骨髓细胞培养基及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及骨髓细胞培养基及其制备方法和应用，属于培养基生产加工技术领域。


背景技术：

2.染色体畸变与血液系统疾病具有紧密的相关性。近年来，随着细胞培养和染色体显带等技术的发展，细胞遗传学成为血液系统疾病分析、研究中不可缺少的重要内容。骨髓染色体核型分析用于血液系统疾病的诊断、治疗、预后、发病机制研究具有非常重要的作用，尤其是骨髓染色体核型分析技术逐渐在血液病诊断方面拥有了不可替代的地位。然而，染色体核型分析技术的关键在于能够于体外获得足够数量骨髓中期分裂相细胞进行分析辅助疾病诊断，而且骨髓染色体核型制备过程复杂，影响因素多，成功率低且成本高，获得的分裂相少，染色体粗短，而且分散不好。
3.培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，培养基的配制质量决定了细胞在体外培养过程中是否可以获取足够的可供实验所需的细胞量以及具有典型形态的中期分裂相细胞。目前，国内外大量实验证明，体外培养骨髓细胞涉及的培养基主要包含：rpmi640培养基、imdm培养基、cbf-5(无血清培养基)等。近年公开的骨髓培养基有：1、专利申请cn202010976259.5，公开了一种骨髓培养基及其制备方法和应用，所述骨髓培养基包括基础培养基，以及加入基础培养基中的胎牛血清、l-抗坏血酸、维生素e、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、亚硒酸钠、rhu-epo培养的人类淋巴细胞培养上清、nahco3。该方法采用rhu-epo培养的人类淋巴细胞培养上清提供骨髓生长需要的生长因子，且人类淋巴细胞培养上清使用量低，易获得满足生产所需要的人类淋巴瘤细胞培养上清且成本也低，便于批量生产；并且该方法提供的骨髓培养基培养出的骨髓细胞用于染色体核型分析分裂相多且清晰，形态好而且分散度良好。但是该方法配方成分多，且不具有针对性和限定性，影响特定类型细胞的分化增殖能力，对疾病的准确判断产生影响。2、程建兵、夏成青、陈红梅等文献中采用rpmi1640基础培养基、青霉素/链霉素、胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物配置骨髓培养基。3、谷超的文献中采用基础培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、人类淋巴瘤细胞培养物和化合物cephaloziellinn配置骨髓培养基。
4.但是，目前市售恶性血液肿瘤所使用的骨髓培养基品牌类型繁杂，对于疾病种类没有限定性及针对性。在培养过程中可能会因营养成分、刺激因子、抗菌素等物质缺乏，或比例不恰当，导致对某类细胞的分化增殖产生影响：如分裂指数低、分裂相形态差、分散程度差等从而造成培养失败或难以进行分析诊断。现有的骨髓培养基作用比较广泛，主要的不足之处存在以下几个方面：
5.1、对于不同疾病类型无针对性和限定性，影响特定类型细胞的分化增殖能力，对疾病的准确判断产生影响；
6.2、分裂指数低、分裂相形态差，分散程度差；淋系疾病培养成功率及阳性检出率均低；
7.3、大多数实验室目前所使用的骨髓培养基为成品培养基，较多为进口骨髓培养基，成本过高。


技术实现要素：

8.针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种骨髓细胞培养基及其制备方法和应用，制得的培养基既能用于髓系细胞的培养，也能用于淋系细胞的培养，对淋系和髓系疾病类型具有限定性及针对性，且成分稳定、标本生长良好、分裂指数高、分裂相多且清晰、分裂相形态良好、形态好、分散程度好、提高标本培养成功率及阳性检出率。
9.根据本发明的第一个实施方案，提供一种骨髓细胞培养基，包括基础培养基、胎牛血清、抗生素、营养补充剂，所述基础培养基为rpmi 1640培养基；所述抗生素为青霉素、链霉素；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1；所述营养补充剂为寡脱氧核苷酸刺激剂或重组人粒细胞刺激因子。
10.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，所述rpmi 1640培养基含有18～22％的胎牛血清；所述胎牛血清在骨髓细胞培养基中的终浓度为7wt％～20wt％；所述青霉素在骨髓细胞培养基中的浓度为35～85μg/ml；所述链霉素在骨髓细胞培养基中的浓度为35～85μg/ml；所述寡脱氧核苷酸刺激剂在骨髓细胞培养基中的浓度为8～45μmol/l；所述重组人粒细胞刺激因子在骨髓细胞培养基中的浓度为10～45μmol/l。
11.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，所述基础培养基、胎牛血清、抗生素和营养补充剂按照以下重量份进行配比：基础培养基400～650份、胎牛血清80～200份、抗生素1～20份、营养补充剂0～25份。
12.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，所述重组人粒细胞刺激因子使用前先纯化处理，所述纯化处理的步骤为：选取能稳定地高表达rhg-csfa的种子液，将该种子液接种于lb液态培养基发酵罐中发酵处理后，发酵产物离心后经提抽液、复性液进行复性处理后，再经梯度洗脱、阳离子交换柱纯化、凝胶柱层析纯化以及过滤、除菌后得到纯化处理的重组人粒细胞刺激因子。
13.所述所述重组人粒细胞刺激因子纯化处理的具体步骤为：
14.a)种子液选择：以正常人外周血单个核细胞mrna为模板，采用大肠杆菌bl21做菌株培养能稳定地高表达rhg-csfa的种子液，置于15～25％无菌甘油管中于-70℃冰箱保存，备用；
15.b)发酵：将上述种子液置于37
±
1℃水浴中解冻，然后按1.1％～1.3％的接种量接种到lb液态培养基中，于37
±
1℃温度、45～65％湿度下培养6.5～7.5h，得到一级种子液；然后按0.27％～0.3％接种量将一级种子液接种到新的lb液态培养基中，于37
±
1℃温度、45～65％湿度下培养12～13h，得到二级种子液；按2％～2.5％接种量将二级种子液接种于新的lb液态培养基发酵罐中，于30
±
1℃、ph值6.9～7.1、45～60％湿度、250～280rpm、通气量6.1～6.3m3/h、溶氧65～95％下培养3.5～4h，然后后加入iptg至终浓度为0.7～0.9mm，继续培养3.0～3.5h,得到发酵物；
16.c)离心：将发酵产物置于4～8℃、4700～5000rpm下离心6～8min，收集菌体，用20mmtris-hcl、ph值8.5、1mm mgso4、0.07％溶菌酶、0.011～0.013％核酸酶的裂解缓冲液重悬，菌体和裂解缓冲液的重量比＝1:8.5～9.5，经20m mtris-hcl、ph8.0
±
0.1、3.5～
4.5mm依地酸二钠、0.3～0.5％tritonx-100、1～1.5m尿素的洗涤液洗涤后，于4500r/min下离心22～25min得包涵体；
17.d)复性：按照100ml/10g将上述包涵体溶解于20mm tris-hcl、ph值8.3、6.5～7.5m盐酸胍、10～15mmdtt、2.5～2.8mm依地酸二钠的提抽液中，在6
±
1℃、280～300rpm搅拌150～160min，于6
±
1\8000～8500rpm下离心15～20min，收集上清液，然后将上清液加入20mm tris-hcl、ph值8.3、0.2～0.23mm gssg、0.021～0.023mm gsh、1.5～2m尿素的复性液中，缓慢搅拌混合均匀，在4～6℃下静置12～13h，超滤后加入硫酸铵沉淀，离心取上清液体，得到复性产物；
18.e)纯化：用第一平衡缓冲液对上述复性产物进行梯度洗脱，洗脱结束后用第二平衡缓冲液和cm-sepharose阳离子交换柱纯化，收集液再用1.5l superdex75凝胶柱层析纯化，再经过滤、除菌后得到所述重组人粒细胞刺激因子；第一平衡缓冲液为20mm tris-hcl、ph值8.3、6.8～7mol/l硫酸铵；第二平衡缓冲液为20mmol/l naac-hac、ph值5.3。
19.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，所述胎牛血清是胎牛血清超高速低温离心产物，其制备方法为：在4℃环境温度下，将胎牛血清先置于差速离心机500
×
g、2500
×
g、13000
×
g上离心，去除血清内的残留细胞、死细胞和细胞碎片，然后置于超高速低温离心机内，120000
×
g离心力、4℃离心16h后去上清，用管内余液重悬管底沉淀物，分装于细胞冻存管中，置于-80℃冰箱保存，制得胎牛血清超高速低温离心产物。
20.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，一种如上述所述的骨髓细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
21.s1：在无菌环境下，将无菌的基础培养基、胎牛血清、抗生素和营养补充剂搅拌混合均匀，然后分装到广口培养装置中，得到混合物料；
22.s2：将上述混合物料密封、冰冻，待用，制得所述骨髓细胞培养基。
23.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，所述的骨髓细胞培养基的制备方法，还包括，在搅拌混合之前，将基础培养基、胎牛血清、抗生素搅拌混合均匀，分装到广口培养装置中，密封后冰冻，制得第一培养料；将营养补充剂单独分装于容器中，密封后冰冻，制得第二培养料，将第二培养料加入第一培养料中搅拌混合均匀，制得所述骨髓细胞培养基。
24.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，一种如上述所述制备方法制得的骨髓细胞培养基的使用方法，在使用时，先将疾病标本接种于第一培养料中，然后再将第二培养料加入第一培养料中，搅拌混合均匀后，送入培养箱培养。
25.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，一种如上述所述制备方法制得的骨髓细胞培养基在淋系疾病细胞和/或髓系疾病细胞染色体核型分析中的应用。
26.进一步地，作为本发明一种更为优选的实施方案，所述的应用，包括以下步骤：
27.①
标本抽取：在无菌环境下，使用无菌真空肝素钠抗凝管抽取淋系疾病细胞或髓系疾病细胞样本，并对样本进行细胞有核计数；
28.②
接种：在无菌条件下，根据疾病类型和细胞有核计数结果接种淋系疾病细胞或髓系疾病细胞至骨髓细胞培养基中进行标本接种；
29.③
培养：根据疾病类型，于37℃、co2培养箱中培养48h或72h，髓系疾病细胞培养48h，淋系疾病细胞培养72h；
30.④
收获：于收获前2h，向培养基中加入浓度为0.05ml、20ug/ml的秋水仙素后继续培养，2h后置于离心管内并在1300r/min下离心10min，加kcl低渗液振荡，经37℃恒温水浴箱低渗35min，加入2ml冰醋酸和甲醇质量比＝1:3的固定液轻轻混匀预固定，静置10min后在1300r/min下离心10min，固定两次；
31.第一次固定：离心后弃上清液，加入固定液10ml，固定45～60min，在1300r/min下离心10min；第二次固定：离心后弃上清液，加入固定液10ml，混匀，放置4℃冰箱过夜，次日在1300r/min下离心10min，弃上清液，加适量固定液配成细胞悬液，滴片；
32.⑤
染色体显带：将3个分别标示胰酶、生理盐水、染液的染缸先置于37℃水浴箱中预热20min，根据预实验的显带及染色时间，胰酶消化时间从20s开始，染色时间为1～3min；取一张玻片用上述胰酶消化，然后用生理盐水漂洗，立刻放入吉姆萨染液中染色，用流水冲洗后风干或电吹风吹干，在显微镜油镜下分别观察染色体显带及染色情况；
33.如达到制片标准，分别记录显带和染色的时间；若染色体边缘发毛，为消化时间过长；若染色体未出现带纹，则为消化时间不足；根据具体情况适当增减胰蛋白酶处理的时间，再进行试片；
34.⑥
上机扫片，根据结果分析标本染色体核型。
35.本技术中：重组人粒细胞刺激因子(rhg-csf)系将含人粒细胞集落刺激因子基因的重组质粒转化大肠杆菌，使其高效表达人粒细胞集落刺激因子，经发酵、分离、纯化制成。其具有促进粒细胞生长、增殖和分化的能力，其通过与靶细胞的细胞膜受体相结合而起作用，所有的中性粒细胞系列均存在这种特异的、单一亲和性的受体，单核细胞及其前体也存在这种受体，这些细胞可促进骨髓细胞的生长和成熟以及向中性粒细胞的增殖和分化。可刺激粒细胞系造血，也可使多能造血干细胞进入细胞周期；促进髓系造血祖细胞的增殖、分化和成熟，调节中性粒细胞系细胞的增殖与分化成熟。
36.胎牛血清是一种含有细胞生长和维持所需营养物质的复合物，它对细胞的代谢和发育具有重要的调控作用。外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小囊泡，直径30-150nm，形似杯状，其主要结构是脂质双分子层膜结构；外泌体是细胞间进行信息交流的重要媒介，其内含有大量的蛋白质、脂质、mrna、mirna和dna等。胎牛血清超高速低温离心产物的外泌体含量较高，胎牛血清外泌体对成骨细胞的增殖起促进作用，且胎牛血清超高速低温离心产物所配置的条件培养基对细胞还有一定保护作用。因此，本技术通过添加胎牛血清超高速低温离心产物，有利于骨髓细胞增殖。
37.与现有技术相比，本技术提供的技术方案具有以下优势：
38.(1)本技术骨髓培养基不限制于单一疾病，对淋系和髓系疾病类型具有限定性及针对性，能够用于不同疾病类型，既能用于髓系疾病细胞的培养，也能用于淋系疾病细胞的培养，可提高髓系疾病细胞和淋系疾病细胞的分化增殖能力。
39.(2)本技术骨髓细胞培养基所用原料来源广，从而降低了培养基的生产成本；且采用寡脱氧核苷酸刺激剂(cpg)或重组人粒细胞刺激因子(rhg-csf)作为营养补充剂，不仅有助于提高细胞的分化增殖能力，还有助于提高b细胞慢性淋巴增殖性病等淋系疾病或髓系疾病的阳性检出率。
40.(3)采用本技术骨髓细胞培养基来培养髓系疾病细胞和淋系疾病细胞标本时，标本生长良好、分裂指数高、分裂相多且清晰、分裂相形态良好且分散程度好，有助于提高标
本培养成功率及阳性检出率。
附图说明
41.图1为本技术实施例1骨髓培养基培养多发性骨髓瘤后的电子显微图；
42.图2为本技术实施例2骨髓培养基培养多发性骨髓瘤后的电子显微图；
43.图3为本技术实施例1骨髓培养基培养骨髓增生异常综合征后的电子显微图；
44.图4为本技术实施例2骨髓培养基培养骨髓增生异常综合征后的电子显微图；
45.图5为本技术实施例1骨髓培养基培养慢性粒细胞白血病后的电子显微图；
46.图6为本技术实施例2骨髓培养基培养慢性粒细胞白血病后的电子显微图；
47.图7为本技术实施例1、实施例2、对比例1骨髓细胞培养基培养标本后的的电子显微图；
48.图8为本技术实施例1、实施例2制得的骨髓细胞培养基培养标本后的的电子显微图。
具体实施方式
49.为了使本领域的技术人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合本技术实施例中的附图对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
50.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
51.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
52.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
53.须知，本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本技术所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。
54.根据本发明的第一个实施方案，提供一种骨髓细胞培养基，包括基础培养基、胎牛血清、抗生素、营养补充剂，所述基础培养基为rpmi 1640培养基；所述抗生素为青霉素、链霉素；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1；所述营养补充剂为寡脱氧核苷酸刺激剂或重组人粒细胞刺激因子。
55.需要说明的是，本技术骨髓细胞培养基所用原料来源广，从而降低了培养基的生产成本；且采用寡脱氧核苷酸刺激剂(cpg)或重组人粒细胞刺激因子(rhg-csf)作为营养补充剂，不仅有助于提高细胞的分化增殖能力，还有助于提高b细胞慢性淋巴增殖性病等淋系疾病或髓系疾病的阳性检出率。
56.具体地进行阐述，在本发明实施例中，所述rpmi 1640培养基含有18～22％的胎牛血清；所述胎牛血清在骨髓细胞培养基中的终浓度为7wt％～20wt％；所述青霉素在骨髓细胞培养基中的浓度为35～85μg/ml；所述链霉素在骨髓细胞培养基中的浓度为35～85μg/ml；所述寡脱氧核苷酸刺激剂在骨髓细胞培养基中的浓度为8～45μmol/l；所述重组人粒细胞刺激因子在骨髓细胞培养基中的浓度为10～45μmol/l。
57.具体地进行阐述，在本发明实施例中，所述基础培养基、胎牛血清、抗生素和营养补充剂按照以下重量份进行配比：基础培养基400～650份、胎牛血清80～200份、抗生素1～20份、营养补充剂0～25份。
58.具体地进行阐述，在本发明实施例中，所述重组人粒细胞刺激因子使用前先纯化处理，所述纯化处理的步骤为：选取能稳定地高表达rhg-csfa的种子液，将该种子液接种于lb液态培养基发酵罐中发酵处理后，发酵产物离心后经提抽液、复性液进行复性处理后，再经梯度洗脱、阳离子交换柱纯化、凝胶柱层析纯化以及过滤、除菌后得到纯化处理的重组人粒细胞刺激因子。
59.所述所述重组人粒细胞刺激因子纯化处理的具体步骤为：
60.a)种子液选择：以正常人外周血单个核细胞mrna为模板，采用大肠杆菌bl21做菌株培养能稳定地高表达rhg-csfa的种子液，置于15～25％无菌甘油管中于-70℃冰箱保存，备用；
61.b)发酵：将上述种子液置于37
±
1℃水浴中解冻，然后按1.1％～1.3％的接种量接种到lb液态培养基中，于37
±
1℃温度、45～65％湿度下培养6.5～7.5h，得到一级种子液；然后按0.27％～0.3％接种量将一级种子液接种到新的lb液态培养基中，于37
±
1℃温度、45～65％湿度下培养12～13h，得到二级种子液；按2％～2.5％接种量将二级种子液接种于新的lb液态培养基发酵罐中，于30
±
1℃、ph值6.9～7.1、45～60％湿度、250～280rpm、通气量6.1～6.3m3/h、溶氧65～95％下培养3.5～4h，然后后加入iptg至终浓度为0.7～0.9mm，继续培养3.0～3.5h,得到发酵物；
62.c)离心：将发酵产物置于4～8℃、4700～5000rpm下离心6～8min，收集菌体，用20mmtris-hcl、ph值8.5、1mm mgso4、0.07％溶菌酶、0.011～0.013％核酸酶的裂解缓冲液重悬，菌体和裂解缓冲液的重量比＝1:8.5～9.5，经20m mtris-hcl、ph8.0
±
0.1、3.5～4.5mm依地酸二钠、0.3～0.5％tritonx-100、1～1.5m尿素的洗涤液洗涤后，于4500r/min下离心22～25min得包涵体；
63.d)复性：按照100ml/10g将上述包涵体溶解于20mm tris-hcl、ph值8.3、6.5～7.5m盐酸胍、10～15mmdtt、2.5～2.8mm依地酸二钠的提抽液中，在6
±
1℃、280～300rpm搅拌150
～160min，于6
±
1\8000～8500rpm下离心15～20min，收集上清液，然后将上清液加入20mm tris-hcl、ph值8.3、0.2～0.23mm gssg、0.021～0.023mm gsh、1.5～2m尿素的复性液中，缓慢搅拌混合均匀，在4～6℃下静置12～13h，超滤后加入硫酸铵沉淀，离心取上清液体，得到复性产物；
64.e)纯化：用第一平衡缓冲液对上述复性产物进行梯度洗脱，洗脱结束后用第二平衡缓冲液和cm-sepharose阳离子交换柱纯化，收集液再用1.5l superdex75凝胶柱层析纯化，再经过滤、除菌后得到所述重组人粒细胞刺激因子；第一平衡缓冲液为20mm tris-hcl、ph值8.3、6.8～7mol/l硫酸铵；第二平衡缓冲液为20mmol/l naac-hac、ph值5.3。
65.具体地进行阐述，在本发明实施例中，所述胎牛血清是胎牛血清超高速低温离心产物，其制备方法为：在4℃环境温度下，将胎牛血清先置于差速离心机500
×
g、2500
×
g、13000
×
g上离心，去除血清内的残留细胞、死细胞和细胞碎片，然后置于超高速低温离心机内，120000
×
g离心力、4℃离心16h后去上清，用管内余液重悬管底沉淀物，分装于细胞冻存管中，置于-80℃冰箱保存，制得胎牛血清超高速低温离心产物。
66.具体地进行阐述，在本发明实施例中，一种如上述所述的骨髓细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
67.s1：在无菌环境下，将无菌的基础培养基、胎牛血清、抗生素和营养补充剂搅拌混合均匀，然后分装到广口培养装置中，得到混合物料；
68.s2：将上述混合物料密封、冰冻，待用，制得所述骨髓细胞培养基。
69.具体地进行阐述，在本发明实施例中，所述的骨髓细胞培养基的制备方法，还包括，在搅拌混合之前，将基础培养基、胎牛血清、抗生素搅拌混合均匀，分装到广口培养装置中，密封后冰冻，制得第一培养料；将营养补充剂单独分装于容器中，密封后冰冻，制得第二培养料，将第二培养料加入第一培养料中搅拌混合均匀，制得所述骨髓细胞培养基。
70.具体地进行阐述，在本发明实施例中，一种如上述所述制备方法制得的骨髓细胞培养基的使用方法，在使用时，先将疾病标本接种于第一培养料中，然后再将第二培养料加入第一培养料中，搅拌混合均匀后，送入培养箱培养。
71.具体地进行阐述，在本发明实施例中，一种如上述所述制备方法制得的骨髓细胞培养基在淋系疾病细胞和/或髓系疾病细胞染色体核型分析中的应用。
72.具体地进行阐述，在本发明实施例中，所述的应用，包括以下步骤：
73.①
标本抽取：在无菌环境下，使用无菌真空肝素钠抗凝管抽取淋系疾病细胞或髓系疾病细胞样本，并对样本进行细胞有核计数；
74.②
接种：在无菌条件下，根据疾病类型和细胞有核计数结果接种淋系疾病细胞或髓系疾病细胞至骨髓细胞培养基中进行标本接种；
75.③
培养：根据疾病类型，于37℃、co2培养箱中培养48h或72h，髓系疾病细胞培养48h，淋系疾病细胞培养72h；
76.④
收获：于收获前2h，向培养基中加入浓度为0.05ml、20ug/ml的秋水仙素后继续培养，2h后置于离心管内并在1300r/min下离心10min，加kcl低渗液振荡，经37℃恒温水浴箱低渗35min，加入2ml冰醋酸和甲醇质量比＝1:3的固定液轻轻混匀预固定，静置10min后在1300r/min下离心10min，固定两次；
77.第一次固定：离心后弃上清液，加入固定液10ml，固定45～60min，在1300r/min下
离心10min；第二次固定：离心后弃上清液，加入固定液10ml，混匀，放置4℃冰箱过夜，次日在1300r/min下离心10min，弃上清液，加适量固定液配成细胞悬液，滴片；
78.⑤
染色体显带：将3个分别标示胰酶、生理盐水、染液的染缸先置于37℃水浴箱中预热20min，根据预实验的显带及染色时间，胰酶消化时间从20s开始，染色时间为1～3min；取一张玻片用上述胰酶消化，然后用生理盐水漂洗，立刻放入吉姆萨染液中染色，用流水冲洗后风干或电吹风吹干，在显微镜油镜下分别观察染色体显带及染色情况；
79.如达到制片标准，分别记录显带和染色的时间；若染色体边缘发毛，为消化时间过长；若染色体未出现带纹，则为消化时间不足；根据具体情况适当增减胰蛋白酶处理的时间，再进行试片；
80.⑥
上机扫片，根据结果分析标本染色体核型。
81.实施例1
82.一种骨髓细胞培养基，由rpmi 1640培养基500ml、胎牛血清150ml、双抗(青霉素、链霉素)7ml制成；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1。
83.一种骨髓细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
84.s1：在无菌环境下，将无菌的rpmi 1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素混合均匀，得到混合物料；
85.s2：将上述混合物料分装到广口培养装置中，然后密封、冰冻，待用，制得所述骨髓细胞培养基。
86.一种如上述所述骨髓细胞培养基在髓系或淋系疾病细胞染色体核型分析中的应用。
87.实施例2
88.一种骨髓细胞培养基，由rpmi 1640培养基500ml、胎牛血清150ml、双抗(青霉素、链霉素)7ml、重组人粒细胞刺激因子10ug制成；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1。
89.一种骨髓疾病细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
90.(1)在无菌环境下，将无菌的rpmi 1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素混合均匀，分装到广口培养装置中，密封后冰冻待用，得到第一组分；
91.(2)在无菌环境下，将无菌的重组人粒细胞刺激因子分装于容器中，密封后冰冻待用，得到第二组分；
92.(3)使用时，在无菌环境下将第二组分加入到第一组分中，混合均匀，制得所述淋系疾病细胞培养基；在培养基使用时，在将第二组分加入到第一组分之前，先将骨髓疾病细胞标本接种于第一组分中，随即加入第二组分。
93.一种如上述所述骨髓细胞培养基在髓系或淋系疾病细胞染色体核型分析中的应用。
94.实施例3
95.一种骨髓细胞培养基，由rpmi 1640培养基500ml、胎牛血清150ml、双抗(青霉素、链霉素)7ml、寡脱氧核苷酸刺激剂100ul制成；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1。
96.一种髓系疾病细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
97.一种骨髓疾病细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
98.(1)在无菌环境下，将无菌的rpmi 1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素混合均
匀，分装到广口培养装置中，密封后冰冻待用，得到第一组分；
99.(2)在无菌环境下，将无菌的寡脱氧核苷酸刺激剂分装于容器中，密封后冰冻待用，得到第二组分；
100.(3)使用时，在无菌环境下将第二组分加入到第一组分中，混合均匀，制得所述淋系疾病细胞培养基；在培养基使用时，在将第二组分加入到第一组分之前，先将骨髓疾病细胞标本接种于第一组分中，随即加入第二组分。
101.一种如上述所述髓系疾病细胞培养基在髓系或淋系疾病细胞染色体核型分析中的应用。
102.实施例4
103.与实施例2不同之处在于：将骨髓细胞培养基应用在慢性淋巴细胞白血病细胞染色体核型分析中，其他条件不变。
104.实施例5
105.与实施例2不同之处在于：将骨髓细胞培养基应用在b细胞慢性淋巴增殖性疾病细胞染色体核型分析中，其他条件不变。
106.实施例6
107.与实施例2不同之处在于：将骨髓细胞培养基应用在急性淋巴细胞白血病细胞染色体核型分析中，其他条件不变。
108.实施例7
109.与实施例1不同之处在于：胎牛血清的浓度为10％，其他条件不变。
110.实施例8
111.与实施例1不同之处在于：胎牛血清的浓度为15％，其他条件不变。
112.实施例9
113.与实施例1不同之处在于：胎牛血清的浓度为20％，其他条件不变。
114.实施例10
115.与实施例2不同之处在于：胎牛血清的浓度为10％，其他条件不变。
116.实施例11
117.与实施例2不同之处在于：胎牛血清的浓度为15％，其他条件不变。
118.实施例12
119.与实施例2不同之处在于：胎牛血清的浓度为20％，其他条件不变。
120.实施例13
121.与实施例3不同之处在于：胎牛血清的浓度为10％，其他条件不变。
122.实施例14
123.与实施例3不同之处在于：胎牛血清的浓度为15％，其他条件不变。
124.实施例15
125.与实施例3不同之处在于：胎牛血清的浓度为20％，其他条件不变。
126.对比例1
127.市售成品骨髓细胞培养基，市售骨髓细胞培养基生产厂家为marrowmax bone marrow medium公司。
128.1、标本培养成功率及阳性率高
129.选取多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病三种标本用于实验，三种标本具体信息如下：
130.表1
131.标本号临床诊断疾病标本有核细胞标本年龄1多发性骨髓瘤98592骨髓增生异常综合征480153慢性粒细胞白血病＞80072
132.分别采用实施例1、实施例2制得的骨髓细胞培养基培养和对比例1的骨髓细胞培养基分别培养表1中的三种疾病标本，每个标本接种细胞量一致，置于同一温度的培养箱中培养48h。细胞收获后发现三种培养基分裂相消化染色，条带清晰，如图7所示，能满足阅片人员分析出具报告，但是实施例1、实施例2制得的骨髓细胞培养基培养细胞染色体分裂像中均出现几个长度较长，条带较多，分裂像整体较均匀，镜下观察两者细胞细胞大小差异不大，如图8所示。根据实验数据对比，实施例1、实施例2制得的骨髓细胞培养基效果更好。
133.采用实施例1、实施例2的骨髓细胞培养基培养表1中的三种疾病标本，观察各个标本的的细胞分裂指数、分散程度、显带水平，实验结果如下表2所示。
134.表2
[0135][0136]
注：机器设置每张玻片随机筛选细胞分裂相为30个。
[0137]
采用实施例1、实施例3的骨髓细胞培养基培养三个淋系疾病标本——急性淋巴细胞白血病(all)，观察各个标本的的细胞分裂指数、分散程度、显带水平、核型结果(阴性/阳性)如下表3所示，电子显微镜镜检结果如图1-图6所示。
[0138]
表3
[0139][0140]
注：机器设置每张玻片随机筛选细胞分裂相为30个。
[0141]
由以上实验结果可知，本技术制得的培养基疾病标本培养成功率高，核型分析结果准确性高，阳性率高。
[0142]
2、可用于培养髓系和淋系及特殊疾病标本
[0143]
采用实施例1制得的骨髓细胞培养基分别培养急性淋巴细胞白血病(all)的a、b、c三个标本，同时采用实施例2制得的骨髓细胞培养基培养骨髓增生异常肿瘤(mds)、慢性粒细胞白血病(cml)、急性髓系细胞白血病(aml)标本，共六个标本，观察各个标本的分裂指数、分散程度、显带水平如下表4所示。
[0144]
表4
[0145][0146]
注：机器设置每张玻片随机筛选细胞分裂相为30个。
[0147]
由以上实验可知，本技术骨髓细胞培养基对髓系疾病、淋系及特殊病具有针对性，可以用于培养髓系、淋系及特殊疾病标本。
[0148]
3、不同浓度骨髓培养基比对
[0149]
分别采用实施例7、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13、实施例14、实施例15制得的骨髓细胞培养基分别培养表1中的多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征两种疾病标本，同时采用实施例7-实施例12制得的骨髓细胞培养基培养表1中的慢性粒细胞白血病标本，观察各个标本的分裂指数、分散程度、显带水平如下表5所示。
[0150]
表5
[0151]
[0152][0153]
注：机器设置每张玻片随机筛选细胞分裂相为30个。
[0154]
由以上实验结果可知，本技术骨髓细胞培养基培养的标本实验效果良好，分裂相多且清晰，形态好而且分散度良好。
[0155]
4、成本
[0156]
实施例1、实施例2和实施例3骨髓细胞培养基与对比例1的市售骨髓细胞培养基成本对比如表6所示。
[0157]
表6
[0158]
[0159][0160]
由表6实验数据可知，本技术骨髓细胞培养基成本较低。
[0161]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种骨髓细胞培养基，其特征在于：包括基础培养基、胎牛血清、抗生素、营养补充剂，所述基础培养基为rpmi 1640培养基；所述抗生素为青霉素、链霉素；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1；所述营养补充剂为寡脱氧核苷酸刺激剂或重组人粒细胞刺激因子。2.根据权利要求1所述的骨髓细胞培养基，其特征在于：所述rpmi 1640培养基含有18～22％的胎牛血清；所述胎牛血清在骨髓细胞培养基中的终浓度为7wt％～20wt％；所述青霉素在骨髓细胞培养基中的浓度为35～85μg/ml；所述链霉素在骨髓细胞培养基中的浓度为35～85μg/ml；所述寡脱氧核苷酸刺激剂在骨髓细胞培养基中的浓度为8～45μmol/l；所述重组人粒细胞刺激因子在骨髓细胞培养基中的浓度为10～45μmol/l。3.根据权利要求2所述的骨髓细胞培养基，其特征在于：所述基础培养基、胎牛血清、抗生素和营养补充剂按照以下重量份进行配比：基础培养基400～650份、胎牛血清80～200份、抗生素1～20份、营养补充剂0～25份。4.根据权利要求3所述的骨髓细胞培养基，其特征在于：所述重组人粒细胞刺激因子使用前先纯化处理，所述纯化处理的步骤为：选取能稳定地高表达rhg-csfa的种子液，将该种子液接种于lb液态培养基发酵罐中发酵处理后，发酵产物离心后经提抽液、复性液进行复性处理后，再经梯度洗脱、阳离子交换柱纯化、凝胶柱层析纯化以及过滤、除菌后得到纯化处理的重组人粒细胞刺激因子。5.根据权利要求4所述的骨髓细胞培养基，其特征在于：所述发酵处理的条件为30
±
1℃、ph值6.9～7.1、45～60％湿度、250～280rpm、通气量6.1～6.3m3/h、溶氧65～95％，培养时间为3.5～4h；所述提抽液为20mm tris-hcl、ph值8.3、6.5～7.5m盐酸胍、10～15mmdtt、2.5～2.8mm依地酸二钠；所述复性液为20mm tris-hcl、ph值8.3、0.2～0.23mm gssg、0.021～0.023mm gsh、1.5～2m尿素。6.根据权利要求5所述的骨髓细胞培养基，其特征在于：所述胎牛血清是胎牛血清超高速低温离心产物，其制备方法为：在4℃环境温度下，将胎牛血清先置于差速离心机500
×
g、2500
×
g、13000
×
g上离心，去除血清内的残留细胞、死细胞和细胞碎片，然后置于超高速低温离心机内，120000
×
g离心力、4℃离心16h后去上清，用管内余液重悬管底沉淀物，分装于细胞冻存管中，置于-80℃冰箱保存，制得胎牛血清超高速低温离心产物。7.一种如权利要求1～6任一项所述的骨髓细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：在无菌环境下，将无菌的基础培养基、胎牛血清、抗生素和营养补充剂搅拌混合均匀，然后分装到广口培养装置中，得到混合物料；s2：将上述混合物料密封、冰冻，待用，制得所述骨髓细胞培养基。8.根据权利要求7所述的骨髓细胞培养基的制备方法，其特征在于：还包括，在搅拌混合之前，将基础培养基、胎牛血清、抗生素搅拌混合均匀，分装到广口培养装置中，密封后冰冻，制得第一培养料；将营养补充剂单独分装于容器中，密封后冰冻，制得第二培养料，将第二培养料加入第一培养料中搅拌混合均匀，制得所述骨髓细胞培养基。9.一种如权利要求8所述制备方法制得的骨髓细胞培养基的使用方法，其特征在于：在使用时，先将疾病标本接种于第一培养料中，然后再将第二培养料加入第一培养料中，搅拌混合均匀后，送入培养箱培养。
10.一种如权利要求8所述制备方法制得的骨髓细胞培养基在淋系疾病细胞和/或髓系疾病细胞染色体核型分析中的应用，应用方法包括以下步骤：将抽取的标本接种于骨髓细胞培养基中培养，收获前固定两次，经胰酶消化、生理盐水冲洗、染液染色后在显微镜油镜下分别观察染色体显带及染色情况，然后上机扫片，根据结果分析标本染色体核型。

技术总结
一种骨髓细胞培养基，包括基础培养基、胎牛血清、抗生素，所述基础培养基为RPMI 1640培养基；所述抗生素为青霉素、链霉素；所述青霉素、链霉素的质量比＝1:1；所述骨髓细胞培养基还包括营养补充剂，所述营养补充剂为寡脱氧核苷酸刺激剂或重组人粒细胞刺激因子。采用本申请骨髓细胞培养基来培养髓系疾病细胞和淋系疾病细胞标本时，标本生长良好、分裂指数高、分裂相多且清晰、分裂相形态良好且分散程度好，有助于提高标本培养成功率及阳性检出率。有助于提高标本培养成功率及阳性检出率。有助于提高标本培养成功率及阳性检出率。


技术研发人员：马海欢 毛翠 韩刘君 吕非 贾晓冬 李行 汲珊珊
受保护的技术使用者：天津金域医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/10/15