一种高活性微胶囊益生菌及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高活性微胶囊益生菌及其制备方法。


背景技术：

2.哺乳动物的肠道中有1000～1500种细菌，这些微生物统称为肠道微生物群。研究表明，人体和微生物群长期存在一种动态平衡的共生关系，其能够调节身体各项功能。然而，这种平衡并不稳定，如病原菌感染、不良饮食习惯、环境化学物质和滥用抗生素等都可能打破这种平衡，引发炎症性肠病、糖尿病和肥胖等多种疾病。因此益生菌作为微生物群调节剂被广泛研究，用于治疗和预防各种疾病。然而，益生菌普遍存在耐酸性弱、不耐贮藏等抗胁迫性差问题，且益生菌产品在加工、运输过程中，不可避免会接触高温、高氧含量等应激因素的影响，导致进入人体后的活菌量往往达不到发挥健康功效的水平。因此，开发有效保护益生菌及相关微生态制剂活性的技术具有重要意义。
3.微胶囊包埋技术是以天然或合成材料为壁材，将芯材益生菌包裹成微胶囊的技术，可以有效避免菌株与外界不利环境的直接接触，减少活性物质在加工或贮藏过程中的损失，保证产品的稳定性，同时能克服胃酸破坏溶解，使芯材具有较好的肠道靶向性。
4.海藻酸盐是益生菌包埋的常用材料。目前，以海藻酸盐为基质的益生菌包埋方法，如挤压法、外源乳化法和内源乳化法等，原理全部是基于海藻酸盐的离子交联特性。然而，海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率低，商业化应用十分有限。使用海藻酸钙生产的益生菌微胶囊不仅初始存活率低，而且活菌中也可能已经存在许多生理状态差的菌体，导致在随后的贮存过程中进一步大量死亡，造成产品稳定性差，从而影响商业产品品质。
5.因此，本发明提出制备一种高活性微胶囊益生菌以提高海藻酸钙负载的益生菌产品的活性和稳定性。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种高活性微胶囊益生菌及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该制备方法可以提高海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率和稳定性，并且其制备得到的微胶囊益生菌还具有耐胃酸性能强、肠道缓释和肠溶释放率高的特点。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种高活性微胶囊益生菌的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将益生菌进行发酵培养后，分离得到菌体；
10.(2)将所述菌体加入包埋液进行包埋和冷冻干燥处理，得到一级微胶囊；
11.(3)将所述一级微胶囊加入海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用挤压法，将所述混合液挤压注入到cacl2溶液中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置稳定后，再将所述海藻酸钙凝胶珠置于羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，之后再经分离和冷冻干燥处理，得到二级微胶囊，即为所述高活性微胶囊益生菌；
12.在步骤(2)中，所述包埋液包括麦冬寡糖、甜菜碱和乳清蛋白。
13.进一步地，在步骤(1)中，所述益生菌包括发酵乳杆菌、格氏乳杆菌或植物乳杆菌。
14.进一步地，所述麦冬寡糖、所述甜菜碱和所述乳清蛋白在所述包埋液中浓度分别为2-3.5g/l、1.5-4g/l和8-12g/l。
15.优选地，所述麦冬寡糖、所述甜菜碱和所述乳清蛋白在所述包埋液中浓度分别为3g/l、2g/l和10g/l。
16.进一步地，在步骤(2)中，所述菌体和所述包埋液的质量体积比为10g:(2-2.5)ml。
17.进一步地，在步骤(3)中，所述海藻酸钙溶液的浓度为1.5-2.5wt％。
18.进一步地，在步骤(3)中，所述cacl2溶液的浓度为1-2wt％。
19.进一步地，在步骤(3)中，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为0.4-0.5wt％。
20.进一步地，在步骤(3)中，所述一级微胶囊和所述海藻酸钙溶液的质量体积比为(23.2-24.5)g：1000ml。
21.本发明还提供一种高活性微胶囊益生菌，所述高活性微胶囊益生菌是由上述的制备方法制备得到。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.本发明针对海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率低，产品稳定性差的问题，开发了一种微胶囊益生菌的制备方法，该方法可以提高海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率和稳定性，并且其制备得到的微胶囊益生菌还具有耐胃酸性能强、肠道缓释和肠溶释放率高的特点。
24.本发明针对海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率低的问题，设计了一种由麦冬寡糖、甜菜碱和乳清蛋白构成的包埋液，该包埋液中，麦冬寡糖通过穿过细胞壁，但不穿过细胞质膜的方式保护菌体，甜菜碱能够调节细胞渗透压和离子平衡，而乳清蛋白则能在菌体表面形成蛋白膜，避免菌体暴露于外界环境中遭到损伤。利用该包埋液对植物乳杆菌进行包埋后再冷冻干燥，可以显著提升益生菌的存活率。
25.本发明采用羧甲基壳聚糖与海藻酸钙结合使用，利用羧甲基壳聚糖的两性聚电解质的特性，在聚阴离子海藻酸钙存在下交联聚合，并且羧甲基壳聚糖还在钙离子存在下通过其羧基与海藻酸钙形成交联网络，形成羧甲基壳聚糖和海藻酸盐的互穿聚合物网络微粒，这为微胶囊益生菌带来了良好的机械性能，并能够保证其囊芯活菌的高存活率和高稳定性。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.以下实施例中使用的麦冬寡糖的制备方法如下：
32.取麦冬100g，粉碎后，按料液质量比1:10加入95％乙醇，回流提取2h，过滤，弃滤液，蒸干乙醇，加1000ml蒸馏水，水浴提取2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至固形物含量为60wt％，加乙醇至醇浓度为80wt％，静置12h，沉淀，分别以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤，55℃烘干，得到麦冬粗提取物。取麦冬粗提取物，溶于蒸馏水中，离心除去沉淀，sephadexg-75层析柱(3
×
80cm)上样，以蒸馏水洗脱(流速为0.5ml/min)，分段收集洗脱液。最后合并洗脱峰，冷冻干燥，得到麦冬寡糖，分子量500～2500。
33.本发明针对海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率低，产品稳定性差的问题，开发了一种微胶囊益生菌的制备方法，该方法可以提高海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率和稳定性，并且其制备得到的微胶囊益生菌还具有耐胃酸性能强、肠道缓释和肠溶释放率高的特点，以下以植物乳杆菌hfy15(在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.16648)为例，进行说明，但本发明制备方法的应用并不限于植物乳杆菌hfy15，其对发酵乳杆菌、格氏乳杆菌等益生菌同样适用。保藏日期：2018年10月29日。分类命名：植物乳杆菌 lactobacillus plantarum。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
34.实施例1
35.一种微胶囊植物乳杆菌的制备方法：
36.(1)取冷冻保存的植物乳杆菌，活化三次后，接种入mrs液体培养基进行发酵培养，37℃厌氧发酵培养36h，之后离心收集得到菌体。
37.(2)在100ml蒸馏水中加入麦冬寡糖3g、甜菜碱2g和乳清蛋白10g混合均匀，得到包埋液。
38.(3)取步骤(1)得到的菌体100g，加入步骤(2)得到的包埋液20ml，混合均匀后真空冷冻干燥，得到一级微胶囊(23.6g)。
39.(4)取步骤(3)得到的一级微胶囊23.6g，加入1000ml浓度为2wt％的海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用无菌注射器将该混合液注入到cacl2溶液(浓度1.5wt％)中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置30min，待海藻酸钙凝胶珠稳定后，将其置于0.5wt％羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，洗去多余的羧甲基壳聚糖，收集得到微胶囊，再经真空冷冻干燥，得到二级微胶囊，即微胶囊植物乳杆菌。
40.实施例2
41.一种微胶囊植物乳杆菌的制备方法：
42.(1)取冷冻保存的植物乳杆菌，活化三次后，接种入mrs液体培养基进行发酵培养，
37℃厌氧发酵培养36h，之后离心收集得到菌体。
43.(2)在100ml蒸馏水中加入麦冬寡糖2.5g、甜菜碱4g和乳清蛋白8g混合均匀，得到包埋液。
44.(3)取步骤(1)得到的菌体100g，加入步骤(2)得到的包埋液20ml，混合均匀后真空冷冻干燥，得到一级微胶囊(23.2g)。
45.(4)取步骤(3)得到的一级微胶囊23.2g，加入1000ml浓度为1.5wt％的海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用无菌注射器将该混合液注入到cacl2溶液(浓度2wt％)中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置30min，待海藻酸钙凝胶珠稳定后，将其置于0.4wt％羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，洗去多余的羧甲基壳聚糖，收集得到微胶囊，再经真空冷冻干燥，得到二级微胶囊，即微胶囊植物乳杆菌。
46.实施例3
47.一种微胶囊植物乳杆菌的制备方法：
48.(1)取冷冻保存的植物乳杆菌，活化三次后，接种入mrs液体培养基进行发酵培养，37℃厌氧发酵培养36h，之后离心收集得到菌体。
49.(2)在100ml蒸馏水中加入麦冬寡糖3.5g、甜菜碱1.5g和乳清蛋白12g混合均匀，得到包埋液。
50.(3)取步骤(1)得到的菌体100g，加入步骤(2)得到的包埋液25ml，混合均匀后真空冷冻干燥，得到一级微胶囊(24.5g)。
51.(4)取步骤(3)得到的一级微胶囊24.5g，加入1000ml浓度为2.5wt％的海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用无菌注射器将该混合液注入到cacl2溶液(浓度1.0wt％)中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置30min，待海藻酸钙凝胶珠稳定后，将其置于0.5wt％羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，洗去多余的羧甲基壳聚糖，收集得到微胶囊，再经真空冷冻干燥，得到二级微胶囊，即微胶囊植物乳杆菌。
52.对比例1
53.同实施例1，区别仅在于，步骤(2)为在100ml蒸馏水中加入麦冬寡糖3g和乳清蛋白10g混合均匀，得到包埋液。
54.对比例2
55.同实施例1，区别仅在于，步骤(2)为在100ml蒸馏水中加入麦冬寡糖5g和乳清蛋白10g混合均匀，得到包埋液。
56.对比例3
57.同实施例1，区别仅在于，在步骤(2)为在100ml蒸馏水中加入甜菜碱2g和乳清蛋白10g混合均匀，得到包埋液。
58.对比例4
59.同实施例1，区别仅在于，步骤(2)为在100ml蒸馏水中加入甜菜碱5g和乳清蛋白10g混合均匀，得到包埋液。
60.对比例5
61.同实施例1，区别仅在于，将步骤(2)中的麦冬寡糖替换为海藻糖(购自阿拉丁，货号d427220)。
62.对比例6
63.一种微胶囊植物乳杆菌的制备方法：
64.(1)取冷冻保存的植物乳杆菌，活化三次后，接种入mrs液体培养基进行发酵培养，37℃厌氧发酵培养36h，之后离心收集得到菌体。
65.(2)将麦冬寡糖3g、甜菜碱2g、乳清蛋白10g和步骤(1)得到的菌体100g，加入1000ml浓度为2wt％的海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用无菌注射器将该混合液注入到cacl2溶液(浓度1.5wt％)中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置30min，待海藻酸钙凝胶珠稳定后，将其置于0.5wt％羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，洗去多余的羧甲基壳聚糖，收集得到微胶囊，再经真空冷冻干燥，即得微胶囊植物乳杆菌。
66.对比例7
67.一种微胶囊植物乳杆菌的制备方法：
68.(1)取冷冻保存的植物乳杆菌，活化三次后，接种入mrs液体培养基进行发酵培养，37℃厌氧发酵培养36h，之后离心收集得到菌体。
69.(2)将步骤(1)得到的菌体100g，加入1000ml浓度为2wt％的海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用无菌注射器将该混合液注入到cacl2溶液(浓度1.5wt％)中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置30min，待海藻酸钙凝胶珠稳定后，将其置于0.5wt％羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，洗去多余的羧甲基壳聚糖，收集得到微胶囊，再经真空冷冻干燥，即得微胶囊植物乳杆菌。
70.对比例8
71.同实施例1，区别仅在于，将步骤(4)中的羧甲基壳聚糖替换为壳聚糖(购自阿拉丁，货号c434547)。
72.对比例9
73.同实施例1，区别仅在于，将步骤(4)中的羧甲基壳聚糖替换为羟丙甲纤维素(购自阿拉丁，货号h108823)。
74.性能测试
75.1.实验材料
76.模拟胃液：0.9g nacl定容至100ml；用1m hcl溶液调ph至2.0；灭菌后加入0.32g胃蛋白酶；并用0.22μm的滤头过滤除菌。
77.模拟肠液：0.68g kh2po4定容至100ml；用1m naoh溶液调ph至6.7；灭菌后加入1g/100ml胰蛋白酶、0.3wt％胆盐；同样过滤除菌。
78.解囊液：用0.05m柠檬酸溶液(c6h8o7·
h2o)将0.1m na2hpo4·
12h2o溶液的ph调至7.5。
79.2.实验方法
80.2.1微胶囊活菌计数
81.分别测试实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌在冷冻干燥前后的活菌数，并计算冷冻干燥存活率，活菌数检测方法如下：
82.称取0.1g冷冻干燥前的湿菌体，检测活菌数，记为q0；
83.将0.1g湿菌体分别按照实施例1-3和对比例1-9的方法制备得到微胶囊植物乳杆菌，再分别加入到1ml解囊液中，振摇10min至完全解囊，检测活菌数，记为q1。
84.冷冻干燥存活率＝q1/q0×
100％。
85.2.2微胶囊在模拟胃液中的存活率
86.分别测试实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌在模拟胃液中的存活率，方法如下：
87.准确称取微胶囊0.10g，加入0.90ml模拟胃液，180r/min处理1h，接着在8,000r/min条件下离心5min，弃上清，加入1ml解囊液，振摇10min至完全解囊，检测活菌数，计为q2，计算微胶囊中植物乳杆菌在模拟胃液中的存活率。
88.存活率(模拟胃液)＝q2/q1×
100％。
89.2.3微胶囊的肠溶释放率的测定
90.分别测试实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌的肠溶释放率，方法如下：
91.取微胶囊10g于90ml模拟胃液，在37℃条件下180r/min处理1h，接着在8,000r/min条件下离心5min，弃上清，再加入90ml模拟肠液，在37℃条件下180r/min处理6h，分别在30min、60min、90min、120min、180min、270min和360min时取样，将消化后的微胶囊分别解囊后，检测解囊液中的活菌数(q3)。
92.肠溶释放率＝(q
1-q
2-q3)/q1×
100％。
93.2.4微胶囊的稳定性测试
94.分别对实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌进行稳定性测试，方法如下：
95.将微胶囊放置在37℃条件下保持恒温，相对湿度保持在60-65％，存储3个月后测定微胶囊中的活菌数，此时的活菌数衰减速度就相当于在室温的条件下存储1年以上后的活菌数衰减速度。
96.3.结果
97.3.1微胶囊活菌数检测结果
98.对实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌的活菌数进行检测，结果见表1。根据表1可以看出，实施例1-3制备得到的微胶囊植物乳杆菌活菌数均在10
11
cfu/g以上，并且冷冻干燥存活率达到92％以上。本发明针对海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率低的问题，设计了一种由麦冬寡糖、甜菜碱和乳清蛋白构成的包埋液，该包埋液中，麦冬寡糖通过穿过细胞壁，但不穿过细胞质膜的方式保护菌体，甜菜碱能够调节细胞渗透压和离子平衡，而乳清蛋白则能在菌体表面形成蛋白膜，避免菌体暴露于外界环境中遭到损伤。利用该包埋液对植物乳杆菌进行包埋后再冷冻干燥，可以显著提升植物乳杆菌的存活率。并且结合实施例1和对比例6可以看出，本发明先利用该包埋液对植物乳杆菌进行包埋，形成一级微胶囊，再利用海藻酸钙进行包埋，最终制备得到二级微胶囊，即微胶囊植物乳杆菌，相对于直接利用该包埋液和海藻酸钙进行包埋，植物乳杆菌的存活率进一步得到提升。此外，结合实施例1和对比例1-5可以看出，本发明将麦冬寡糖和甜菜碱结合使用，相对于将二者单独使用，冷冻干燥存活率得到了大幅提高，可见本发明将麦冬寡糖和甜菜碱结合使用，取得了协同增效的效果。
99.表1
[0100][0101]
3.2微胶囊在模拟胃液中的存活率测定结果
[0102]
实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌在模拟胃液中的存活率检测结果见表2。根据表2可以看出，实施例1-3制备的微胶囊植物乳杆菌在胃液中的耐受能力较强。
[0103]
表2
[0104][0105][0106]
3.3微胶囊的肠溶释放率测定结果
[0107]
实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌的肠溶释放率检测结果见表3。根据表3可以看出，实施例1-3制备得到的微胶囊植物乳杆菌的累积肠溶释放率都在
92％以上，并且结合60min和120min的肠溶释放率来看，实施例1-3制备得到的微胶囊植物乳杆菌可以达到缓释效果。
[0108]
表3
[0109]
实施例/对比例60min肠溶释放率(％)120min肠溶释放率(％)360min累积释放率(％)实施例126.5356.2094.51实施例227.2157.1993.08实施例326.8057.5992.17对比例130.1765.2489.16对比例229.1863.4889.57对比例329.6766.2987.29对比例430.2867.1990.87对比例541.2975.1380.24对比例640.8376.2981.34对比例750.8453.2156.14对比例858.3468.2071.20对比例955.2758.7662.45
[0110]
3.4微胶囊的稳定性测试结果
[0111]
对实施例1-3和对比例1-9制备得到的微胶囊植物乳杆菌进行稳定性测试，结果见表4。根据表4可以看出，实施例1-3制备得到的微胶囊植物乳杆菌储存稳定性良好，货架期相对较长。
[0112]
表4
[0113][0114]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种高活性微胶囊益生菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将益生菌进行发酵培养后，分离得到菌体；(2)将所述菌体加入包埋液进行包埋和冷冻干燥处理，得到一级微胶囊；(3)将所述一级微胶囊加入海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用挤压法，将所述混合液挤压注入到cacl2溶液中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置稳定后，再将所述海藻酸钙凝胶珠置于羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，之后再经分离和冷冻干燥处理，得到二级微胶囊，即为所述高活性微胶囊益生菌；在步骤(2)中，所述包埋液包括麦冬寡糖、甜菜碱和乳清蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述益生菌包括发酵乳杆菌、格氏乳杆菌或植物乳杆菌。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述麦冬寡糖、所述甜菜碱和所述乳清蛋白在所述包埋液中浓度分别为2-3.5g/l、1.5-4g/l和8-12g/l。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述麦冬寡糖、所述甜菜碱和所述乳清蛋白在所述包埋液中浓度分别为3g/l、2g/l和10g/l。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述菌体和所述包埋液的质量体积比为10g:(2-2.5)ml。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述海藻酸钙溶液的浓度为1.5-2.5wt％。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述cacl2溶液的浓度为1-2wt％。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为0.4-0.5wt％。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述一级微胶囊和所述海藻酸钙溶液的质量体积比为(23.2-24.5)g：1000ml。10.一种高活性微胶囊益生菌，其特征在于，所述高活性微胶囊益生菌由权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。

技术总结
本发明公开了一种高活性微胶囊益生菌及其制备方法，涉及生物技术领域。该制备方法包括以下步骤：(1)将益生菌进行发酵培养后，分离得到菌体；(2)将所述菌体加入包埋液进行包埋和冷冻干燥处理，得到一级微胶囊；(3)将所述一级微胶囊加入海藻酸钙溶液，混合均匀，得到混合液，再使用挤压法，将所述混合液挤压注入到CaCl2溶液中，形成海藻酸钙凝胶珠，静置稳定后，再将所述海藻酸钙凝胶珠置于羧甲基壳聚糖溶液中进行固定化，之后再经分离和冷冻干燥处理，得到二级微胶囊，即为所述高活性微胶囊益生菌。该制备方法可以提高海藻酸钙包埋益生菌的冷冻干燥存活率和稳定性。的冷冻干燥存活率和稳定性。


技术研发人员：马新 喻扬 郁雪平
受保护的技术使用者：安徽善和生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/15