一种黄颡鱼IL-22重组蛋白及其制备方法和应用

一种黄颡鱼il-22重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种黄颡鱼il-22重组蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.黄颡鱼(pseudobagrus fulvidraco)隶属于鲶形目(siluriformes)、鲿科(bagridae)、黄颡鱼属(pelteobagrus)，俗称昂刺鱼、黄辣丁，是一种在我国广泛分布的小型底层经济鱼类。
3.免疫系统是鱼体执行免疫防卫功能的单位，由免疫组织、免疫细胞和体液免疫因子组成，可分为适应性免疫和固有免疫。鱼类的免疫系统是鱼体自身抗病力的基础，鱼类免疫器官的生长、发育、成熟及细胞免疫、体液免疫都直接影响着鱼类的免疫功能。
4.白细胞介素22是细胞因子il-10家族的成员，是一类与白细胞或免疫细胞交互作用的多功能细胞因子，主要来源于t细胞和固有淋巴细胞。il-22与其受体结合后，可经由jak-stat途径激活stat3，也可激活stat1及stat5，il-22还参与nf-kb、mapk及pi3k-akt-mtor通路。这些信号通路可以增强抗炎、分裂、增殖和抗凋亡的相关基因，从而增强机体的免疫功能。此外，il-22还有防止肝组织损伤、诱导抗菌肽表达等功能。
5.综合来说，在硬骨鱼类中，少数鱼类成功获得了il-22重组蛋白，并对其生物活性进行研究。重组cfil-22诱导成纤维细胞中纤连蛋白、干扰素和nk-lysin-1关键基因的表达，并促进斑点叉尾鮰成纤维细胞增殖；重组鲤鱼il-22a/b激活了头肾白细胞的jak/stat信号通路，并上调il-1β和tnf-α等炎症因子的表达。而目前尚未有关于黄颡鱼il-22重组蛋白生物活性的相关研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种黄颡鱼il-22重组蛋白及其制备方法和应用，黄颡鱼il-22重组蛋白可以抑制炎症因子的表达，表明黄颡鱼il-22重组蛋白在肠道免疫中发挥着重要作用，为研究il-22重组蛋白在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。
7.为实现上述目的，本发明提供了一种黄颡鱼il-22重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了上述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白的编码基因，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还提供了一种载体，所述载体包含如seq id no.2所示的核苷酸序列。
10.本发明还提供了一种细胞，所述细胞包含如权利要求3所述的载体。
11.本发明还提供了上述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
12.步骤1：提取黄颡鱼肠道组织的总rna，将其反转成cdna后进行pcr扩增，扩增产物经回收、纯化后得到黄颡鱼il-22重组蛋白的编码基因片段；
13.步骤2：将步骤1的基因片段与载体pet-32a(+)同时进行bamh i和ecor i双酶切，
经回收、纯化、连接后，得到原核表达载体pet32a-il22；
14.步骤3：将原核表达载体pet32a-il22提取质粒后转化入bl21(de3)感受态细胞；
15.步骤4：用iptg诱导，使黄颡鱼il-22蛋白在bl21菌株中成功表达；
16.步骤5：表达菌经过超声破碎后，对沉淀和上清的重组蛋白进行分析；
17.步骤6：使用不同浓度的iptg对蛋白进行诱导，提高il-22重组蛋白的产量，并确定iptg诱导表达的最佳浓度；
18.步骤7：经镍柱纯化、复性以及浓缩后﹐得到适宜浓度的黄颡鱼il-22重组蛋白。
19.本发明还提供了上述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白在抑制炎症因子表达中的应用。
20.本发明还提供了上述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白在鱼类肠道免疫调控中的应用。
21.本发明所述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白及其制备方法和应用的优点和积极效果是：
22.1、本发明通过构建了重组质粒pet32a-il22，并转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞，经iptg诱导，黄颡鱼il-22蛋白在bl21菌株中成功表达。表达菌经过超声破碎后，对沉淀和上清的重组蛋白进行分析，发现重组il-22蛋白主要存在于沉淀中，表明il-22重组蛋白并不是以可溶蛋白形式存在，而是以包涵体形式存在。
23.2、本发明中低浓度(5ng/ml)的重组蛋白抑制了绝大多数炎症因子的表达，仅上调了il-34的表达；高浓度(20ng/ml)的重组蛋白显著诱导了il-1β、il-6、il-8、il-17a/f1、il-34以及tnf-α的表达，同时下调了il-10、il-21、tgf-β1和stat3的表达，表明黄颡鱼il-22重组蛋白在肠道免疫中发挥着重要作用，为研究il-22在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。
24.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
25.图1为本发明实施例中不同浓度iptg诱导il-22-pet32a菌株的表达结果的电泳图；
26.图2为本发明实施例中il-22重组蛋白表达的部位检测结果电泳图；
27.图3为本发明实施例中黄颡鱼il-22重组蛋白的sds-page电泳分析和western blot检测图；
28.图4为本发明实施例中培养细胞中肠道上皮细胞标志性蛋白基因的定量pcr表达(图a)、半定量表达(图b)和灰度值分析(图c)；
29.图5为本发明实施例中il-22重组蛋白对黄颡鱼原代肠上皮细胞基因表达的影响。
具体实施方式
30.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
31.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
32.实施例1黄颡鱼白介素-22重组蛋白的制备
33.1、重组黄颡鱼il-22基因片段的扩增：通过测序成功获得的il-22基因序列，设计特异性引物il22-ex-f和il22-ex-r，以测序成功的菌液为反应模板，扩增il-22编码区片段。pcr反应程序如表1所示：
34.表1
[0035][0036]
il22-ex-f：5
’‑
cgcggatccatgttggggaagatgaag-3’(seq id no.3所示)，il22-ex-r：5
’‑
ccggaattcctaggatgcactggtggct-3’(seq id no.4所示)。
[0037]
2、原核表达质粒的构建:根据上述引物获得连接带有酶切位点bamh i和ecor i的pmd19t-il22。将连接带有酶切位点bamh i和ecor i的pmd19t-il22质粒和pet-32a(+)载体分别用内切酶bamh i和ecor i进行双酶切。双酶切体系如表2所示：
[0038]
表2
[0039][0040]
3、将酶切好的质粒和载体产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测。琼脂糖电泳结束后，于紫外灯下快速切下目的片段。
[0041]
4、用t4 dna连接酶将目的片段与pet-32a(+)连接，目的片段与载体摩尔比为3:1。反应体系混匀后放入pcr仪中，16℃连接过夜。反应体系如表3所示：
[0042]
表3
[0043][0044]
5、对其进行转化、筛选以及测序后，将构建成功的载体pet32a-il22提取质粒后转化入bl21(de3)感受态细胞；
[0045]
6、随后将过夜培养的菌液接种到液体培养基(amp抗性)中，分别用浓度为0.1mm、0.2mm、0.5mm、1mm和2mm的iptg进行试诱导，采用sds-page电泳检测il-22蛋白的试诱导效果；结果如图1所示，图1为不同浓度iptg诱导il-22-pet32a菌株的表达，最终确定iptg诱导表达的最佳浓度为1mm。
[0046]
7、将诱导后的e.coli bl21(de3)大肠杆菌经过超声破碎后进行sds-page电泳和考染。
[0047]
8、为检测il-22蛋白是否形成包涵体，对菌液进行一系列处理后，分别对上清和沉淀做sds-page电泳和考马斯亮蓝染色，检测il-22蛋白表达部位。结果如图2所示，图2为il-22重组蛋白表达的部位检测，结果表明黄颡鱼il-22重组蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。
[0048]
9、采用镍柱纯化的方式对成功表达的il-22重组蛋白进行纯化。用含有不同浓度咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，所有洗脱液分别收集到不同的1.5ml离心管中，标上记号。每个咪唑浓度取少量进行sds-page电泳和考染，检测洗脱纯度和效率。
[0049]
10、使用透析袋，通过梯度透析复性目的蛋白。
[0050]
11、用考马斯亮蓝法测定复性蛋白的浓度以评估浓缩程度。
[0051]
12、为检测蛋白抗体特异性，将il-22重组蛋白作为免疫源制作黄颡鱼重组il-22的多克隆抗体。
[0052]
13、采用his标签抗体，用western blot技术检测该蛋白的特异性。结果如图3所示，图3为黄颡鱼il-22重组蛋白的sds-page电泳分析和westernblot检测，其中泳道m表示marker；泳道1表示未诱导的表达菌提取物；泳道2表示诱导后的表达菌提取物；泳道3表示纯化后的重组蛋白；泳道4表示纯化后重组蛋白的westernblot检测。结果说明得到的纯化蛋白大小符合预期，有良好的特异性。
[0053]
实施例2黄颡鱼原代肠上皮细胞分离、培养
[0054]
用无菌剪刀剪开黄颡鱼腹部，取出肠道并放入含有1％双抗的pbs中，转移至生物安全柜内；
[0055]
用含有1％双抗的pbs清洗肠道，将清洗干净的肠道转移至ep管中，用无菌剪刀将肠道剪碎成小于1mm3的小块，然后转移至50ml无酶无菌管中，加入约5倍体积的细胞消化液，置于恒温摇床中，28℃，100rpm消化35min；
[0056]
随后加入与消化液等量的消化终止液，使用1ml无菌塑料滴管反复吹打3min，然后
静置1min；
[0057]
吸取上清，通过100μm细胞筛网，滤液在4℃，1000rpm离心5min，去除上清，加入10ml含有1％双抗的pbs重悬沉淀再次离心；
[0058]
向沉淀中加入适量完全培养基重悬沉淀后，吸取10μl细胞液与0.4％台盼蓝混合，注入血球计数板中，计算细胞密度和活细胞比例，然后调整活细胞密度至105个/ml；
[0059]
将细胞悬液接种到铺有ⅰ型胶原蛋白的12孔细胞培养板中，每孔培养体积为1ml。将培养板放置于28℃、5％co2的细胞培养箱中；
[0060]
采用qrt-pcr和半定量实验分析一般肠上皮细胞标志性蛋白基因e-cadherin、claudin、occludin和zo-1在培养细胞中的表达。所用到的引物序列如seq id no.5-14所示。结果如图4所示，图4为培养细胞中肠道上皮细胞标志性蛋白基因的定量pcr表达(图a)、半定量表达(图b)和灰度值分析(图c)，其中图b中，泳道m：marker；泳道1：zo-1；泳道2：claudin；泳道3：occludin；泳道4：e-cadherin。
[0061]
cdna合成反应体系及程序如表4所示：
[0062]
表4
[0063][0064][0065]
定量pcr反应程序如表5所示：
[0066]
表5
[0067]
[0068]
实施例3黄颡鱼原代肠上皮细胞重组蛋白处理
[0069]
将新鲜制备的黄颡鱼肠上皮细胞悬液接种到铺有ⅰ型胶原蛋白的12孔细胞培养板中，每孔培养体积为1ml；
[0070]
将其放在28℃、5％co2细胞培养箱中生长48h；
[0071]
将不同浓度的黄颡鱼重组il-22蛋白(5ng/ml、20ng/ml)加入培养孔内；
[0072]
培养12h后，收集细胞并提取总rna。采用qrt-pcr检测il-22、il-1β、il-6、il-8、il-10、il-21、il-34、il-17a/f1、tgf-β1、stat3和tnf-α的表达。实验组和对照组各取3孔作为重复。所需的引物序列如seq id no.15-36所示。
[0073]
结果如图5所示，图5为il-22重组蛋白对黄颡鱼原代肠上皮细胞基因表达的影响。结果表明，用不同浓度的il-22重组蛋白处理12h后，发现5ng/ml的重组蛋白抑制了绝大多数炎症因子的表达，仅上调了il-34的表达；20ng/ml的重组蛋白显著诱导了il-1β、il-6、il-8、il-17a/f1、il-34以及tnf-α的表达，同时下调了il-10、il-21、tgf-β1和stat3的表达。这些结果表明黄颡鱼il-22重组蛋白在肠道免疫中发挥着重要作用，为研究il-22在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。
[0074]
因此，本发明采用上述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白及其制备方法和应用，黄颡鱼il-22重组蛋白可以抑制炎症因子的表达，表明黄颡鱼il-22重组蛋白在肠道免疫中发挥着重要作用，为研究il-22重组蛋白在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。
[0075]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种黄颡鱼il-22重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白的编码基因，其特征在于：编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种载体，其特征在于：所述载体包含如seq id no.2所示的核苷酸序列。4.一种细胞，其特征在于：所述细胞包含如权利要求3所述的载体。5.如权利要求1所述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取黄颡鱼肠道组织的总rna，将其反转成cdna后进行pcr扩增，扩增产物经回收、纯化后得到黄颡鱼il-22重组蛋白的编码基因片段；步骤2：将步骤1的基因片段与载体pet-32a(+)同时进行bamh i和ecor i双酶切，经回收、纯化、连接后，得到原核表达载体pet32a-il22；步骤3：将原核表达载体pet32a-il22提取质粒后转化入bl21(de3)感受态细胞；步骤4：用iptg诱导，使黄颡鱼il-22蛋白在bl21菌株中成功表达；步骤5：表达菌经过超声破碎后，对沉淀和上清的重组蛋白进行分析；步骤6：使用不同浓度的iptg对蛋白进行诱导，提高il-22重组蛋白的产量，并确定iptg诱导表达的最佳浓度；步骤7：经镍柱纯化、复性以及浓缩后﹐得到适宜浓度的黄颡鱼il-22重组蛋白。6.如权利要求1所述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白在抑制炎症因子表达中的应用。7.如权利要求1所述的一种黄颡鱼il-22重组蛋白在鱼类肠道免疫调控中的应用。

技术总结
本发明公开了一种黄颡鱼IL-22重组蛋白及其制备方法和应用，涉及生物工程技术领域。本发明中黄颡鱼IL-22重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。黄颡鱼IL-22重组蛋白可以抑制炎症因子的表达，表明黄颡鱼IL-22重组蛋白在肠道免疫中发挥着重要作用，为研究IL-22重组蛋白在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。组蛋白在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。组蛋白在鱼类肠道中的调控作用提供借鉴意义。


技术研发人员：张凯 宦恒庆 丁玉兵 尹绍武 张宇飞
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/15