一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组及其应用的制作方法

1.本发明涉及鱼类性别鉴定领域，尤其涉及用于鲟鱼性别鉴定的特异性引物序列及应用，具体是一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组及其应用。


背景技术：

2.鲟鱼是世界上现有鱼类中体形大、寿命长、最古老的一种鱼类，起源于亿万年前的白垩纪时期，素有水中“熊猫”之称。目前，我国已是世界养鲟大国，年产量约为90000吨，占世界鲟鱼养殖产量的89％以上。鲟鱼是我国的淡水名特优珍品，肉味鲜美、骨软、营养价值高，在国内外市场上很受顾客欢迎。其鱼子酱与鹅肝、松露并称为“世界三大美食”，素有“黑色黄金”之称，因此在养殖上雌性个体比雄性个体具有更高的经济价值。然而鲟鱼个体大、亲本性成熟时间较长，且雌雄个体之间不具有副性征，在其发育早期从形态上无法辨别雌雄；
3.目前性别鉴定的方法主要有手术法和pcr检测法两种：
4.手术法：用手术刀在鲟鱼腹部切口后，对性腺组织进行观察。该方法会对鲟鱼会产生不同程度的伤害，存在极高的致死风险，对操作者熟练程度有很大的要求。另外鲟鱼的性腺组织需要成长到一定程度才能鉴定出来，无法在幼鱼时段进行鉴定，一定程度增大了养殖成本；
5.pcr检测法：针对鲟鱼的性别特异性区域进行聚合酶链式反应(pcr)鉴定，此方法的好处是可以在幼鱼时期获得鲟鱼的性别信息，可以大幅减少养殖成本。但目前的pcr方法依赖于pcr仪，需在专业的实验室进行操作，周期也较长，对鲟鱼性别的实时鉴定造成了一定的困难。


技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种操作简单、快速准确的鲟鱼性别鉴定方法，适合养殖场等多种应用场景，扩大了应用范围。
7.本发明解决技术问题采用如下技术方案：一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物序列：
8.lf：rcacagargcacgactrt(seq id no：1)、lb：adgcargtcgtatrtctcrgt(seq id no：2)、f3：bccsagaatttcwrcttga(seq id no：3)、b3：aggwctg tctgtrtcdcabat(seq id no：4)、fip：trataraatcacacatwggggcattactttgt gtcatctacacdwcc(seq id no：5)、bip：ctgcbrggaagcaaadagcacacatrctgtt tatgcgawt(seq id no：6)。
9.一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，包括以下步骤：
10.s1对待测的鲟鱼成鱼组织进行采样；
11.s2将采样的组织进行dna抽取得到dna模板；
12.s3配置反应混合液，将上述s2中的dna模板加入所述反应混合液得到预加热混合液；
13.s4将上述s3中的预加热混合液进行加热处理并恒温孵育，通过荧光采集装置采集荧光信号。
14.可选的，所述反应混合液包括：thermopol buffer、mgso4、dntp mix、sybr green i、fip/bip primers、f3/b3 primers、loopf/loopb primers、bst iipro dna polymerase large fragment、nuclease-free water。
15.可选的，所述的bst iipro dna polymerase large fragment也可为klenow fragment、vent dna聚合酶、bst dna聚合酶大片段、phi29 dna聚合酶、bst2.0 warmstart dna聚合酶、bst 2.0dna聚合酶、bst dna聚合酶、全长、bst dna聚合酶、deep ventr exo
–
dna聚合酶、deep ventr dna聚合酶、ventr exo
–
dna聚合酶、ventr dna聚合酶中的一种或多种的组合。
16.可选的，所述s2中对采样的组织进行dna提取采用dna提取试剂盒进行采样。
17.可选的，所述s4中的将预加热混合液进行加热处理并恒温孵育的具体条件为：加热至60-70℃，恒温孵育30-60min；
18.所述s4的荧光采集装置，可以采用荧光采集装置仪或其他可以检测荧光信号的装置，通过荧光信号的改变判断鲟鱼性别。
19.一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，包括以下步骤：
20.s1对待测的鲟鱼组织进行采样；
21.s2将所述取样的组织置于0.2mlpcr管；
22.s3将所述0.2mlpcr管用无核酸水洗涤，洗涤后弃掉上清；
23.s4在所述s3中弃掉上清后的pcr管内加入无核酸水，得到预加热pcr管；
24.s5将所述s4中的预加热pcr管金属浴加热并孵育；
25.s6将所述s5中加热后的pcr管经过瞬时离心后取上清液作为模板；
26.s7配置反应混合液，将所述s6中的模板加入配置好的反应混合液内，得到预加热混合液；
27.s8将所述s7中的预加热混合液进行加热处理并恒温孵育一段时间；
28.s9通过观察经所述s8加热孵育后的样本颜色变化判断扩增情况，进而判断鲟鱼性别。
29.可选的，所述s3具体为：将所述0.2ml的pcr管用200μl的无核酸水清洗两次，弃掉上清液；
30.所述s4具体为：在所述s3中弃掉上清后的pcr管内加入100μl的无核酸水；
31.所述s5具体为：将所述s4中的预加热pcr管置于金属浴中加热至95℃并孵育5min。
32.可选的，所述s7中的反应混合液包括：2.5
×
ph sensitive reation buffer10μl、bst iipro dna polymerase large fragment 0.5μl、fip/bip primers、f3/b3 primers、loopf/loopb primers、模板1.0-5.0μl、nuclease-free water。
33.可选的，所述s7中的反应混合液中还包括ph敏感指示剂的缓冲液，所述缓冲液包括但不限于甲酚红、苯酚红、钙黄绿素、羟基柰酚蓝。
34.可选的，所述s8中的将所述s7中的预加热混合液进行加热处理并恒温孵育的具体条件为：加热至60-70℃，恒温孵育30-60min。
35.本发明具有如下有益效果：
36.1.本发明通过对鲟鱼性别差异区域设计等温扩增引物组，可摆脱常规pcr方法对pcr仪器的依赖，只需要水浴锅、金属浴等温控装置即可完成对样本特异性区域的扩增，达到鉴别区分的需求；
37.2.本发明使用的方法操作时间较短，结果可通过样本的色差变化判断，无需复杂的操控仪器和软件，简单易操作，可迅速对鱼体性别做出鉴定，方便实时进行筛选；
38.3.本发明使用的方法采用等温扩增法，检测限可达到5拷贝/μl，准确率达到98％以上；
39.4.本发明对仪器要求极低，只需要一个可控温的操作台即可完成。可适应各种场合的检测要求，不局限于实验室操作，大大提高了应用范围；
40.5.本发明无需对鲟鱼鱼体进行解剖或大量组织的采样，只需鱼鳍部分微量组织，即可进行检测，对鱼体基本无伤害，不用担心鱼体受检后健康问题。
附图说明
41.图1为本发明实施例1的qpcr采集曲线图；
42.图2为本发明实施例2的结果图。
具体实施方式
43.下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。
44.一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物序列：
45.lf：rcacagargcacgactrt(seq id no：1)、lb：adgcargtcgtatrtctcrgt(seq id no：2)、f3：bccsagaatttcwrcttga(seq id no：3)、b3：aggwctgtctgtrtcdcabat(seq id no：4)、fip：trataraatcacacatwggggcattactttgtgtcatctacacdwcc(seq id no：5)、bip：ctgcbrggaagcaaadagcacacatrctgtttatgcgawt(seq id no：6)。
46.实施例1鲟鱼dna性别鉴定
47.基于上述引物序列，取四个不同性别的鲟鱼成鱼组织进行采样，所得组织进行dna抽提。抽提方法参考常规dna提取试剂盒。样本的编号按照1-4编号分别为雌、雄、雄、雌。
48.按下表1配制预加热混合液，并最后加入dna模板。
49.表1
50.10
×
thermopol buffer2.5μlmgso4(100mm)1.5μldntp mix(10mm each)3.5μl10
×
sybr green i0.5μlfip/bip primers(10μm)4μlf3/b3 primers(10μm)0.5μlloopf/loopb primers(10μm)2.0μlbst iipro dna polymerase large fragment(8u/μl)1.0μldna template1.0-5.0μlnuclease-free water加至25μl
51.上表中所述反应条件可以根据dna模板不同或检测设备的不同进行成分体积调整，本部分内容属于本专业人士通用知识部分，本专业人士可根据自己的知识进行修改，在此基础上做出的修改也应包含在本专利申请保护范围内。
52.将上述中的预加热混合液进行加热至65℃处理并恒温孵育60min，通过qpcr采集荧光信号。
53.如图1所示，样本1和样本4出现荧光信号，表明有扩增产物，鉴定结果为雌性个体，而样本2和样本3并未出现信号，鉴定结果为雄性个体，和样本的原始信息一致。
54.实施例2鲟鱼组织性别鉴定方法
55.取不同性别的鲟鱼成鱼组织(小米粒大小)，按编号分别置于不同的0.2ml pcr管。
56.分别用200μl无核酸水洗涤两遍后，弃掉上清液，然后在试管内分别加入100μl无核酸水，再用金属浴加热至95℃并恒温孵育5min，然后瞬时离心，离心后采集上清液，将上清液作为模板。
57.按表2配制预加热混合液，并最后加入所取的上清液模板。
58.表2
[0059][0060]
上表中所述反应条件可以根据dna模板不同或检测设备的不同进行成分体积调整，本部分内容属于本专业人士通用知识部分，本专业人士可根据自己的知识进行修改，在此基础上做出的修改也应包含在本专利申请保护范围内。
[0061]
将上述中的预加热混合液进行加热至65℃处理并恒温孵育30min。
[0062]
其结果如图2所示，则鲟鱼样本1-10的性别分别为：雌、雄、雄、雌、雄、雌、雄、雌、雄、雄。
[0063]
以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
[0064]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物序列：lf：rcacagargcacgactrt(seq id no：1)、lb：adgcargtcgtatrtctcrgt(seq id no：2)、f3：bccsagaatttcwrcttga(seq id no：3)、b3：aggwctg tctgtrtcdcabat(seq id no：4)、fip：trataraatcacacatwggggcattactttgt gtcatctacacdwcc(seq id no：5)、bip：ctgcbrggaagcaaadagcacacatrctgtt tatgcgawt(seq id no：6)。2.根据权利要求1所述的一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，包括以下步骤：s1对待测的鲟鱼成鱼组织进行采样；s2将采样的组织进行dna抽取得到dna模板；s3配置反应混合液，将上述s2中的dna模板加入所述反应混合液得到预加热混合液；s4将上述s3中的预加热混合液进行加热处理并恒温孵育，通过荧光采集装置采集荧光信号。3.根据权利要求2所述的等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述反应混合液包括：thermopol buffer、mgso4、dntp mix、sybr green i、fip/bip primers、f3/b3 primers、loopf/loopb primers、bst iipro dna polymerase large fragment、nuclease-free water[a1]。4.根据权利要求3所述的等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述的bst iipro dna polymerase large fragment也可为klenow fragment、vent dna聚合酶、bst dna聚合酶大片段、phi29 dna聚合酶、bst2.0 warmstart dna聚合酶、bst 2.0dna聚合酶、bst dna聚合酶、全长、bst dna聚合酶、deep ventr exo
–
dna聚合酶、deep ventr dna聚合酶、ventr exo
–
dna聚合酶、ventr dna聚合酶中的一种或多种的组合。5.根据权利要求2所述的等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述s2中对采样的组织进行dna提取采用dna提取试剂盒。6.根据权利要求2所述的等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述s4中的将预加热混合液进行加热处理并恒温孵育的具体条件为：加热至60-70℃，恒温孵育30-60min；所述s4的荧光采集装置，可以采用荧光采集装置仪或其他可以检测荧光信号的装置，通过荧光信号的改变判断鲟鱼性别。7.根据权利要求1所述的一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，包括以下步骤：s1对待测的鲟鱼组织进行采样；s2将所述取样的组织置于0.2mlpcr管；s3将所述0.2mlpcr管用无核酸水洗涤，洗涤后弃掉上清；s4在所述s3中弃掉上清后的pcr管内加入无核酸水，得到预加热pcr管；s5将所述s4中的预加热pcr管金属浴加热并孵育；s6将所述s5中加热后的pcr管经过瞬时离心后取上清液作为模板；s7配置反应混合液，将所述s6中的模板加入配置好的反应混合液内，得到预加热混合液；
s8将所述s7中的预加热混合液进行加热处理并恒温孵育一段时间；s9通过观察经所述s8加热孵育后的样本颜色变化判断扩增情况，进而判断鲟鱼性别。8.根据权利要求7所述的一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述s3具体为：将所述0.2ml的pcr管用200μl的无核酸水清洗两次，弃掉上清液；所述s4具体为：在所述s3中弃掉上清后的pcr管内加入100μl的无核酸水；所述s5具体为：将所述s4中的预加热pcr管置于金属浴中加热至95℃并孵育5min。9.根据权利要求7所述的一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述s7中的反应混合液包括：ph sensitive reation buffer、bst iipro dna polymerase large fragment、fip/bip primers、f3/b3 primers、loopf/loopb primers、模板、nuclease-free water。10.根据权利要求9所述的一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述s7中的反应混合液中还包括ph敏感指示剂的缓冲液，所述缓冲液包括但不限于甲酚红、苯酚红、钙黄绿素、羟基柰酚蓝。11.根据权利要求7所述的一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组的应用，其特征在于，所述s8中的将所述s7中的预加热混合液进行加热处理并恒温孵育的具体条件为：加热至60-70℃，恒温孵育30-60min。

技术总结
本发明公开了一种等温介导扩增鉴定鲟鱼性别的引物组及其应用，所述引物组包括以下引物序列：LF：RCACAGARGCACGACTRT(SEQ ID NO：1)、LB：ADG CARGTCGTATRTCTCRGT(SEQ ID NO：2)、F3：BCCSAGAATTTCWRCTTGA(SEQ ID NO：3)、B3：AGGWCTGTCTGTRTCDCABAT(SEQ ID NO：4)、FIP：TRATARAATCACAC ATWGGGGCATTACTTTGTGTCATCTACACDWCC(SEQ ID NO：5)、BIP：CTGCBRGGAAGCA AADAGCACACATRCTGTTTATGCGAWT(SEQ ID NO：6)；本发明通过对鲟鱼性别差异区域设计等温扩增引物组，可摆脱常规PCR方法对PCR仪器的依赖，只需要水浴锅、金属浴等温控装置即可完成对样本特异性区域的扩增，达到鉴别区分的需求。达到鉴别区分的需求。


技术研发人员：李静 朱俊 查洋 陈金萨
受保护的技术使用者：上海宏序生物医疗科技有限公司
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/10/15