肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法及其试剂盒和应用与流程

1.本发明属于用于癌症检测的免疫测定技术领域，具体地，涉及肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法及其试剂盒和应用。


背景技术：

2.肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，也是最常见的引起死亡的一种癌症，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。绝大多数肺癌是非小细胞肺癌，约占85％。它又能进一步被分为三类，分别是：腺癌，鳞癌和大细胞癌。其中腺癌是最主要的类型，约占肺癌中的50％，鳞癌则紧随其后，占比约30％，其余5％左右则为大细胞肺癌及一些罕见的混合类型肺癌。不同类型的肺癌的生长特点、扩散风险和治疗方案均不相同，所以如何在病理层面尽早区分，对于肺癌的治疗具有重要意义。小细胞肺癌与非小细胞肺癌由于细胞形态以及免疫指标的区别较大，病理医生对于其区分并不困难，而非小细胞肺癌中占比较高的腺癌和鳞癌的高效区分仍需更好的方法。
3.传统的he染色方法，受限于肺活检标本中因活检取材少、组织挤压、细胞坏死、组织固定不及时和细胞形态重叠等问题，不能较好的得到易分辨的组织形态；而利用抗原抗体特异性而进行的ihc方法，通常单张切片只能染色一个指标，给诊断上带来的有效信息有限，往往需要利用连续切片进行多指标染色，再对不同指标进行综合判读，耗时耗力，增加了切片的消耗量，同时，不同切片染色时极有可能存在背景不同、肿瘤细胞在不通切片上位置不同，甚至错过切面等问题，导致影响结果判读；部分多重组化的染色方法，利用ap酶、hrp酶催化不同颜色的底物，在单张切片上进行不同指标的染色，增加单张切片的信息量，但由于信号都是在可见光下成像，信号之间存在较大干扰，也较易受到切片质量影响，如尘肺、长期吸烟的肺等组织，本身在可见光下就有较严重的杂质，对病理结果判读影响较大。
4.中国专利申请公布号为cn103149358a，申请日为2013年03月14日，发明名称为“肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法”，公开的方法将混合型一抗和多种属检测放大系统应用于肺癌组织学分型的鉴别，但该方案采用苏木素复染，可见光下，杂质无法屏蔽，可能对dab阳性信号产生干扰。现有技术中，有采用tsa荧光染料的免疫组化多重染色检测方法检测癌症。如中国专利申请公布号为cn116008549a，申请日为2022年12月29日，发明名称为“一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用”，采用枝杈tsa染料取代传统ihc中的dab染料，通过多轮次染色，可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像，并以组织流式技术分析平台对染色后的病理组织进行包括阳性率、细胞间护作、空间定位、细胞亚群间相互作用等在内的多种维度精确分析。但该方案不能对不同肺癌组织学分型进行检测。


技术实现要素：

5.1、要解决的问题
6.针对现有技术肺癌组织学分型中肺鳞癌和肺腺癌的检测方法，染色时，可见光下，杂质无法屏蔽，对阳性信号产生干扰，成像效果差；或染色液选择不当，非特异自发荧光较强，对成像及后续分析产生干扰；以及操作步骤复杂的技术问题，本技术提供肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，可精准的区分肺腺癌或肺鳞癌。本技术还提供了肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，操作简单，成本较低，将其应用于肺腺癌或肺鳞癌的判断中，使得临床快速区分肺腺癌和肺鳞癌成为可能。
7.2、技术方案
8.为达到上述目的，提供的技术方案为：
9.本发明的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，
10.染色步骤，包括按照抗原a组和/或b组中的顺序，使用对应的一抗次序对肺癌样本进行孵育，使用抗原染液对孵育后的肺癌样本进行染色；
11.a组：ttf-1、cytokeratin-7、napsina、p63；
12.b组：ck5/6、ttf-1、p63、p40；
13.当执行a组时，tsa620染色ttf-1，tsa650染色cytokeratin-7，tsa520染色napsina，tsa700染色p63；
14.当执行b组时，tsa620染色ck5/6，tsa650染色ttf-1，tsa520染色p63，tsa570染色p40。
15.进一步的，包括按照a组或b组中的顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。
16.进一步的，执行完a组或b组中的染色后，使用核染色剂进行染色。
17.进一步的，所述核染色剂包括dapi。
18.进一步的，所述肺癌样本为肺腺癌样本或肺鳞癌样本。
19.进一步的，还包括成像步骤；
20.当成像结果呈现黄色、绿色、红色，判断所述肺癌样本为肺腺癌样本；
21.当成像结果呈现黄色、绿色、紫色，判断所述肺癌样本为肺鳞癌样本。
22.优选的，使用3dhistech pannoramic midi ii成像。
23.肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，
24.包括抗体ttf-1、cytokeratin-7、napsina、p63、ck5/6、p40；
25.还包括抗原染液tsa620，tsa650，tsa52，tsa5700，tsa700。
26.进一步的，还包括信号放大液、hrp酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液。
27.进一步的，还包括用于脱蜡水化的试剂；所述用于脱蜡水化的试剂为二甲苯和乙醇。
28.肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒的应用，将所述试剂盒应用于肺腺癌或肺鳞癌的判断中；
29.当检测结果呈现黄色、绿色、红色，判断所述肺癌样本为肺腺癌样本；
30.当检测结果呈现黄色、绿色、紫色，判断所述肺癌样本为肺鳞癌样本。
31.3、有益效果
32.采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
33.(1)本发明的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，在染色步骤中，使用tsa620
染色ttf-1，tsa650染色cytokeratin-7，tsa520染色napsina，tsa700染色p63；或者使用tsa620染色ck5/6，tsa650染色ttf-1，tsa520染色p63，tsa570染色p40。通过肺腺癌肿瘤细胞呈ttf-1(黄色，细胞核)、napsina(绿色，细胞质)、cytokeratin-7(红色，细胞质)阳性表达，p63呈阴性，无表达；或者肺鳞癌肿瘤细胞呈p63(绿色，细胞核)、p40(黄色，细胞核)、ck5/6(紫色，细胞质)阳性表达，ttf-1呈阴性，无表达，精准的区分肺腺癌或肺鳞癌。
34.(2)本发明的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，包括抗体ttf-1、cytokeratin-7、napsina、p63、ck5/6、p40；还包括抗原染液tsa620，tsa650，tsa52，tsa5700，tsa700。所选抗体，和抗原染液的组合，在最小的试剂选择范围内，可用于精确的区分肺腺癌或肺鳞癌，且成像结果区分大，易辨别，操作简单，成本较低。
35.(3)本发明的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒的应用，将所述试剂盒应用于肺腺癌或肺鳞癌的判断中，当检测结果呈现黄色、绿色、红色，判断所述肺癌样本为肺腺癌样本；当检测结果呈现黄色、绿色、紫色，判断所述肺癌样本为肺鳞癌样本。使得临床快速区分肺腺癌和肺鳞癌成为可能。
附图说明
36.图1为实施例1中多重荧光免疫组化染色结果图；
37.图2为实施例2中多重荧光免疫组化染色结果图；
38.图3为实施例3中多重荧光免疫组化染色结果图；
39.图4为实施例4中多重荧光免疫组化染色结果图；
40.图5为对比例1中染色结果图；
41.图6为对比例2中染色结果图。
具体实施方式
42.为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
43.缩略词
44.he染色法，苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)；
45.ihc，免疫组织化学技术(immunohistochemistry)；
46.dab，(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐)。
47.本发明的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，包括如下步骤：
48.1.脱蜡水合
49.1.1.新鲜二甲苯浸片10min，重复3次。
50.1.2.梯度乙醇浸片：100wt％5min；95wt％5min；70wt％2min。
51.1.3.灭菌水洗片1min，重复3次。
52.1.4.10wt％中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。
53.2.微波修复抗原
54.2.1.将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1*工作液浸没。
55.2.2.将修复杯置于微波炉内高火煮沸。
56.2.3.低火维持15min(注意补液，防止蒸发过度导致干片)。
57.2.4.取出室温自然冷却至室温。
58.3.封闭
59.3.1.去除玻片上残存洗液。
60.3.2.用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域。
61.3.3.室温保湿，震荡10min。
62.4.一抗孵育
63.4.1.去除玻片上的封闭。
64.4.2.用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。
65.4.3.室温保湿震荡孵育1h(需针对不同抗体做优化调整)。
66.4.4.用1*tbst buffer浸洗玻片3min，重复1次。
67.5.二抗孵育
68.5.1.去除玻片上残存的洗液。
69.5.2.直接滴加hrp二抗工作液溶液，浸没样本区域。
70.5.3.室温保湿孵育10min。
71.5.4.用1*tbst buffer浸洗玻片3min，重复1次。
72.6.荧光染色放大信号
73.6.1.去除玻片上残存的洗液。
74.6.2.用移液器在玻片上滴加1*染料工作液100ul(使用信号放大液按1∶100稀释)浸没样本区域。
75.6.3.室温保湿震荡孵育10min。
76.6.4.1*tbst buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。
77.6.5.微波修复，室温自然冷却至室温。
78.6.6.灭菌水洗片1次，1*tbst buffer浸片2min。
79.6.7.单染结束，封片观察或追加后续染色(建议：从步骤3封闭开始后续染色)。每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用tbst覆盖样品，防止干片。
80.7.染核及封片滴加1
×
dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1
×
tbst浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。
81.8.阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。
82.实施例1
83.本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，包括以下组份：
84.抗原染液(5份)：tsa520、tsa570、tsa620、tsa650、tsa700；
85.细胞核染液(1份)：dapi；
86.信号放大液(4份)；
87.hrp酶标二抗聚合物(1份)：鼠兔通用聚合物hrp酶标二抗；
88.缓冲液(1份)：pbst；
89.抗荧光淬灭封片剂(1份)。
90.本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，包括如下步骤：
91.样品为4wt％多聚甲醛固定，石蜡包埋的肺腺癌组织。
92.(1)烘箱60℃烤片30min。
93.(2)二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化：二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、100wt％乙醇(5min)、100wt％乙醇(5min)、95wt％乙醇(3min)、85wt％乙醇(3min)、75wt％乙醇(3min)、去离子水(5min)。
94.(3)取200ml ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液加入染色盒中，将脱蜡水化后的组织切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
95.(4)每切片加100μl 3wt％h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min
×
3次。
96.(5)除去pbst液，每张切片加100μl 5wt％山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
97.(6)切片加100μl稀释后的一抗ttf-1(1∶200)，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min
×
3次。
98.(7)除去pbst，每张切片加100μl抗兔二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
99.(8)除去pbst，每张切片加100μl现配的1*tsa620染料工作液(使用信号放大液按1∶100稀释)，孵育10min后，置入pbst内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。
100.(9)第一轮染色完成的切片，再次置入ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液中进行第二轮修复。之后按照下述对照表的顺序与条件重复步骤(5)-(8)。
101.(10)按照表1的顺序进行抗体稀释和染色。
102.表1抗体稀释比例、染料对照及染色顺序对照表
[0103][0104]
(11)滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*pbst浸洗玻片3次，每次2min。
[0105]
(12)滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。
[0106]
(13)用3dhistech pannoramic midi ii扫描成像。
[0107]
如图1所示，肺腺癌肿瘤细胞呈ttf-1(黄色，细胞核)、napsina(绿色，细胞质)、cytokeratin-7(红色，细胞质)阳性表达，p63呈阴性，无表达。
[0108]
图1结果说明此检测方法能够在同一张肺腺癌切片上同时呈现多个肺腺癌特异性肿瘤标志物的荧光信号，并通过肺鳞癌特异性标志物在该片不显示荧光信号来区分两种不同的肺癌。
[0109]
实施例2
[0110]
本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，同实施例1。
[0111]
本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，包括如下步骤：
[0112]
样品为4wt％多聚甲醛固定，石蜡包埋的肺鳞癌组织。
[0113]
(1)烘箱60℃烤片30min。
[0114]
(2)二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化：二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、
100％乙醇(5min)、100％乙醇(5min)、95％乙醇(3min)、85％乙醇(3min)、75％乙醇(3min)、去离子水(5min)。
[0115]
(3)取200ml ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液加入染色盒中，将脱蜡水化后的组织切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
[0116]
(4)每切片加100μl 3wt％h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min
×
3次。
[0117]
(5)除去pbst液，每张切片加100μl 5wt％山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
[0118]
(6)切片加100μl稀释后的一抗ck5/6(1∶200)，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min
×
3次。
[0119]
(7)除去pbst，每张切片加100μl抗兔二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
[0120]
(8)除去pbst，每张切片加100μl现配的1*tsa620染料工作液(使用信号放大液按1∶100稀释)，孵育10min后，置入pbst内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。
[0121]
(9)第一轮染色完成的切片，再次置入ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液中进行第二轮修复。之后按照下述对照表的顺序与条件重复(5)-(8)步骤。
[0122]
(10)按照表2的顺序进行抗体稀释和染色。
[0123]
表2抗体稀释比例、染料对照及染色顺序对照表
[0124][0125]
(11)滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*pbst浸洗玻片3次，每次2min。
[0126]
(12)滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。
[0127]
(13)用3dhistech pannoramic midi ii扫描成像。
[0128]
如图2所示，肺鳞癌肿瘤细胞呈p63(绿色，细胞核)、p40(黄色，细胞核)、ck5/6(紫色，细胞质)阳性表达，ttf-1呈阴性，无表达。
[0129]
图2结果说明此检测方法能够在同一张肺鳞癌切片上同时呈现多个肺鳞癌特异性肿瘤标志物的荧光信号，并通过肺腺癌特异性标志物在该片不显示荧光信号来区分两种不同的肺癌。
[0130]
实施例3
[0131]
本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，同实施例1。
[0132]
本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，包括如下步骤：
[0133]
样品为4wt％多聚甲醛固定，石蜡包埋的肺腺癌类器官。
[0134]
(1)烘箱60℃烤片30min。
[0135]
(2)二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化：二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、100％乙醇(5min)、100％乙醇(5min)、95％乙醇(3min)、85％乙醇(3min)、75％乙醇(3min)、
去离子水(5min)。
[0136]
(3)取200ml ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液加入染色盒中，将脱蜡水化后的切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
[0137]
(4)每切片加100μl 3％ h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min
×
3次。
[0138]
(5)除去pbst液，每张切片加100μl 5％山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
[0139]
(6)切片加100μl稀释后的一抗ttf-1(1∶200)，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min
×
3次。
[0140]
(7)除去pbst，每张切片加100μl抗兔二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
[0141]
(8)除去pbst，每张切片加100μl现配的1*tsa620染料工作液(使用信号放大液按1∶100稀释)，孵育10min后，置入pbst内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。
[0142]
(9)第一轮染色完成的切片，再次置入ph6.0的柠檬酸钠抗原修复液中进行第二轮修复。之后按照下述对照表的顺序与条件重复(5)-(8)步骤。
[0143]
(10)按照表3的顺序进行抗体稀释和染色。
[0144]
表3抗体稀释比例、染料对照及染色顺序对照表
[0145][0146]
(11)滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*pbst浸洗玻片3次，每次2min。
[0147]
(12)滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。
[0148]
(13)用3dhistech pannoramic midi ii扫描成像。
[0149]
如图3所示，肺腺癌类器官肿瘤细胞呈ttf-1(黄色，细胞核)、napsina(绿色，细胞质)、cytokeratin-7(红色，细胞质)阳性表达，p63呈阴性，无表达。
[0150]
图3结果说明此检测方法能够在同一张肺腺癌类器官切片上同时呈现多个肺腺癌特异性肿瘤标志物的荧光信号，且鳞癌特异性标志物不显色，共同证明该类器官属于肺腺癌类器官。
[0151]
实施例4
[0152]
本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，同实施例1。
[0153]
本实施例的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，包括如下步骤：
[0154]
样品为4wt％多聚甲醛固定，石蜡包埋的肺鳞癌类器官。
[0155]
(1)烘箱60℃烤片30min。
[0156]
(2)二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化：二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、100％乙醇(5min)、100％乙醇(5min)、95％乙醇(3min)、85％乙醇(3min)、75％乙醇(3min)、去离子水(5min)。
[0157]
(3)取200ml ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液加入染色盒中，将脱蜡水化后的切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
[0158]
(4)每切片加100μl 3wt％h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min
×
3次。
[0159]
(5)除去pbst液，每张切片加100μl 5wt％山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
[0160]
(6)切片加100μl稀释后的一抗ck5/6(1∶200)，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min
×
3次。
[0161]
(7)除去pbst，每张切片加100μl抗兔二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
[0162]
(8)除去pbst，每张切片加100μl现配的1*tsa620染料工作液(使用信号放大液按1∶100稀释)，孵育10min后，置入pbst内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。
[0163]
(9)第一轮染色完成的切片，再次置入ph6.0的柠檬酸钠抗原修复液中进行第二轮修复。之后按照下述对照表的顺序与条件重复(5)-(8)步骤。
[0164]
(10)按照表4的顺序进行抗体稀释和染色。
[0165]
表4抗体稀释比例、染料对照及染色顺序对照表
[0166][0167]
(11)滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*pbst浸洗玻片3次，每次2min。
[0168]
(12)滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。
[0169]
(13)用3dhistech pannoramic midi ii扫描成像。
[0170]
如图4所示，肺鳞癌肿瘤细胞呈p63(绿色，细胞核)、p40(黄色，细胞核)、ck5/6(紫色，细胞质)阳性表达，ttf-1呈阴性，无表达。
[0171]
图4结果说明此检测方法能够在同一张肺鳞癌类器官切片上同时呈现多个肺鳞癌特异性肿瘤标志物的荧光信号，且腺癌特异性标志物不显色，共同证明该类器官属于肺鳞癌类器官。
[0172]
对比例1
[0173]
本对比例的样本为4wt％多聚甲醛固定，石蜡包埋的肺腺癌类器官，检测步骤如下：
[0174]
(1)烘箱60℃烤片30min。
[0175]
(2)二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化：二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、100wt％乙醇(5min)、100wt％乙醇(5min)、95wt％乙醇(3min)、85wt％乙醇(3min)、75wt％乙醇(3min)、去离子水(5min)。
[0176]
(3)取200ml ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液加入染色盒中，将脱蜡水化后的切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭
电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
[0177]
(4)每切片加100μl 3wt％h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min
×
3次。
[0178]
(5)除去pbst液，每张切片加100μl 5wt％山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
[0179]
(6)切片加100μl稀释后的一抗ck7(1∶400)，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min
×
3次。
[0180]
(7)除去pbst，每张切片加100μl抗兔二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
[0181]
(8)除去pbst，每张切片加100μl新鲜配制的dab显色液(用dab稀释液稀释dab底物得到，现配现用)，室温孵育5分钟，自来水冲洗玻片。
[0182]
(9)加入100μl苏木素,孵育3分钟，自来水冲洗返蓝。
[0183]
(10)梯度乙醇脱水后，二甲苯透明，中性树脂封片后用3dhistech pannoramic midi ii成像。
[0184]
如图5所示，棕色dab信号为ck7，蓝色为苏木素染色的细胞核，黑色杂质为肺组织内由吸烟等引入的杂质。可见光下，该杂质无法屏蔽，可能对dab阳性信号产生干扰，成像效果不如多重荧光免疫组化。
[0185]
对比例2
[0186]
本对比例的样本为4wt％多聚甲醛固定，石蜡包埋的肺腺癌类器官，检测步骤如下：
[0187]
(1)烘箱60℃烤片30min。
[0188]
(2)二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化：二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、100wt％乙醇(5min)、100wt％乙醇(5min)、95wt％乙醇(3min)、85wt％乙醇(3min)、75wt％乙醇(3min)、去离子水(5min)。
[0189]
(3)取200ml ph值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液加入染色盒中，将脱蜡水化后的切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，将抗原修复完的组织切片画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
[0190]
(4)每切片加100μl 3wt％h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min
×
3次。
[0191]
(5)除去pbst液，每张切片加100μl 5wt％山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
[0192]
(6)切片加100μl稀释后的一抗napsina(1∶400)，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min
×
3次。
[0193]
(7)除去pbst，每张切片加100μl抗兔二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
[0194]
(8)除去pbst，每张切片加100μl现配的1*tsa480染料工作液(使用信号放大液按1∶100稀释)，孵育10min后，置入pbst内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。
[0195]
(11)滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*pbst浸洗玻片3次，每次2min。
[0196]
(12)滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。
[0197]
(13)用3dhistech pannoramic midi ii扫描成像。
[0198]
如图6所示，深蓝色信号为细胞核，浅蓝色信号(在细胞核周围)为napsina(细胞质)，浅蓝色信号(中间无细胞核)为红细胞非特异性荧光，在480信号通道有较强非特异自发荧光，对成像及后续分析产生干扰。
[0199]
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，其特征在于：染色步骤，包括按照抗原a组和/或b组中的顺序，使用对应的一抗次序对肺癌样本进行孵育，使用抗原染液对孵育后的肺癌样本进行染色；a组：ttf-1、cytokeratin-7、napsina、p63；b组：ck5/6、ttf-1、p63、p40；当执行a组时，tsa620染色ttf-1，tsa650染色cytokeratin-7，tsa520染色napsina，tsa700染色p63；当执行b组时，tsa620染色ck5/6，tsa650染色ttf-1，tsa520染色p63，tsa570染色p40。2.根据权利要求1所述的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，其特征在于：包括按照a组或b组中的顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。3.根据权利要求2所述的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，其特征在于：执行完a组或b组中的染色后，使用核染色剂进行染色。4.根据权利要求3所述的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，其特征在于：所述核染色剂包括dapi。5.根据权利要求1-4任一项所述的肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，其特征在于：所述肺癌样本为肺腺癌样本或肺鳞癌样本。6.根据权利要求5肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，其特征在于：还包括成像步骤；当成像结果呈现黄色、绿色、红色，判断所述肺癌样本为肺腺癌样本；当成像结果呈现黄色、绿色、紫色，判断所述肺癌样本为肺鳞癌样本。7.肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，其特征在于：包括抗体ttf-1、cytokeratin-7、napsina、p63、ck5/6、p40；还包括抗原染液tsa620，tsa650，tsa52，tsa5700，tsa700。8.根据权利要求7所述的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，其特征在于：还包括信号放大液、hrp酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液。9.根据权利要求7或8任一项所述的肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，其特征在于：还包括用于脱蜡水化的试剂；所述用于脱蜡水化的试剂为二甲苯和乙醇。10.肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒的应用，其特征在于：将权利要求7-9任一项所述试剂盒应用于肺腺癌或肺鳞癌的判断中；当检测结果呈现黄色、绿色、红色，判断所述肺癌样本为肺腺癌样本；当检测结果呈现黄色、绿色、紫色，判断所述肺癌样本为肺鳞癌样本。

技术总结
本发明属于用于癌症检测的免疫测定技术领域，涉及肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法及其试剂盒和应用。针对现有技术肺癌组织学分型中肺鳞癌和肺腺癌的检测方法，染色时，可见光下，杂质无法屏蔽，对阳性信号产生干扰，成像效果差；或染色液选择不当，非特异自发荧光较强，对成像及后续分析产生干扰；以及操作步骤复杂的技术问题，本申请提供肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法，使用对应的一抗次序对肺癌样本进行孵育，配对的抗原染液对肺癌样本进行染色，可精准的区分肺腺癌或肺鳞癌。本申请还提供了肺癌组织学分型多重荧光组化检测试剂盒，操作简单，成本较低，将其应用于肺腺癌或肺鳞癌的判断中，使得临床快速区分肺腺癌和肺鳞癌成为可能。肺鳞癌成为可能。肺鳞癌成为可能。


技术研发人员：董浩 钱辰颖 王妤婷 汪嘉怡 朱迪
受保护的技术使用者：爱必信（上海）生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/10/15