作用。间充质干细胞来源外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosomes，msc
exo
)的生物学功能与mscs相似，而且msc
exo
还具有体积小、循环半衰期长、可通过血脑屏障和理想的生物相容性等优势，是理想的药物递送载体。
20.本发明使用msc
exo
作为reo的递送工具，比较了三种不同的方法来将msc
exo
包载reo制备msc
exo-reo，最终选择挤压法来制备msc
exo-reo，挤压法制备的msc
exo-reo可最大程度保护reo免受中和抗体的阻碍并将其递送至肿瘤细胞从而发挥溶瘤效应，并且本发明制备的msc
exo-reo可提高肿瘤细胞对reo杀伤作用的敏感性。
21.与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
22.(1)本技术选用msc
exo
作为递送工具，mscs细胞是外泌体制备的理想来源，它可以从多种人体组织中获得，并可在gmp条件下大量扩增并制备外泌体。
23.(2)本技术通过比较三种不同的方法来将msc
exo
包载reo制备msc
exo-reo，最终选择挤压法制备msc
exo-reo。
24.(3)本技术通过挤压法制备的msc
exo-reo，对正常细胞无明显毒性，并且可保护reo避免中和抗体的阻碍将reo递送至肿瘤细胞从而发挥杀伤作用。
25.(4)本技术制备得到的msc
exo-reo可提高肿瘤细胞对reo杀伤作用的敏感性，能显著增高msc
exo-reo对reo作用不敏感的肿瘤细胞的杀伤作用。
附图说明
26.图1是msc
exo
的表征图。
27.图2是msc
exo
装载reo示意图。
28.图3不同方法制备msc
exo-reo的比较结果图。
29.图4是msc
exo
、reo以及msc
exo-reo的粒径比较结果图。
30.图5是中和抗体存在下，msc
exo-reo对肿瘤细胞的体外杀伤作用对比图。
31.图6是msc
exo-reo对reo作用不敏感的hl60细胞以及正常的外周血单个核细胞的体外作用对比图。
具体实施方式
32.下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
33.实施例1：msc
exo
的分离及鉴定
34.1.超高速离心提取msc
exo
35.脐带间充质干细胞生长汇合至60％时换含无外泌体血清的培养基中培养，48h后收集上清至离心管中，300g离心10min后取上清液2000g离心20min，随后10000g离心30min并通过0.22μm的滤器以去除较大尺寸的囊泡。然后使用超高速离心机将上清通过100000g离心70min，小心弃去上清后用pbs洗涤一次，随后100000g再次离心70min，以上所有离心步骤均在4℃条件下进行。最后用pbs重悬外泌体颗粒，放置-80℃保存。
36.2.msc
exo
的鉴定
37.(1)westernblot
38.蛋白样品加入5
×
loading buffer，置于金属浴中变性后在10％聚丙酰胺凝胶中于恒压条件下电泳分离，通过湿转法在恒流条件下将蛋白质转膜至pvdf膜用5％的脱脂牛奶封闭2h，封闭结束后，用tbst溶液洗膜3次，每次10min，洗膜结束后在4℃下用相应的特异性一抗孵育过夜。次日用tbst洗膜3次后加入适量稀释好的二抗在室温下孵育1-2h，孵育结束后tbst洗膜3次，使用ecl超敏化学发光试剂在化学发光成像系统下曝光成像并记录。
39.(2)外泌体粒径的检测
40.使用zetaview仪器检测外泌体，其原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。仪器先使用标准品校准好后，将提取好的外泌体用pbs稀释至合适浓度上样，根据其原理检测出外泌体粒径和浓度，生成报告。
41.(3)透射电镜鉴定外泌体形态
42.取20μl外泌体样品滴于铜网上，静置5min，用滤纸沿边缘吸去多余液体，使用1％磷钨酸在室温下染色1-2min，用滤纸吸去残余的染液。待干燥后，使用jem-1400flash透射电镜观察并记录成像。
43.(4)外泌体摄取实验
44.pkh67标记msc
exo
：外泌体悬液加入pkh67染液标记，随后加入0.5％bsa溶液终止染色后120000g，4℃离心2h去除游离染料；离心结束后弃上清，用pbs重悬后充分混匀。thp-1细胞接种至24孔板中，取pkh67标记的msc
exo
与细胞共孵育，同时以pkh67标记的pbs作对照，孵育结束后，用dapi染核，荧光显微镜下观察thp-1摄取外泌体情况。
45.实施例2：不同msc
exo-reo制备方法的比较
46.(1)直接混合法：将等体积的msc
exo
与reo混合在塑料离心管中，用移液器充分吹打混匀，随后将混合物在冰上放置30min。
47.(2)超声孵育法：将msc
exo
与reo等体积混合后冰浴超声，超声条件：20％振幅，3s开/3s关，1min为一次循环，循环6次，每次间隔2min，超声结束后静置30min。
48.(3)挤压法：msc
exo
与reo等体积在塑料离心管中混合，用移液器充分吹打混匀；按要求将挤压器组装好并配备100nm的膜，用注射器吸取适量pbs检漏；接着用注射器吸取外泌体与病毒的混合物，来回挤压30～50个循环。挤压后静置30min，随后放-80℃保存。
49.实施例3：msc
exo-reo的体外杀伤作用
50.1.msc
exo-reo对肿瘤细胞的杀伤作用
51.(1)msc
exo-reo在中和抗体存在下对thp-1细胞的杀伤作用：
52.thp-1细胞重悬在含5％ab血清/fbs的1640培养基中，以104细胞/孔接种至96孔板中，随后按moi＝1的感染复数向实验组中加入reo/msc
exo-reo，同时设有加pbs/msc
exo
的对照组以及加入培养基的空白组，每组3个复孔。将96孔板放置细胞培养箱中继续培养，48h后将培养板取出并向各孔中加入cck8试剂，置于培养箱中孵育2h后使用酶标仪在450nm波长处测定各孔od值，按公式计算杀伤率。
[0053][0054]
(2)msc
exo-reo对hl-60细胞及pbmc的杀伤作用：
[0055]
为评价msc
exo-reo对肿瘤细胞及正常细胞的体外杀伤作用，本发明分别检测了msc
exo-reo对人急性早幼粒细胞白血病细胞系hl-60细胞(对reo作用不敏感)及外周血单个核细胞(正常细胞)的体外杀伤作用。将生长状态良好的hl-60/pbmc细胞以104细胞/孔接种至96孔板中，随后按moi＝1的感染复数向实验组中加入reo/msc
exo-reo，同时设有加pbs/msc
exo
的对照组以及加入培养基的空白组，每组3个复孔。将96孔板放置细胞培养箱中继续培养，48h后将培养板取出并向各孔中加入cck8试剂，置于培养箱中孵育2h后使用酶标仪在450nm波长处测定各孔od值，按公式计算杀伤率。
[0056][0057]
结果：
[0058]
(1)msc
exo
的鉴定：电镜结果表明msc
exo
呈现圆形膜性囊泡样结构；zetaview结果表明msc
exo
的粒径大小在123nm左右，同时，western blot鉴定msc
exo
表达tsg101、cd63和cd81蛋白标志物，不表达阴性标志物calnexin；同时观察肿瘤细胞(人急性单核细胞白血病细胞系thp-1细胞)对msc
exo
在6h时的摄取内化：msc
exo
在6h时已经观察到进入thp-1细胞中，具体见图2。
[0059]
(2)不同方法装载reovirus的比较：比较了直接混合法，超声孵育法以及挤压法三种不同的方法来将msc
exo
包载reo制备msc
exo-reo，通过检测其在中和抗体下对thp-1细胞的杀伤作用来选择最佳方案。图a表示直接混合法制备的msc
exo-reo在中和抗体下对thp-1细胞的杀伤作用；图b表示超声孵育法制备的msc
exo-reo在中和抗体下对thp-1细胞的杀伤作用；图c表示挤压法制备的msc
exo-reo在中和抗体下对thp-1细胞的杀伤作用。结果显示通过挤压法制备的msc
exo-reo在中和抗体下杀伤作用是最显著的，于是后续实验选择使用挤压
法制备msc
exo-reo。具体见图3。
[0060]
(3)msc
exo
、reo以及msc
exo-reo的粒径比较：msc
exo
的粒径大小在118nm左右，reo的大小粒子在100nm左右，msc
exo-reo的粒径大小与reo大小接近，也是在100nm左右。具体见图4。
[0061]
(4)挤压法制备的msc
exo-reo在中和抗体存在下对肿瘤细胞的体外杀伤作用：通过cck8法检测msc
exo-reo在中和抗体存在下对thp-1细胞的杀伤作用，结果显示与单独病毒组的杀伤作用几乎被中和抗体阻断不同，在中和抗体存在下msc
exo-reo对thp-1细胞的杀伤与无中和抗体时几乎一样，这说明msc
exo-reo保护了reo在中和抗体存在下对thp-1细胞的杀伤作用，具体见图5。
[0062]
(5)挤压法制备的msc
exo-reo对人急性早幼粒细胞白血病细胞系hl-60细胞(对reo作用不敏感)及外周血单个核细胞(正常细胞)的体外杀伤作用：通过cck8法检测msc
exo-reo对hl-60细胞的杀伤作用，结果显示与reo相比，msc
exo-reo对hl-60细胞的杀伤作用显著增高，这说明msc
exo-reo可增强肿瘤细胞对reo作用的敏感性；通过cck8法检测msc
exo-reo对pbmc细胞的杀伤作用，结果表明msc
exo-reo对pbmc无明显毒性作用，这表明msc
exo-reo具有较好的安全性，具体见图6。
[0063]
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物，其特征在于，是用间充质干细胞外泌体包载呼肠孤病毒。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体包载呼肠孤病毒复合物，其特征在于，所述包载，是用挤压法进行包载。3.权利要求1所述间充质干细胞外泌体包载呼肠孤病毒复合物的制备方法，其特征在于，采用挤压法进行制备。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述挤压法，包括如下步骤：将间充质干细胞来源外泌体与呼肠孤病毒混合均匀，取混合液用挤压器挤压至包载完成。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述挤压法，具体步骤如下：间充质干细胞来源外泌体与呼肠孤病毒按1：1体积比在离心管管中混合，用移液器充分吹打混匀；按要求将挤压器组装好并配备100nm的膜，随后使用注射器吸取适量pbs检漏；注射器吸取外泌体与病毒的混合物在挤压装置中来回挤压30～50次循环至包载完成。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源外泌体，是通过如下方法制备得到的：脐带间充质干细胞生长汇合至60％时换含无外泌体血清的培养基中培养，48h后收集上清至离心管中，300g离心10min后取上清液2000g离心20min，随后10000g离心30min并通过0.22μm的滤器以去除较大尺寸的囊泡。然后使用超高速离心机将上清通过100000g离心70min，小心弃去上清后用pbs洗涤一次，随后100000g再次离心70min，以上所有离心步骤均在4℃条件下进行。最后用pbs重悬外泌体颗粒，放置-80℃保存。7.权利要求1所述间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物在作为/制备肿瘤药物方面的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是对呼肠孤病毒的杀伤作用不敏感的肿瘤。9.一种药物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物。10.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂是抗肿瘤药物制剂。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种间充质干细胞来源外泌体包载呼肠孤病毒复合物的制备方法与应用。本申请使用间充质干细胞来源外泌体(mesenchymalstemcell-derivedexosomes，MSC


技术研发人员：赵星 何志旭 杨安清 包裔阳 张晶 张迎春 林小金
受保护的技术使用者：贵州医科大学
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/15