包载多酶联用的纳米粒及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及包载多酶联用的纳米粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.高尿酸血症(hua)是一种由血清尿酸(serum uric acid，sua)水平引起的代谢紊乱，在血液中主要以ph(约7.4)的尿酸离子存在。高水平的尿酸会形成msu晶体在血液中析出，并在关节或器官中沉积，从而过度刺激身体的免疫系统，进而诱发痛风。与此同时，尿酸盐和尿酸盐晶体会沉积在肾脏和其他组织中，导致组织损伤；而且高尿酸血症轻症可引起肾小动脉硬化和肾小球高血压，并破坏肾脏的自动调节，重症可能最终导致肾小球硬化或尿毒症。
3.相关技术提供的药物治疗方法是降尿酸治疗(urate-lowering therapy，ult)，黄嘌呤氧化酶抑制剂(xo)和促尿酸排泄药(uricosurics)通过增加肾尿酸排泄发挥作用。其中，大分子药物中的尿酸酶可快速降解尿酸，活性高，与聚乙二醇(peg)偶联成pegloticase(普瑞凯希)，pegloticase是一种具有低免疫原性、高溶解度和长血清半衰期的肽酶。但是，尿酸酶在氧化尿酸的过程中会产生h2o2，而h2o2的过度积累会损害细胞。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供包载多酶联用的纳米粒及其制备方法和应用，该包载多酶联用的纳米粒能够改善h2o2、致病原的过度积累和炎症反应而导致损害细胞的问题。
5.本发明是这样实现的：
6.第一方面，本发明提供一种包载多酶联用的纳米粒，包载多酶联用的纳米粒包括核心粒子和包覆在核心粒子外的壳层；其中，核心粒子包括小分子药物粒子、尿酸酶和过氧化氢酶，壳层为交联层。
7.在可选的实施方式中，小分子药物粒子为姜黄素蛋白粒子；交联层为单宁酸/铁聚合物层。
8.在可选的实施方式中，包载多酶联用的纳米粒的粒径为230-250nm。
9.在可选的实施方式中，酶与小分子药物粒子的质量比为50:10-50:20。
10.在可选的实施方式中，交联层上还具有修饰物质。
11.第二方面，本发明提供如前述实施方式任一项的包载多酶联用的纳米粒的制备方法，包括：
12.将药物纳米粒和混合酶溶液与饱和盐溶液混合，得到亚稳定性颗粒；
13.将亚稳定性颗粒用交联剂固化。
14.在可选的实施方式中，药物纳米粒的制备方法包括：将药物溶液与载体混合，超声处理。
15.在可选的实施方式中，载体包括白蛋白、酪蛋白、普朗尼克、pva和pvp中的至少一
种。
16.在可选的实施方式中，交联剂包括设定交联物质、多巴胺和丙烯酰胺三者中的至少一者，其中，设定交联物质包括单宁酸和氯化铁。
17.在可选的实施方式中，饱和盐溶液包括硫酸铵溶液、硫酸钾溶液、磷酸钾溶液和氯化钠溶液中的至少一种。
18.在可选的实施方式中，还包括：将亚稳定性颗粒用交联剂固化后，还用孵育剂进行孵育；其中，孵育剂中的靶头包括多肽、蛋白、抗体、多糖、小分子配体中的一种或多种。
19.第三方面，本发明提供如前述实施方式任一项的包载多酶联用的纳米粒的应用，包括：包载多酶联用的纳米粒在清除活性氧、线粒体保护、抑制炎症反应、降解尿酸、预防或治疗高尿酸症、预防或治疗氧化应激损伤、或炎症性疾病的药物中的应用。
20.本发明包括以下有益效果：
21.本发明的包载多酶联用的纳米粒的制备方法制备出的包载多酶联用的纳米粒，采用壳层包裹核心粒子的方式，将尿酸酶和过氧化氢酶限制在一个有限的空间内，能够在尿酸酶将尿酸氧化产生h2o2过程中，使h2o2一生成就被和尿酸酶处于同一有限空间的过氧化氢酶分解，确保了分解h2o2的效率和稳定性，改善尿酸和h2o2的过度积累而导致损害细胞的问题。其中，本发明的包载多酶可以与小分子抗炎药物联用，进一步改善炎症引发得机体损伤。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为本发明实验例1中纳米粒的粒径表征图；
24.图2中a为本发明实验例2中raw246.7细胞的不同形态图、b为本发明实验例2中细胞安全性检验结果图、c为本发明实验例2中不同药物比例下no释放量图；
25.图3为本发明实验例3炎症培养基中，不同浓度比例的uc和cas-cur干预下nrk-52e的凋亡情况图；
26.图4为本发明实验例4中炎症培养基中纳米粒对nrk-52e的凋亡率的变化图；
27.图5为本发明实验例5中炎症培养基中，不同药物处理后nrk-52e细胞内ros水平图；
28.图6为本发明实验例6中炎症培养基中，不同药物处理后nrk-52e细胞内线粒体的活性图；
29.图7为本发明实验例7中细胞上清液中tnf-α、il-6、il-1β的释放水平图；
30.图8为本发明实验例8中注射不同药物后sd大鼠血清ua水平图；
31.图9为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片在200
×
显微镜下图；
32.图10为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图一；
33.图11为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图二；
34.图12为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图三；
35.图13为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图四；
36.图14为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图五；
37.图15为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图六；
38.图16为本发明实验例8中大鼠肾脏染色切片图在400
×
显微镜下图七。
具体实施方式
39.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
40.本发明提供一种包载多酶联用的纳米粒，且包括核心粒子和包覆在核心粒子外的壳层；其中，核心粒子包括小分子药物粒子、尿酸酶和过氧化氢酶，壳层为交联层和修饰的靶头。
41.该包载多酶联用的纳米粒采用壳层包裹核心粒子的方式，将尿酸酶和过氧化氢酶限制在一个有限的空间内，能够在尿酸酶将尿酸氧化产生h2o2过程中，使h2o2一生成就被和尿酸酶处于同一有限空间的过氧化氢酶分解，确保了分解h2o2的效率和稳定性，改善h2o2的过度积累而导致损害细胞的问题。
42.需要说明的是，尿酸酶可快速降解尿酸，过氧化氢酶可清除尿酸酶产生的过氧化氢和病灶部位的活性氧，姜黄素可抑制病灶的炎症反应，三者联用可提高药物的治疗效果。
43.可选地，小分子药物粒子为姜黄素蛋白粒子，姜黄素(cur)是姜黄根状茎中的一种天然疏水多酚，具有抗炎和抗氧化等多种药理活性，改活性有利益治疗高尿酸血症引起的肾损伤。
44.当然，在其他实施方式中，小分子药物粒子还可以是聚合物粒子等，例如：姜黄素的聚合物粒子。
45.可选地，交联层为单宁酸/铁聚合物层；单宁酸/铁聚合物层可以作为递药系统装载核心粒子药物，以使尿酸酶和过氧化氢酶、以及姜黄素被限制在一个有限的空间内，不仅有效地分解h2o2，改善h2o2的过度积累而导致损害细胞的问题，还能够有效地利用姜黄素抗炎、抗氧化；而且，在小分子药物粒子的表面交联形成共聚物而固化微粒，还使包载多酶联用的纳米粒具有高活性反应位点。
46.可选地，交联层上还具有修饰物质，例如：多肽、蛋白、抗体、多糖、小分子配体等靶头；这样一来，可以增强药物的作用时间，从而提高药效。
47.可选地，包载多酶联用的纳米粒为球形，包载多酶联用的纳米粒的粒径为230-250nm，例如：230nm、235nm、240nm、245nm、250nm等；较小粒径的包载多酶联用的纳米粒能够更好的发挥对应的作用效果。
48.可选地，酶与小分子药物粒子的质量比为50:10-50:20，例如：50:10、50:13、50:15、50:17、50:20等；优化酶与小分子药物粒子的质量比，能够在用该包载多酶联用的纳米粒改善高尿酸血症时，有效地降低尿酸和分解h2o2，并且有效地改善炎症反应对细胞、肾的损伤。
49.本发明还提供一种包载多酶联用的纳米粒的制备方法，其包括：
50.将药物纳米粒和混合酶溶液与饱和盐溶液混合，得到亚稳定性颗粒；
51.将亚稳定性颗粒用交联剂固化。
52.这样一来，可以形成壳层，以包裹核心粒子，将尿酸酶和过氧化氢酶限制在一个有限的空间内，能够在尿酸酶将尿酸氧化产生h2o2过程中，使h2o2一生成就被和尿酸酶处于同一有限空间的过氧化氢酶分解，确保了分解h2o2的效率和稳定性，改善h2o2的过度积累而导致损害细胞的问题。
53.可选地，药物纳米粒的制备方法包括：将药物溶液与载体混合，超声处理。
54.可选地，载体包括白蛋白、酪蛋白、普朗尼克、pva和pvp中的至少一种。
55.可选地，交联剂包括交联剂包括设定交联物质、多巴胺和丙烯酰胺三者中的至少一者，其中，设定交联物质包括单宁酸和氯化铁，例如：单宁酸和氯化铁、单用多巴胺、单用丙烯酰胺、同时使用单宁酸、氯化铁和多巴胺，同时使用单宁酸、氯化铁和丙烯酰胺、同时使用多巴胺和丙烯酰胺等，在此不作具体限定。其中，当交联剂为多巴胺或丙烯酰胺时，交联层不是单宁酸/铁聚合物层。
56.进一步地，在进行交联固化时，可以依次滴加单宁酸溶液和氯化铁溶液，或者依次滴加单宁酸溶液和氯化铁溶液、以及多巴胺和丙烯酰胺中的至少一者，当然也可以是一次性加入全部单宁酸溶液后，再加入氯化铁溶液，或者、一次性加入全部单宁酸溶液后，再加入氯化铁溶液，之后再加入多巴胺溶液和丙烯酰胺溶液两者中的至少一者；并可以在滴加后震荡，然后通过离心的方式去除未结合的单宁酸、氯化铁等。
57.可选地，饱和盐溶液包括硫酸铵溶液、硫酸钾溶液、磷酸钾溶液和氯化钠溶液中的至少一种。
58.可选地，混合酶溶液的制备方法包括：将酶和缓冲溶液混合，酶包括尿酸酶和过氧化氢酶；缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液中的一种或多种。
59.本发明的包载多酶联用的纳米粒的制备方法还包括：将亚稳定性颗粒用交联剂固化后，还用孵育剂进行孵育；其中，孵育剂中的靶头包括多肽、蛋白、抗体、多糖、小分子配体中的一种或多种，形成长循环纳米粒。这样一来，在交联形成的共聚物的其表面修饰蛋白从而提高纳米粒循环时间。
60.可选地，上述靶头含有活性基团，活性基团为氨基或者巯基；进一步地，靶头为巯基化白蛋白。
61.本发明的包载多酶联用的纳米粒能够应用于清除活性氧、线粒体保护、抑制炎症反应、降解尿酸、预防或治疗高尿酸症、预防或治疗氧化应激损伤、或炎症性疾病的药物中。
62.以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
63.实施例1
64.称取5mg的姜黄素(curcumin，cur)、25mg的酪蛋白酸钠(sodium caseinate，cas)。将cur溶于100μl的二甲基亚砜(dmso)中，配置成50mg/ml的cur母液。将cas溶于1ml纯水，配置成25mg/ml的酪蛋白溶液。将40μl的cur母液加入1ml配置好的cas中，并涡旋30s使cur浓度变成2mg/ml。涡旋后，超声处理(150w，超声3s，间歇2s，5min)，得到姜黄素纳米粒(cas-cur)。
65.称量1mg尿酸酶(uri)、1mg过氧化氢酶(cat)溶于1ml ph＝8硼砂-硼酸缓冲液中配置成1mg/ml的混合酶溶液。饱和硫酸铵溶液、混合酶溶液和水以9:5:1的体积比盐析，并涡
旋30s确保混合均匀。混合均匀后加入姜黄素纳米粒(cas-cur)60μl盐析，涡旋30s。向所得的溶液加入20μl的单宁酸(20mg/ml)，涡旋30s；再加入5μl氯化铁溶液(25mg/ml)，涡旋30s后，离心(14000rpm，10min，4℃)，去上清液，再加入1ml pbs缓冲液重悬后离心，去上清液后，冰浴超声处理(150w，超声3s，间歇2s，8min)，得到核心粒子uc/cur。
66.配制1ml的2.5mg/ml牛血清白蛋白(bsa)溶液，加入15μl 10％tris缓冲液和25μl的tcep溶液(32mg/ml)，打开bsa的二硫键形成巯基(-sh)，混合均匀所得bsa-sh。将uc/cur第一次离心后的沉淀用纯水重悬，并加入650μl bsa-sh溶液，在4℃条件下静置孵育4h。孵育结束后，离心(14000rpm，10min，4℃)，去上清液，再加入1ml pbs缓冲液后冰浴超声处理(150w，超声3s，间歇2s，8min)，得到bsa-uc/cur(包载多酶联用的纳米粒)。
67.实施例2
68.称取5mg的姜黄素(curcumin，cur)、25mg的酪蛋白酸钠(sodium caseinate，cas)。将cur溶于100μl的二甲基亚砜(dmso)中，配置成50mg/ml的cur母液。将cas溶于1ml纯水，配置成25mg/ml的酪蛋白溶液。将40μl的cur母液加入1ml配置好的cas中，并涡旋30s使cur浓度变成2mg/ml。涡旋后，超声处理(150w，超声3s，间歇2s，5min)，得到姜黄素纳米粒。
69.称量1mg尿酸酶(uri)、1mg过氧化氢酶(cat)溶于1ml ph＝8磷酸盐缓冲液中配置成1mg/ml的混合酶溶液。饱和硫酸钾溶液、混合酶溶液和水以9:5:1的体积比盐析，并涡旋30s确保混合均匀。混合均匀后加入姜黄素纳米粒60μl盐析，涡旋30s。向所得的溶液加入20μl的单宁酸(20mg/ml)，涡旋30s；再加入5μl氯化铁溶液(25mg/ml)，以及20μl多巴胺溶液(50mg/ml)，涡旋30s后，离心(14000rpm，10min，4℃)，去上清液，再加入1ml pbs缓冲液重悬后离心，去上清液后，冰浴超声处理(150w，超声3s，间歇2s，8min)，得到核心粒子。
70.配制1ml的2.5mg/ml牛血清白蛋白(bsa)溶液，加入15μl 10％tris缓冲液和25μl的tcep溶液(32mg/ml)，打开bsa的二硫键形成巯基(-sh)，混合均匀所得bsa-sh。将核心粒子第一次离心后的沉淀用纯水重悬，并加入650μl bsa-sh溶液，在4℃条件下静置孵育4h。孵育结束后，离心(14000rpm，10min，4℃)，去上清液，再加入1ml pbs缓冲液后冰浴超声处理(150w，超声3s，间歇2s，8min)，得到包载多酶联用的纳米粒。
71.实施例3
72.称取5mg的姜黄素(curcumin，cur)、25mg的酪蛋白酸钠(sodium caseinate，cas)。将cur溶于100μl的二甲基亚砜(dmso)中，配置成50mg/ml的cur母液。将cas溶于1ml纯水，配置成25mg/ml的酪蛋白溶液。将40μl的cur母液加入1ml配置好的cas中，并涡旋30s使cur浓度变成2mg/ml。涡旋后，超声处理(150w，超声3s，间歇2s，5min)，得到姜黄素纳米粒。
73.称量1mg尿酸酶(uri)、1mg过氧化氢酶(cat)溶于1ml ph＝8硼砂-硼酸缓冲液中配置成1mg/ml的混合酶溶液。饱和磷酸钾溶液、混合酶溶液和水以9:5:1的体积比盐析，并涡旋30s确保混合均匀。混合均匀后加入姜黄素纳米粒60μl盐析，涡旋30s。向所得的溶液加入20μl的单宁酸(20mg/ml)，涡旋30s；再加20μl丙烯酰胺溶液(50mg/ml)，涡旋30s后，离心(14000rpm，10min，4℃)，去上清液，再加入1ml pbs缓冲液重悬后离心，去上清液后，冰浴超声处理(150w，超声3s，间歇2s，8min)，得到核心粒子。
74.配制1ml的2.5mg/ml牛血清白蛋白(bsa)溶液，加入15μl 10％tris缓冲液和25μl的tcep溶液(32mg/ml)，打开bsa的二硫键形成巯基(-sh)，混合均匀所得bsa-sh。将核心粒子第一次离心后的沉淀用纯水重悬，并加入650μl bsa-sh溶液，在4℃条件下静置孵育4h。
孵育结束后，离心(14000rpm，10min，4℃)，去上清液，再加入1ml pbs缓冲液后冰浴超声处理(150w，超声3s，间歇2s，8min)，得到包载多酶联用的纳米粒。
75.实验例1：过氧化氢酶的靶向纳米粒的表征。
76.通过马尔文粒径仪和透射电镜对纳米粒进行表征，实施例1制备出的纳米粒的粒径和zeta膜电位如表1所示，纳米粒和聚合物分散性指数(polydispersity index，pdi)＜0.3，表示纳米粒大小分布比较均一。如图1所示，通过生物透射电镜图，可以观察到cas-cur为均匀球体，与酶混合制备成的uc/cur为多蛋白组成的颗粒，而bsa-uc/cur则在此基础上外层包裹了一层bsa，上述结果提示通过mof成功装载酶类药物，并且在表面修饰bsa。
77.表1纳米粒粒径和电位(n＝3)
[0078][0079]
实验例2：不同比例uri/cat与cas-cur对尿酸/lps诱导raw246.7产生no的影响。
[0080]
取对数生长期的raw246.7细胞，调整raw246.7细胞密度为7
×
105cells/ml，按每孔1ml细胞悬液接种于12孔板中。在5％co2、37℃条件下孵育24h，在显微镜观察细胞是否贴壁铺满孔底。用培养基配置lμg/ml的lps、125μg/ml的msu、以及msu和lps的混合溶液。将细胞分为对照组、lps组、msu组、lps+msu组，每组设3个复孔。按照不同分组分别加入有相应药物的培养基处理细胞，置培养箱中孵育24h。收集细胞上清液，离心去除死细胞，用griess法检测no的含量。
[0081]
在光学显微镜下观察raw246.7细胞炎症模型，如图2中a所示，加入lps和尿酸(msu)的raw246.7细胞呈现出不同的状态。正常细胞分布密集且圆润饱满并以叠加的形式生长。加入lps和msu，细胞生长速度明显减慢，且有大量尿酸钠晶体裹住细胞，呈现不规则形态且有伪足延伸。加入cas-cur后，细胞伪足明显减少，但尿酸钠晶体未被分解。当加入混合酶后，尿酸钠晶体被分解，视野未见尿酸钠晶体，且细胞伪足减少明显，细胞状态明显改善。
[0082]
如图2中b所示，纳米粒对于raw246.7细胞毒性较少，可用于后续实验。采用griess法检测不同比例的cur和混合酶对由msu诱导raw246.7细胞no分泌的影响，筛选最优比例。
[0083]
通过spss 25.0进行统计分析，结果如图2中c所示，与模型组相比当uc和cur联用降低no效果比单独使用更显著，在酶和cur的比例在25:10时，no的释放量降低显著(p＜0.05)。
[0084]
实验例3：不同比例uri/cat与cas-cur对炎症培养基处理nrk-52e细胞造成的凋亡保护作用。
[0085]
按实施例2中用lps/msu刺激raw246.7细胞造模，取上清培养基并加入胎牛血清至10％，即为炎症培养基。将生长状态良好的nrk-52e细胞消化后计数调整密度为3
×
105cells/ml的细胞悬液，按每孔2ml细胞悬液接种于6孔板中。在5％co2、37℃条件下孵育24h，在显微镜观察细胞是否贴壁。弃去旧培养基，加入2ml炎症培养基刺激1h。将细胞分为对照组、模型组、不同比例的uri/cat与cas-cur，每组设3个复孔。按照不同分组分别加入不同的药物处理细胞，置培养箱中孵育48h。培养结束后，收集上清液离心收集漂浮细胞，用胰
蛋白酶消化细胞后合并细胞，再用pbs缓冲液润洗3次后备用。配制1
×
binding buffer，并用1
×
binding buffer配制含有annexin v-cy5和pi双染工作液，最后用300μl pbs重悬细胞，于4℃避光孵育30min后流式细胞仪检测细胞凋亡。
[0086]
用流式细胞术分析在不同药物干预下细胞在炎症培养基条件下的凋亡情况，以探讨酶和cas-cur的比例。uc组浓度分别为50μg/ml或25μg/ml和cas-cur10μg/ml或5μg/ml时，不同比例的组合时对nrk-52e的保护作用，如图3所示，当两种药物联用时比单一用药对细胞的保护效果更明显，25:10比例下的细胞存活率显著高于25:5(p＜0.01)，而25:10比50:5比例下的总死亡率也有所降低(p＜0.05)。50μg/ml和25μg/ml酶总凋亡率并没有显著差异(p＞0.05)，25:10和50：10细胞存活率没有明显差异(p＞0.05)，结合不同比例no分泌量，由此可见uc:cas-cur为25:10效果最佳。
[0087]
实验例4：纳米粒对炎症培养基处理nrk-52e细胞造成的凋亡保护作用。
[0088]
将生长状态良好的nrk-52e细胞消化后计数调整密度为3
×
105cells/ml的细胞悬液，按每孔2ml细胞悬液接种于6孔板中。在5％co2、37℃条件下孵育24h，在显微镜观察细胞是否贴壁。弃去旧培养基，加入2ml炎症培养基刺激1h。将细胞分为对照组、模型组、cas-cur、uc、uc+cas-cur、bsa-uc/cur，每组设3个复孔。按照不同分组分别加入不同的药物处理细胞，置培养箱中孵育48h。培养结束后，收集上清液离心收集漂浮细胞，用胰蛋白酶消化细胞后合并细胞，再用pbs缓冲液润洗3次后备用。配制1
×
binding buffer，并用1
×
binding buffer配制含有annexin v-cy5和pi双染工作液，最后用300μl pbs重悬细胞，于4℃避光孵育30min后流式细胞仪检测细胞凋亡。
[0089]
联用时的抗凋亡作用。通过spss 25.0进行统计分析，结果如图4所示，与游离联用组相比，bsa-uc/cur给药组坏死率明显降低(p＜0.01)，可能是由于制作成纳米粒后降低了游离药物对细胞的毒性。与各给药组对比，bsa-uc/cur死亡率降低效果最为显著(p＜0.01)，提示bsa-uc/cur对炎症培养基造成nrk-52e造成的损伤具有显著的保护作用。
[0090]
实验例5：纳米粒对炎症培养基处理nrk-52e的ros水平影响。
[0091]
取生长状态良好nrk-52e细胞，将nrk-52e细胞消化计数后稀释密度为1.5
×
105cells/ml的细胞悬液，按每孔2ml细胞悬液接种于3孔板中。在5％co2、37℃条件下孵育24h，在显微镜观察细胞是否贴壁铺满孔底。弃去旧培养基，加入2ml炎症培养基刺激1h。将细胞分为pbs组、model组、cas-cur、uc、uc+cas-cur、bsa-uc/cur，每组设3个复孔。按照不同分组分别加入不同的药物处理细胞，置培养箱中孵育48h。培养结束后，pbs缓冲液润洗3次后用胰蛋白酶消化细胞后离心，加入ros探针cellrox，37℃避光孵育30min。孵育结束后，用pbs缓冲液洗脱3次，用300μl pbs重悬细胞后流式细胞仪检ros水平。
[0092]
ua一旦转运到细胞中，与细胞外的抗氧化作用相反会成为一种促氧化剂，增加活性氧物种(ros)的产生，细胞内的ua仅通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)氧化酶发挥促氧化作用。通过流式细胞术检测纳米粒对nrk-52e细胞内ros水平的影响，实验所用的氧化应激深红色荧光探针(cellrox)在还原态时无荧光，一旦接触细胞内活性氧等氧化性强的物质，即可产生强烈的红色荧光。通过统计分析，结果图5所示model组的中位荧光强度(median fluorescent intensity，mfi)显著高于pbs组(p《0.01)，这是由于转运到细胞的ua引起线粒体的损伤导致细胞ros水平提高。与其他给药组相比bsa-uc/cur给药组能够显著下调ros水平(p＜0.01)，进而达到保护细胞的效果。
[0093]
实验例6：纳米粒对炎症培养基处理nrk-52e的线粒体的活性影响。
[0094]
按实验例5所述进行炎症造模后，将细胞分为pbs组、model组、cas-cur、uc、uc+cas-cur、bsa-uc/cur，每组设3个复孔。按照不同分组分别加入不同的药物处理细胞，置培养箱中孵育48h。培养结束后，pbs缓冲液润洗3次后用胰蛋白酶消化细胞后离心，加入活细胞线粒体荧光探针mito tracker，37℃避光孵育30min。孵育结束后，用pbs洗3次，用300μl pbs重悬细胞后流式细胞仪检测线粒体活性。
[0095]
当ua被摄入细胞后，线粒体由于受到ua的刺激，可能导致线粒体膜电位的改变，并导致线粒体的活性下降，ros水平的增高。线粒体不仅能提供atp，在ros的产生也扮演着重要的角色，所以线粒体活性的测定至关重要。通过统计分析，结果如图6所示与对照组相比，模型组mfi显著增强，差异有统计学意义(p＜0.01)。uc给药组和uc+cas-cur组对比模型组有所改善，但与bsa-uc/cur对比还是有所欠缺。bsa-uc/cur给药组mfi显著高于其他给药组(p＜0.01)，表明bsa-uc/cur能够明显改善炎症培养基诱导的线粒体损伤。
[0096]
实验例7：纳米粒对炎症培养基处理nrk-52e的分泌的tnf-α、il-6、il-1β水平影响。
[0097]
按实验例5所述进行炎症造模后，将细胞分为pbs组、model组、cas-cur、uc、uc+cas-cur、bsa-uc/cur，每组设3个复孔。按照不同分组分别加入不同的药物处理细胞，置培养箱中孵育48h。培养结束后，收集细胞上清液于-80℃保存用于elisa实验。采将样品稀释10倍后，检测tnf-α、il-6、il-1β水平。
[0098]
检测nrk-52e细胞上清液中tnf-α、il-6、il-β的水平。根据标准曲线计算tnf-α、il-6、il-β含量，并通过统计分析，正态性检验结果tnf-α、il-6、il-β的每组p＞0.05，符合正态分布。方差齐性检验中p＜0.05，不满足方差齐性，并使用dunnett-t3检验做组间两两比较。结果如图7所示，与对照组相比模型组的tnf-α、il-6、il-β明显增加，p＜0.01，差异具有统计学意义。bsa-uc/cur与其余给药组相比，tnf-α、il-6、il-β降低效果显著，p＜0.01均具有统计学意义。
[0099]
实验例8：纳米粒对高尿酸性肾损伤大鼠模型的治疗作用。
[0100]
对spf级sd大鼠(体重为190-200g)进行造模，将大鼠分为7组，除了normal组其余组别给予氧嗪酸钾400mg/kg腹腔注射和次黄嘌呤1g/kg灌胃，将7组大鼠造模4h后，将大鼠随机分成7组每组6只，分别是normal组、model组、cas-cur组、uc组、uc+cas-cur组、uc/cur组和bsa-uc/cur组。根据组别分别尾静脉给与相应药物，并保持cur和uc的给药量分别为0.5mg/kg和1.25mg/kg。从造模前开始计时，取0、4、4.5、5、6、7、8h的血，静置离心后分离上层血清，用生化分析仪测量血清中ua的浓度，并尿酸血清绘制曲线。
[0101]
对spf级sd大鼠(体重为190-200g)进行造模，将大鼠分为7组，除了normal组其余组别给予氧嗪酸钾400mg/kg腹腔注射和次黄嘌呤1g/kg灌胃，经过一周诱导大鼠的高尿酸性肾病模型。将大鼠随机分成7组每组6只，分别是normal组、model组、cas-cur组、uc组、uc+cas-cur组、uc/cur组和bsa-uc/cur组。从第7天除normal组之外，继续造模，根据不同的组别于造模四小时之后分别给于相应药物并保持cur和uc浓度为分别为0.5mg/kg和1.25mg/kg，normal组则给予相同剂量的pbs持续7天。大鼠于14d的实验中，出现器官功能丧失，无法进食或饮水，或体重减轻达动物原体重的25％，二氧化碳安乐死处理并解剖收集大鼠脏器。实验终点对动物进行二氧化碳安乐死处理，收集肾脏保存于4％多聚甲醛备用，对其制备he
切片并进行病理分析。
[0102]
sd大鼠高尿酸血症模型的重要指标是大鼠的血清尿酸浓度(sua)，次黄嘌呤能够增加嘌呤的浓度从而增加大鼠血清的ua，氧嗪酸钾能够抑制大鼠体内的尿酸酶，从而使大鼠血液中的尿酸分解被抑制。结果如图8所示，正常组sua水平均小于100μmol/l，造模后各组血尿酸均显著升高，且模型组在造模后8h sua水平均大于500μmol/l以上，证明造模成功。给药0.5h后，含有uri的给药组sua均下降到正常水平以下(uc、uc+cas-cur、uc/cur和bsa-uc/cur)，当时间到达1h时候，除纳米粒组(uc/cur和bsa-uc/cur)，含有uri的给药组药效开始降低并开始回复到正常sua水平。进行统计分析给药4h后血清ua水平，正态检验结果p＞0.05，服从正态分布，在方差齐性检验中各组p＜0.05，不满足方差齐性，并使用dunnett-t3检验做组间两两比较。结果如图8所示，bsa-uc/cur比cas-cur、uc、uc+cas-cur给药组降低效果sua更显著(p＜0.01)，由于uc/cur组组内差异大，与bsa-uc/cur对比无统计学差异(p＞0.05)，但从图8的趋势可得出bsa-uc/cur降低ua的时间明显比uc/cur更长。
[0103]
通过苏木精-伊红he染色，观察肾脏切片的病理情况。于200
×
和400
×
显微镜下察，结果如图9-图16所示，normal组近曲小管切面多，管壁厚，管腔小而不规则。近端小管的上皮细胞为单层立方或锥形，细胞较大，且胞质强嗜酸性而呈深红色，游离面的刷状缘毛糙不齐。远端小管的切面较少，管腔较大而规则，也由单层立方上皮围成，细胞较小，排列整光胞质嗜酸性较弱，而呈浅红色，游离面无刷状缘。将一个肾单位视为一个观察对象，与normal组相比，model组的肾小囊有许多蛋白积累造成肾小囊的堵塞，近曲小管多见空泡状，且线粒体肿胀和蛋白沉积，提示肾脏有损伤，高尿酸性肾病造模成功。经cas-cur组和uc组给药处理后，肾小囊蛋白减少，近端小管的空泡有所改善，但是线粒体的肿胀程度没有明显改善。经cas-cur组和uc/cur组给药组处理后，近端小管的空泡相对较少，且肾小囊和近曲小管的蛋白与uc+cas-cur和uc组相比降低，但线粒体肿胀程度也未见有所改善。bsa-uc/cur组干预后，由于肾小囊和近端小管几乎没有蛋白沉积，未见空泡，线粒体肿胀程度有明显改善。综上所述，与各给药组相比bsa-uc/cur纳米粒干预后，对肾脏的损伤起到明显的保护作用。
[0104]
图10-图16中，小箭头表示空泡；大箭头表示蛋白质；双箭头表示线粒体肿胀。
[0105]
需要说明的是，本发明的实施例和实验例采用的实验数据统计方法：使用ibm spss statistics 25.0统计软件进行实验数据分析计量资料采用shapiro-wilk检验,符合正态分布(p》0.05)的数据用均数标准差(
±
s)来进行统计描述，绘制为柱状图或散点图:非正态分布(p《0.05)的数据则m(p25～p75)百分位数进行统计描述并绘制成箱式图。符合正态分布与方差齐性的两组独立计量资料采用两独立样本t检验:不符合正态分布和方差齐性的两组计量资料采用非参数mann-whitney u检验。符合正态分布的多组计量资料使用单因素方差分析(one-way anova)，先进行方差齐性检验，若方差齐(p》0.05)则用tukey(大于四组)检验做组间两两比较，方差不齐(p《0.05)则用welch检验并使用dunnett-t3检验做组间两两比较；非正态分布的多组计量资料选用非参数秩和kruskalwallis检验。
[0106]
上述统计结果检验水准以p《0.05为显著差异的标准，以p《0.01为非常显著差异的标准，均差异具有统计学意义。
[0107]
综上所述，本发明的包载多酶联用的纳米粒能够改善h2o2的过度积累而导致损害细胞的问题。
[0108]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种包载多酶联用的纳米粒，其特征在于，所述包载多酶联用的纳米粒包括核心粒子和包覆在所述核心粒子外的壳层；其中，所述核心粒子包括小分子药物粒子、尿酸酶和过氧化氢酶，所述壳层为交联层。2.根据权利要求1所述的包载多酶联用的纳米粒，其特征在于，所述小分子药物粒子为姜黄素蛋白粒子；所述交联层为单宁酸/铁聚合物层。3.根据权利要求1所述的包载多酶联用的纳米粒，其特征在于，所述包载多酶联用的纳米粒的粒径为230-250nm；所述酶与所述小分子药物粒子的质量比为50:10-50:20。4.根据权利要求1所述的包载多酶联用的纳米粒，其特征在于，所述交联层上还具有修饰物质。5.如权利要求1-4任一项所述的包载多酶联用的纳米粒的制备方法，其特征在于，包括：将药物纳米粒和混合酶溶液与饱和盐溶液混合，得到亚稳定性颗粒；将所述亚稳定性颗粒用交联剂固化。6.根据权利要求5所述的包载多酶联用的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述药物纳米粒的制备方法包括：将药物溶液与载体混合，超声处理。7.根据权利要求6所述的包载多酶联用的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述载体包括白蛋白、酪蛋白、普朗尼克、pva和pvp中的至少一种。8.根据权利要求5所述的包载多酶联用的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括设定交联物质、多巴胺和丙烯酰胺三者中的至少一者，其中，所述设定交联物质包括单宁酸和氯化铁；和/或，所述饱和盐溶液包括硫酸铵溶液、硫酸钾溶液、磷酸钾溶液和氯化钠溶液中的至少一种。9.根据权利要求5所述的包载多酶联用的纳米粒的制备方法，其特征在于，还包括：将所述亚稳定性颗粒用所述交联剂固化后，还用孵育剂进行孵育；其中，所述孵育剂中的靶头包括多肽、蛋白、抗体、多糖、小分子配体中的一种或多种。10.如权利要求1-4任一项所述的包载多酶联用的纳米粒的应用，其特征在于，包括：所述包载多酶联用的纳米粒在清除活性氧、线粒体保护、抑制炎症反应、降解尿酸、预防或治疗高尿酸症、预防或治疗氧化应激损伤、或炎症性疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及包载多酶联用的纳米粒及其制备方法和应用；包载多酶联用的纳米粒包括核心粒子和包覆在核心粒子外的壳层；其中，核心粒子包括小分子药物粒子、尿酸酶和过氧化氢酶，壳层为交联层以及表面修饰的靶头；其制备方法包括将药物纳米粒和混合酶溶液与饱和盐溶液混合，得到亚稳定性颗粒；将亚稳定性颗粒用交联剂固化。本发明的包载多酶联用的纳米粒能够改善H2O2、致病原的过度积累和炎症反应而导致损害细胞的问题。问题。问题。


技术研发人员：梁剑铭 张洋 李晓波 冯建佳 曾峰
受保护的技术使用者：广州中医药大学(广州中医药研究院)
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15