一株产磷酸三丁酯的凝结芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株产磷酸三丁酯的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)及其应用。


背景技术：

2.磷酸三丁酯简称tbp，可用作优质的阻燃剂，具有无毒、无烟、无卤、与材料相容性好、阻燃效果持久、耐水、耐热、耐迁移性等优点；可用作中性萃取剂，具有使用寿命长、选择性高、易反萃及水溶性小等诸多优点，广泛用于钴、镍、稀土及其他金属的提取分离，酯；可用作硝酸纤维素、醋酸纤维素、氯化橡胶和聚氯乙烯的增塑剂，涂料、黏合剂、油墨的溶剂，气相色谱固定液等。研究中，磷酸三丁酯也可应用于农药中，cn113545357a公开了一种超低温储存高效消毒杀虫剂，将三氯异氰尿酸泡腾片，溶于30％乙醇中，再加入含有磷酸三丁酯的混合物制得，对枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭效果较好。
3.工业上一般采用丁醇与三氯氧磷直接酯化法合成磷酸三丁酯，反应过程中会生成氯化氢，制氯化氢与丁醇和磷酸酯进一步反应生成氯丁烷，为减少副反应需控制很低的反应温度和较高的真空度，导致丁醇消耗高，设备要求高，能耗大。若可进行微生物法制备，则可减少原料消耗高、环境污染问题。
4.华跃飞(华跃飞.盾叶薯蓣内生地衣芽孢杆菌syt1抑菌活性物质的研究[d].西北农林科技大学,2014.)首次在微生物的代谢产物中发现磷酸三丁酯，且含有磷酸三丁酯的萃取浓缩液对多种病原菌有较强的抑制作用。但产生磷酸三丁酯微生物种类不多，产量不高，需要筛选高产磷酸三丁酯的微生物。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了一株产磷酸三丁酯的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，其保藏号为cgmcc no.25151，该菌株筛选自泸州老窖窖泥。
[0006]
因此，本发明提供凝结芽孢杆菌，其已于2022年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号：cgmcc no.cgmcc no.25151，分类名称为凝结芽孢杆菌bacillus coagulans。
[0007]
本发明因此提供所述的凝结芽孢杆菌在产磷酸三丁酯中的应用。
[0008]
进而提供一种利用所述的凝结芽孢杆菌生产磷酸三丁酯的方法，其是将所述凝结芽孢杆菌在发酵培养基中培养，以产生磷酸三丁酯。
[0009]
具体地，培养的条件是35-39℃静置培养24-64h，ph值为6.0-8.0。
[0010]
优选地，培养的条件是37℃静置培养48h，ph值为7.0。
[0011]
一个具体实施方式中，所述发酵培养基的组成为每升培养基中含有16g葡萄糖，10g胰蛋白胨，2.5g酵母粉，5g牛肉膏，3.85g牛脑，4.9g牛心，0.5g吐温80，1g柠檬酸铵，2.5g氯化钠，2.5g无水乙酸钠，0.05g硫酸镁，0.025g硫酸锰，1.25g磷酸氢二钠，1g磷酸氢二钾。
[0012]
本发明也提供所述的凝结芽孢杆菌在制备抗菌产品中的应用。
[0013]
优选地，所述抗菌是指抗白菜黑斑病原菌、马铃薯干腐病原菌、玉米弯孢病原菌。另外优选地，所述产品例如是农药。
[0014]
本发明提供的凝结芽孢杆菌zqw106具有发酵产磷酸三丁酯的能力，且其发酵液中的磷酸三丁酯含量高于现有报道的微生物(在一个实验中该菌株所产磷酸三丁酯含量为3.449mg/l)，可为微生物发酵产磷酸三丁酯的研究提供菌种资源。而且所述菌株有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点等特点。
附图说明
[0015]
图1为菌株产磷酸三丁酯gc-ms图。
[0016]
图2为菌株所产的磷酸三丁酯gc-ms分子碎片质谱图。
[0017]
图3为磷酸三丁酯标准品gc-ms分子碎片质谱图。
[0018]
菌株保藏信息：
[0019]
本发明的凝结芽孢杆菌已于2022年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的保藏编号为cgmcc no.25151，其分类命名为凝结芽孢杆菌bacillus coagulans。
具体实施方式
[0020]
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
[0021]
实施例中涉及的培养基配方：
[0022]
mrs液体培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉4g/l，牛肉浸粉5g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸三铵2g/l，醋酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph6.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0023]
mrs固体培养基：在mrs液体培养基基础上添加15g/l的琼脂，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0024]
发酵培养基：葡萄糖16g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉2.5g/l，牛肉膏5g/l，牛脑3.85g/l，牛心4.9g/l，吐温80 0.5g/l，柠檬酸铵1g/l，氯化钠2.5g/l，无水乙酸钠2.5g/l，硫酸镁0.05g/l，硫酸锰0.025g/l，磷酸氢二钠1.25g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph 6.0,115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0025]
实施例1：菌株的分离纯化
[0026]
1)分离方法：取20g泸州老窖窖泥样品，放入装有180ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，恒温摇床振荡10min将样品充分打散、混匀。取1ml样品悬液，采用倍比稀释法，稀释至10-2
～10-7
，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于mrs固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃厌氧下培养36-48h，并及时观察。
[0027]
2)划线纯化：将长出菌落的平板取出，挑取不同菌落形态的单菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
[0028]
3)菌种保藏：将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mlmrs液体培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20-24h，吸取1ml菌液至保菌管中，加入0.5ml60％的无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
[0029]
实施例2：菌株zqw106的分子鉴定
[0030]
对目标菌株进行扩培后取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组dna。采用芽孢杆菌通用引物27f/1541r扩增其16s rdna全长序列，具体如下：
[0031]
27f(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)
[0032]
1541r(5
′‑
aaggaggtgatccagcc-3
′
)
[0033]
①
反应体系(50μl)
[0034][0035][0036]
②
反应程序
[0037][0038]
pcr产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11v/cm，电泳时间20min。
[0039]
pcr产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收pcr产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海生工生物技术公司完成。
[0040]
测序获得16s rdna片段的基因序列通过ncbi的blast比对，确定菌株种属信息，鉴定其为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，并命名为凝结芽孢杆菌zqw106(bacillus coagulans)。
[0041]
实施例3：菌株zqw106产磷酸三丁酯能力检测
[0042]
(1)准备待测菌液：
[0043]
筛选得到的菌株甘油保存管溶解后，分别将其接种于mrs液体培养基中，并于37℃下静置培养20h，得到待测菌液。
[0044]
(2)gc-ms检测磷酸三丁酯方法：
[0045]
采用顶空固相微萃取法：取上清液，加入顶空瓶中，加入饱和nacl溶液，以0.822mg/ml的2-辛醇为内标物，将制备好的样品于60℃保温平衡5min后，用50/30μmdvb/car/pdms萃取头在60℃萃取50min，萃取结束后在gc进样口250℃解吸5min。化合物检索结果与nist标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。以未添加菌发酵的培养液为空白对照组，计算各挥发性物质的含量。
[0046]
gc-ms检测色谱条件：
[0047]
气相色谱条件：hp-innowax色谱柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；升温程序：起始温度40℃，保持5min，以4℃/min升到100℃，再以6℃/min升至230℃，
[0048]
保持10min，载气为高纯氦气(1.0ml/min)；进样口温度250℃，不分流。
[0049]
质谱条件：电子电离源，电子能量70ev；电子倍增器电压350v；离子源温度230℃；传输线温度250℃；质量范围40～450m/z。
[0050]
以上述方法检测，在分离得到的菌株中有一株即菌株zqw106具有高产磷酸三丁酯能力，gc-ms质谱图如图1所示。选择该菌株做进一步研究。
[0051]
实施例4：菌株zqw106的发酵实验
[0052]
基于优化的发酵条件(接种量、培养温度、培养时间等)，将获得的凝结芽孢杆菌zqw106甘油保存管溶解后，按5％接种量接种于10ml装液量的mrs液体培养基中，37℃静置培养24h后按2％接种量接种到发酵培养基中，连续培养2天，检测方法同实施例3中的测定方法。凝结芽孢杆菌zqw106在持续发酵2天后，所产磷酸三丁酯产量为3.449mg/l。
[0053]
实施例5：凝结芽孢杆菌zqw106形态特征和理化特性
[0054]
1.经实验表明，凝结芽孢杆菌zqw106的培养特性：最适生长温度为37℃，ph值为7，兼性厌氧，有氧、无氧或微氧条件下均可生长。在温度耐受性方面：该菌在37-42℃条件下长势良好，45℃条件下能够生长但长势有所不好，48℃条件下无法生长。
[0055]
2.该菌在37℃厌氧条件下，培养48小时，经api50ch试剂盒鉴定，可分别利用l-阿拉伯糖，d-核糖，d-木糖，d-半乳糖，d-葡萄糖，d-果糖，d-甘露糖，d-纤维二糖，d-麦芽糖，d-乳糖，d-密二糖，d-蔗糖，d-海藻糖，d-松三糖，d-棉子糖，d-土伦糖；甘露醇，山梨醇，n-乙酰葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，d-龙胆二糖；侧金盏花醇/核糖醇，葡萄糖酸钾；甲基-αd-吡喃甘露糖苷，2酮基葡萄糖酸钾等27种单一碳源产酸。其利用能力由强到弱：l-阿拉伯糖，d-核糖，d-木糖，d-半乳糖，d-葡萄糖，d-果糖，d-甘露糖，d-纤维二糖，d-麦芽糖，d-乳糖，d-密二糖，d-蔗糖，d-海藻糖，d-松三糖，d-棉子糖，d-土伦糖；甘露醇，山梨醇，n-乙酰葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，d-龙胆二糖；侧金盏花醇/核糖醇，葡萄糖酸钾；甲基-αd-吡喃甘露糖苷，2酮基葡萄糖酸钾。可利用的单一碳源种类较多，且利用能力整体比较强。
[0056]
3.该菌在37℃微好氧条件下，利用mrs液体培养基，静置培养48小时，通过hplc高效液相色谱检测其非挥发性代谢产物，发现该菌可代谢生产乳酸18.00g/l，乙酸0.17g/l，乙醇0.08g/l；残糖0.50g/l。
[0057]
实施例6：凝结芽孢杆菌zqw106发酵产其他可挥发性代谢产物的实验
[0058]
凝结芽孢杆菌zqw106按实施例4的方法发酵除可产3.449mg/l的磷酸三丁酯，还可以产其他种类繁多的39种挥发性代谢产物，分别为：正十七烷0.317mg/l，异戊醇0.759mg/l，正庚醇1.081mg/l，正辛醇0.168mg/l，1-壬醇0.406mg/l，十二醇0.515mg/l，苯甲醇0.277mg/l，苯乙醇1.233mg/l，香叶醇0.270mg/l，乙酸6.864mg/l，丁酸0.376mg/l，异戊酸0.346mg/l，己酸1.531mg/l，异辛酸0.427mg/l，辛酸2.085mg/l，壬酸1.656mg/l，正癸酸0.518mg/l，月桂酸0.328mg/l，仲辛酮0.033mg/l，苯乙酮0.031mg/l，香叶基丙酮0.476mg/l，2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛1.214mg/l，苯乙醛1.100mg/l，(4e,8e)-5,9,13-三甲基十四碳-4,8,12-三烯醛0.482mg/l，乙酸2-辛酯0.212mg/l，3-羟基-2，2，4-三甲基戊基异丁酸酯0.243mg/l，2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯0.252mg/l，磷酸三异丁酯2.312mg/l，棕榈酸乙酯0.335mg/l，亚油酸乙酯0.036mg/l，十四酸乙酯0.266mg/l，反油酸乙酯
1.426mg/l，苯酚0.023mg/l，2,4-二叔丁基苯酚3.150mg/l，4-氯-3,5-二甲基苯酚0.829mg/l，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.590mg/l，2-甲基-6-乙烯基吡嗪0.034mg/l，2,6-二甲基吡嗪0.369mg/l，苯并噻唑0.034mg/l。

技术特征：
1.一株产磷酸三丁酯的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans），其保藏号为cgmcc no. 25151。2.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌在产磷酸三丁酯中的应用。3.一种利用如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌生产磷酸三丁酯的方法，其特征在于，将所述凝结芽孢杆菌在发酵培养基中培养，以产生磷酸三丁酯。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，培养的条件是35-39
°
c静置培养24-64h，ph值为6.0-8.0。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，培养的条件是37
°
c静置培养48h，ph值为7.0。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为每升培养基中含有16g葡萄糖，10g胰蛋白胨，2.5g酵母粉，5g牛肉膏，3.85g牛脑，4.9g牛心，0.5g吐温80，1g柠檬酸铵，2.5g氯化钠，2.5g无水乙酸钠，0.05g硫酸镁，0.025g硫酸锰，1.25g磷酸氢二钠，1g磷酸氢二钾。7.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌在制备抗菌产品中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌是指抗白菜黑斑病原菌、马铃薯干腐病原菌、玉米弯孢病原菌。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品是农药。

技术总结
本发明属于生物领域，具体涉及一株产磷酸三丁酯的凝结芽孢杆菌及其应用。本发明提供的凝结芽孢杆菌zqw106，其保藏号为CGMCC No.25151，具有发酵产磷酸三丁酯的能力，且其发酵液中的磷酸三丁酯含量高于现有报道的微生物，在一个实验中该菌株所产磷酸三丁酯含量为3.449mg/L。该菌株可为微生物发酵产磷酸三丁酯的研究提供菌种资源。所述菌株具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点等特点。容易培养和保存的特点等特点。


技术研发人员：赵秋伟 李寅 于惠 郑蕾
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/10/15