一种具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备及其应用

1.本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备及其应用。


背景技术：

2.机械创伤及烧伤烫伤后面临的伤口细菌感染严重危害着人们的生活质量及生命健康。然而，目前治疗细菌感染的方法主要依赖于抗生素，导致抗生素滥用现象频发及多种耐药细菌的出现，使治疗效果大大下降。因此，开发一种杀菌见效快、副作用低的抗菌手段是十分必要的。其中光热疗法(photothermal therapy,ptt)、光动力疗法(photodynamic therapy,pdt)等新兴治疗手段因其低毒性、无耐药性等优异表现被广泛报道。
3.在光热疗法中，抗菌剂在近红外光照射下可以提高自身温度。这种温度的升高可以通过各种热效应，包括细胞膜破裂、细胞中空、蛋白质/酶变性和液体蒸发，有效地杀死细菌。然而，高温或长时间暴露于高温下，可能会对微生物周围的健康组织造成热损伤，甚至引发新的炎症。因此，将光热疗法与其他治疗方式相结合，可以有效避免其对正常组织的损害。
4.光动力疗法是通过激光辐照光敏剂所产生的活性氧(ros)来破坏细菌细胞膜、dna、蛋白质等进行杀菌的新兴治疗手段。然后，过量的ros可能会引发不必要的炎症反应从而阻碍伤口愈合。因此，开发一种多重抗菌策略于一身的多功能材料迫在眉睫。幸运的是，同时具有多种抗菌性能的碳点、金属及金属氧化物、有机分子等材料被开发出来并得到了广泛应用，但其分散性差等弱点仍限制了其应用。
5.生物膜的发展使得完全消灭细菌变得困难。细菌生物膜可通过药物外溢、细胞外基质阻塞、休眠效应、群体效应等一系列机制实现对抗生素的耐药性，阻止抗菌药物的释放，降低治疗效果，延长疾病，并且大大降低了常见抗菌纳米材料的效果。更重要的是，细菌死亡后通常会释放内毒素，从而进一步引起炎症甚至休克等不良反应，因此杀死并彻底清除细菌是未来的重要发展方向。传统的光热疗法、光动力疗法等只能通过热疗及氧化应激来杀死细菌，而不能完全清除内壁细菌及死亡细菌，无法彻底避免残余细菌及内毒素引起的炎症反应，延缓伤口的愈合速度。另外，受材料分散性的影响，光热疗法及光动力疗法的作用范围十分有限，因此，有必要开发一种具有细菌靶向能力、强渗透性并能激活内部细菌的抗菌材料。
6.近年来磁性材料因其在外部磁场下的可控运动引起了人们的关注。在外部磁场的干预下，磁性材料可以渗透生物膜深层，破坏其致密结构。更重要的是，对磁性材料进行修饰使其具有正电荷可以利用静电作用与细菌充分结合。这种具有多种性能的靶向磁性复合纳米材料具有巨大的应用前景。


技术实现要素：

7.针对现有抗菌材料表现出的局限性，本发明设计并制备了一种具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料，本发明材料制备方法简便且不需昂贵成本，制得的多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料抗菌性能良好且具有可移除性，生物相容性良好，可用于抗菌及生物成像等多种领域。
8.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.本发明的第一个目的是提供一种具有多重杀菌性能的靶向磁性复合纳米材料制备方法，包括以下步骤：
10.步骤1：将前驱体溶于去离子水中，搅拌使其均匀分散，在加热加压条件下反应；反应结束后冷却过滤，收集滤液，干燥，得到的多功能光敏材料，所述多功能光敏材料真空保存；
11.步骤2：将铁源溶解于乙二醇中，加入无水乙酸和步骤1得到的多功能光敏材料，加热加压条件下反应；反应结束后冷却，用蒸馏水和无水乙醇反复洗涤，将反应体系采用外部磁场收集，获得反应体系中的磁性复合纳米材料，烘干，所述磁性复合纳米材料真空保存；
12.步骤3：将带正电的聚合物溶于乙酸溶液中，搅拌均匀，加入步骤2制备得到的磁性复合纳米材料，搅拌，向混合物中加入氢氧化钠溶液直至ph值达到7，用去离子水洗涤，将反应体系采用外部磁场收集，获得靶向磁性复合纳米材料，所述靶向磁性复合纳米材料真空保存。
13.进一步的，步骤1中所述前驱体为抗生素、易碳化的有机物、季铵盐、多胺类化合物、银离子中的一种或多种。
14.进一步的，步骤1中所述多功能光敏材料为碳点、金属及金属氧化物、有机物中的一种或多种。
15.作为优选，所述将前驱体用去离子水溶解并搅拌使其均匀分散，其是将前驱体加入水中，并通过搅拌、超声、加热等方式使其充分溶解于去离子水中。
16.进一步的，步骤1中，前驱体、去离子水的比例为每5～50mg前驱体用5～20ml去离子水溶解；所述加热加压条件下反应的条件为80～150℃、0.1～8mpa、2～8h，所述过滤为0.22μm滤头过滤。
17.进一步的，步骤1中还包括在干燥前去除未反应的前驱体，优选的，将滤液离心或将滤液在去离子水中透析以去除未反应的前驱体。
18.在某个特定的实施例中，所述干燥选自加热烘干或真空冷冻干燥。
19.作为优选，所述透析是使用mwco＝500～2000da的透析袋实现的。
20.其中，所述冷冻干燥温度为-60～-50℃，真空度为9～10pa，处理时间为20～24h。
21.进一步的，步骤2中，所述铁源为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、铁氰化钾中的一种或几种。
22.进一步的，步骤2中，所述铁源、乙二醇、无水乙酸钠、多功能光敏材料的比例为每0.2～0.6g铁源用5～40ml乙二醇溶解，然后加入1～4g无水乙酸钠和0.01～0.06g多功能光敏材料；所述加热加压条件为160～220℃、0.1～8mpa、4～12h，所述烘干为在40～70℃下干燥1～4h。
23.作为优选，所述将铁源用乙二醇溶解然后加入无水乙酸钠和多功能光敏材料，其
是将铁源加入乙二醇中，通过搅拌、超声、加热等方式使铁源充分分散于乙二醇中，再在搅拌条件下将无水乙酸钠和多功能光敏材料充分分散于上述溶液中。
24.其中，所述外部磁场为永磁体、带电线圈等可以吸附磁性物质的材料。
25.进一步的，步骤3中，所述带正电的聚合物选自能够通过静电作用吸附细菌的材料，优选的，所述带正电的聚合物选自壳聚糖、季铵盐中的一种或多重的组合。
26.进一步的，步骤3中，带正电的聚合物、乙酸、磁性复合纳米材料、氢氧化钠的比例为每0.1～0.5g带正电的聚合物溶于20～60ml体积百分比浓度0.5～2％的乙酸溶液中，加入1.0～4.0g磁性复合纳米材料，将氢氧化钠溶液加入上述混合物中至ph为7，优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为1m，所述搅拌时间为20～40分钟。
27.本发明的第二个目的是提供前所述的制备方法制备得到的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料。
28.作为优选，所述具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料，其平均粒径为300-500nm。
29.所述具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在近红外区域有吸收，可以通过静电作用结合并靶向细菌，同时可以催化过氧化氢产生氧气并在外部磁场作用下进行有序运动。
30.本发明的第三个目的是提供前述的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在制备细菌靶向的细菌荧光标记和/或制备抗菌剂中的应用。
31.进一步的，所述细菌靶向的细菌荧光标记能够在405、488、543nm波长激发下显示绿、蓝、红色荧光；所述抗菌剂能够在808nm激光照射后杀灭细菌；所述细菌革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。其中，所述具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在细菌荧光标记方面的应用，具体过程为：将制备得到的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料加入到生长状态良好的菌液中，在37℃的co2培养箱中培养，使用激光共聚焦荧光显微镜在405、488和543nm激发下观察细菌荧光状态，并拍照记录。
32.其中，所述具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在抗菌方面的应用，具体过程为：采用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(gram-positive staphylococcus aureus,s.aureus)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(gram-negative escherichia coli,e.coli)进行菌落平板实验。如将具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料分别加入到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌液中，向混合物施加1.5w/cm-2
下10分钟的808nm激光照射，取适量菌液涂布到固体培养基表面，在振荡箱中培养12～24h，然后拍照记录；并取适量菌液滴加至多晶硅片表面，通过扫描电子显微镜(sem)观察细菌膜的变化。本发明以多功能光敏材料为原料，通过一锅溶剂热法与磁性物质结合形成磁性复合纳米材料，然后使用带正电的聚合物对其进行包裹，赋予了其多重性能。
33.首先，外部的带正电聚合物可以通过静电作用靶向并结合细菌，通过其长碳链等结构对细菌细胞膜造成物理损坏；其次，具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在外部磁场的作用下表现出有序且可控地移动，可以轻松穿透细菌膜的细胞外基质从而打破其内部的致密结构，比常规的杀菌材料更高的清除细菌负载量的能力，有效减少了来自于死亡细菌的内毒素引起的炎症等不良反应；另外，具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料可以催化过氧化氢产生氧气，缓解细菌生物膜深层的缺氧环境，激活休眠细菌使其对外
界刺激敏感；最后，多功能光敏材料可以广泛吸收近红外光产生局部热疗及活性氧(ros)，对细菌的细胞膜造成损坏，导致其内容物泄漏及dna、蛋白质等的破坏。
34.使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌探索其在生物成像领域的应用，发现具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料可以聚集在细菌定植的部位，在405、488、543nm波长激发下显示绿、蓝、红色荧光，表现出优秀的细菌共定位及生物成像能力。接着用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌探索其在抗菌领域的应用，与其他抗菌材料相比，具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料具有靶向细菌，细菌生物膜清除，产生氧气，特异性光疗杀菌的能力，杀菌性能突出且不会引起细胞毒性问题，在生物医用领域实现多重杀菌并且可用于生物成像。具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料具有良好的生物相容性、优异的杀菌能力且不会产生细菌耐药等问题，因此在未来的生物成像及抗菌领域具有广阔的应用前景。
35.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
36.(1)本发明所制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料，首先通过一锅溶剂热法将多功能光敏材料负载于磁性材料上，实验方案简便便于合成。
37.(2)本发明所制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料，具有良好的生物相容性和低毒性，在生物医用领域具有较大的发展前景。
38.(3)本发明所制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料，具有优越的荧光性能，且具有激发波长依赖性，在生物成像领域可实现多色成像。
39.(4)本发明所制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料，表现出靶向结合细菌、细菌生物膜清除、氧气产生、精准光疗等多重杀菌性能，杀菌效果优异且不会产生耐药性。
40.因此，本发明将具有多种抗菌性能的光敏材料与磁性材料结合并加以修饰从而制备一种具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料。这种材料在生物成像和抗菌领域有巨大的发展前景和研究价值。
附图说明
41.图1是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的扫描电镜图；
42.图2是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的zeta电位图；
43.图3是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的紫外-可见光谱图；
44.图4是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料经808nm激光照射后温度变化图；
45.图5是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料经808nm激光照射后ros检测探针二苯基苯并呋喃(dpbf)的uv-vis图；
46.图6是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料与过氧化氢共培养后的图片；
47.图7是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料经808nm激光照射后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数图；
48.图8是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在不同条件下处理细菌的sem图；
49.图9是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在488nm、543nm下的细菌成像图；
50.图10是具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在有/无近红外光照下对l929细胞的细胞毒性图。
具体实施方式
51.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
52.实施例1
53.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
54.步骤1，称取30mg吲哚菁绿(易碳化的有机物)于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后得到墨绿色混合物，用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的深绿色粉末，即碳点(多功能光敏材料)，于真空罐中保存。
55.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.06g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min，得到均匀的绿色溶液。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥4h于真空罐中保存。
56.步骤3，称取0.2g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
57.实施例2
58.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
59.步骤1，称取前驱体30mg吲哚菁绿于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后得到墨绿色混合物，用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的深绿色粉末，即碳点，于真空罐中保存。
60.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.01g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min，得到均匀的绿色溶液。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥1h于真空罐中保存。
61.步骤3，称取0.2g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
62.实施例3
63.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
64.步骤1，称取30mg吲哚菁绿于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后得到墨绿色混合物，用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的深绿色粉末，即碳点，于真空罐中保存。
65.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.02g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min，得到均匀的绿色溶液。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥2h于真空罐中保存。
66.步骤3，称取0.3g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
67.实施例4
68.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
69.步骤1，称取30mg尿素(多胺类化合物)于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的粉末，即碳点，于真空罐中保存。
70.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.03g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥3h于真空罐中保存。
71.步骤3，称取0.2g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
72.实施例5
73.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
74.步骤1，称取30mg青霉素g钠盐(抗生素)于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的粉末，即碳点，于真空罐中保存。
75.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.04g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3
次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥4h于真空罐中保存。
76.步骤3，称取0.2g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
77.实施例6
78.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
79.步骤1，称取30mg烷基二甲基苄基氯化铵(季铵盐)于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的粉末，即碳点，于真空罐中保存。
80.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.04g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥4h于真空罐中保存。
81.步骤3，称取0.2g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
82.实施例7
83.具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备
84.步骤1，称取30mg二乙基二硫代氨基甲酸银盐(银离子)于洁净干燥的烧杯中，加入10ml去离子水，以400rpm的速度搅拌2小时使其充分溶解，然后将混合物转移至50ml teflon高压反应釜中，置于105℃、2mpa中反应4h。冷却后用0.22μm滤头过滤，将滤液转移至透析袋(mwco＝1000da)中，在去离子水中透析3天，最后将透析袋中的分散液置于-20℃下保存并冷冻干燥，得到的粉末，即碳点，于真空罐中保存。
85.步骤2，称取0.5g氯化铁溶解于30ml乙二醇中，形成均匀透明的溶液。然后加入2g无水乙酸钠和0.04g碳点，将混合液在磁力搅拌下充分混合30min。将混合物转移至teflon高压反应釜中，置于200℃、2mpa中反应8h。冷却后用蒸馏水和无水乙醇在超声下各洗涤3次，通过外部磁场收集产物，50℃下干燥4h于真空罐中保存。
86.步骤3，称取0.2g壳聚糖溶于50ml乙酸溶液中(2％，v/v)，机械搅拌使其混合均匀。接着加入3.0g磁性复合纳米材料，在室温下以800rpm磁力搅拌30min，将50ml 1m的氢氧化钠溶液加入上述混合物中调节其ph＝7并用去离子水洗涤，最后通过外部磁场收集产物，50℃下干燥12h于真空罐中保存。
87.实验例1
88.实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的扫描电镜图如图1所示，图中显示出具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料成功制备，粒径约为350nm。
89.实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的zeta电位图如图2
所示，图中显示出具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的电荷电位为22.77mv，显正电。
90.实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的紫外-可见光谱图如图3所示，图中显示具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在近红外区域有广泛吸收。
91.实施例1所制备的靶向磁性复合纳米材料的光热性能实验：配制不同浓度的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的水溶液，所述浓度分别为0,25,50,100,200,and 400μg/ml，将溶液分别在808nm激光下1.5w/cm2照射10min，通红外热成像仪记录不同时间下的温度。结果显示：实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料经808nm激光照射后的温度变化图如图4所示，图中显示400μg/ml的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在808nm激光照射下10min温度可升至54.1℃，相比对照组有了明显升高，其光热转换效率约35.5％。
92.实施例1所制备的靶向磁性复合纳米材料的光动力性能实验：配制浓度为400μg/ml的靶向磁性复合纳米材料的乙醇溶液，向溶液中加入50μl浓度为1mm的ros检测探针二苯基苯并呋喃(dpbf)，用808nm激光(1.5w/cm2)连续照射后，每2min检测410nm处的吸光度。结果显示：实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料经808nm激光照射后ros检测探针二苯基苯并呋喃(dpbf)的uv-vis图如图5所示，其在410nm处具有特殊吸收，一旦被氧化，吸收强度降低。图中显示经808nm激光照射后，随着照射时间的增加，dpbf的吸收强度逐渐降低，说明具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料具有优异的光动力效果。
93.实施例1所制备的靶向磁性复合纳米材料的产氧性能实验：分别配制浓度为400μg/ml的碳点、实施例1步骤2制备的磁性复合纳米材料、靶向磁性复合纳米材料的溶液并设定每组中过氧化氢浓度为1m，拍照记录不同时间下离心管中气泡的数量。结果显示：实施例1制备的碳点、磁性复合纳米材料、靶向磁性复合纳米材料与过氧化氢共培养后的图片如图6所示，图中显示经过50min的共孵育后碳点、磁性复合纳米材料、靶向磁性复合纳米材料组均有明显的气泡产生，证明碳点、磁性复合纳米材料和靶向磁性复合纳米材料均可催化过氧化氢产生氧气。
94.实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料经808nm激光照射后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数图如图7所示，图中显示具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在808nm激光照射后可有效抑制细菌的生长，表明具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料具有优异的多重杀菌性能。
95.实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的杀菌实验：实验分为7组，其中过氧化氢浓度为4mm，nir指808nm激光照射10min。将浓度为400μg/ml的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料与细菌共孵育2小时，然后用pbs洗涤细菌，用浓度为2.5％的戊二醛水溶液固定细菌12小时，分别用浓度为10％，30％，50％，70％，90％的乙醇水溶液对细菌进行脱水处理，最后用无水乙醇分散细菌，滴于单晶硅片置于扫描电子显微镜下观察。在不同条件下处理细菌的sem图如图8所示，结果显示：单纯的过氧化氢、808nm光照和靶向磁性复合纳米材料对细菌细胞膜没有明显损害，而靶向磁性复合纳米材料+nir组细菌细胞膜表面出现皱缩及破损，这会导致细菌内容物的泄漏从而杀死细菌。而本发明靶向磁性复合纳米材料+过氧化氢+外部磁场+nir处理组同样出现膜表面出现皱缩及破损，显
示本发明靶向磁性复合纳米材料可以与过氧化氢、外部磁场和nir等常规杀菌方法联合使用。
96.实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的细菌靶向实验：分别将浓度为400μg/ml磁性复合纳米材料和具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料与细菌共孵育12小时，然后用pbs洗去材料，置于激光共聚焦显微镜下观察。在488nm、543nm下的细菌成像图如图9所示，结果显示：具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料与细菌共孵育后可以有效聚集在细菌定植的部位并发出蓝色和红色荧光，表明具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料具有优异的生物成像能力。
97.实施例1所制备的靶向磁性复合纳米材料的生物相容性实验：将200μl的l929细胞接种于96孔板，密度为2
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105细胞/ml，在37℃，5％ co2的培养箱中培养24h。然后丢弃培养基，用不同浓度的靶向磁性复合纳米材料孵育24h。共培养后，pbs洗涤2次，每孔中加入200μl含20μl mtt(5mg/ml)的新鲜培养基，孵育4h。最后加入100μl dmso溶解形成的甲酰胺晶体。最后，使用酶标仪测量570nm处的吸光度。结果显示：实施例1制备的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在有/无近红外光照下对l929细胞的细胞毒性图如图10所示，从图中可以看出，同时施加靶向磁性复合纳米材料和近红外光照时细胞活性仍高于80％，这表明靶向磁性复合纳米材料具有良好的生物相容性。
98.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有多重杀菌性能的靶向磁性复合纳米材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将前驱体溶于去离子水中，搅拌使其均匀分散，在加热加压条件下反应；反应结束后冷却过滤，收集滤液，干燥，得到的多功能光敏材料；优选的，步骤1中所述前驱体为抗生素、易碳化的有机物、季铵盐、多胺类化合物、银离子中的一种或多种；步骤2：将铁源溶解于乙二醇中，加入无水乙酸和步骤1得到的多功能光敏材料，加热加压条件下反应；反应结束后冷却，用蒸馏水和无水乙醇洗涤，将反应体系采用外部磁场收集，获得反应体系中的磁性复合纳米材料，烘干；优选的,所述铁源为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、铁氰化钾中的一种或几种；步骤3：将带正电的聚合物溶于乙酸溶液中，搅拌均匀，加入步骤2制备得到的磁性复合纳米材料，搅拌，向混合物中加入氢氧化钠溶液直至ph值达到7，用去离子水洗涤，将反应体系采用外部磁场收集，获得靶向磁性复合纳米材料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中所述多功能光敏材料为碳点、金属及金属氧化物、有机物中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，前驱体、去离子水的比例为每5～50mg前驱体用5～20ml去离子水溶解；所述加热加压条件下反应的条件为80～150℃、0.1～8mpa、2～8h，所述过滤为0.22μm滤头过滤。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中还包括在干燥前去除未反应的前驱体，优选的，将滤液离心或将滤液在去离子水中透析以去除未反应的前驱体。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述铁源、乙二醇、无水乙酸钠、多功能光敏材料的比例为每0.2～0.6g铁源用5～40ml乙二醇溶解，然后加入1～4g无水乙酸钠和0.01～0.06g多功能光敏材料；所述加热加压条件为160～220℃、0.1～8mpa、4～12h，所述烘干为在40～70℃下干燥1～4h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述带正电的聚合物选自能够通过静电作用吸附细菌的材料，优选的，所述带正电的聚合物选自壳聚糖、季铵盐中的一种或多重的组合。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，带正电的聚合物、乙酸、磁性复合纳米材料、氢氧化钠的比例为每0.1～0.5g带正电的聚合物溶于20～60ml体积百分比浓度0.5～2％的乙酸溶液中，加入1.0～4.0g磁性复合纳米材料，将氢氧化钠溶液加入上述混合物中至ph为7，优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为1m。8.权利要求1至7任一项所述的制备方法制备得到的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料。9.权利要求8所述的具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料在制备细菌靶向的细菌荧光标记和/或制备抗菌剂中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌靶向的细菌荧光标记能够在405、488、543nm波长激发下显示绿、蓝、红色荧光；所述抗菌剂能够在808nm激光照射后杀灭细菌；所述细菌革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

技术总结
本发明公开了一种具有多重杀菌功能的靶向磁性复合纳米材料的制备及其应用，属于生物纳米材料技术领域。将具有光热性能、光动力性能等抗菌性能的多功能光敏材料与磁性材料结合，再以带正电荷的聚合物修饰，得到同时具有光热性能、光动力性能、产氧性能、靶向性能等多重杀菌性能的靶向磁性复合纳米材料。本发明制备方法简便快捷且不需要昂贵耗材，复合材料生物相容性良好、杀菌效果优异，可用于生物成像和多重协同抗菌领域。和多重协同抗菌领域。和多重协同抗菌领域。


技术研发人员：张明 徐艳 李璐 郑凯 王艺霖 于林凤
受保护的技术使用者：南京医科大学附属口腔医院
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/10/15