一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤PDX肿瘤模型的构建方法与流程

一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型的构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型的构建方法。


背景技术：

2.人源性肿瘤组织异种移植模型(patient-derived xenograft，pdx)逐步发展成为肿瘤研究的重要工具。而原代培养又称为初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。其又细分为肿瘤细胞原代培养与非肿瘤细胞原代培养。原代培养获取的肿瘤细胞仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，适用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。与细胞系移植瘤模型相比，原代细胞构建pdx模型较好地保留了人体肿瘤的异质性及肿瘤的微环境，较好地重现了人体肿瘤发生发展的生物学过程，为肿瘤研究提供了最接近于临床的体内模型。
3.pdx模型的构建在很大程度上帮助保持了与患者相似的遗传特性和肿瘤异质性，为寻找有效的药物抑制肿瘤提供了接近临床级别的准确性，缩短了研究周期，构建pdx模型可以帮助将少量珍贵的临床样本规模快速扩大，为抗肿瘤药物筛选和新药研发提供帮助。pdx模型还可以帮助预测患者对治疗药物可能产生的反应，包括疗效、毒副作用、吸收程度等，所以国外开始尝试使用这种模型，通过药效结果指导临床的用药。但是，考虑到病人肿瘤样本的珍贵性，pdx模型成瘤率60-70％才是比较可以接受的，但是当前部分癌种还是难以做到这一点的，例如肝癌、all、aml等。此外，常规pdx模型构建周期长，对于临床的指导性较差，有必要进一步的去优化pdx动物模型的建立方法，从而有效提高移植的成功率以及缩短建模周期。
4.pdx模型的建立方法是将新鲜外科手术肿瘤组织或活检组织通过皮下或原位种植到免疫缺陷的小鼠身上，也有将肿瘤种植到血供更为丰富的肾包膜下。但pdx的成功率还不高，根据文献报道，目前移植成功率在23-75％之间。
5.pdx的成功率受多种因素的影响：跟肿瘤本身、操作过程、植入的组织的大小和数量等可能是影响成功率的重要因素，植入部位不同，成功率也不同。
6.pdx模型的构建主要有三种方式：皮下移植：直接种植在小鼠的皮下，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝，是最常用也是最简单的构建方式。肾被膜移植：对动物操作要求比较高，但是肾被膜下血运较为丰富，所以其成瘤率较高，比较适合那些对肿瘤营养环境要求苛刻的肿瘤细胞。原位移植：生长环境与原发肿瘤接近，较好的反应肿瘤的生物学特性，但是原位移植的操作难度最高，且小鼠手术后死亡率较高，很少有实验室可以做出原位移植，现阶段比较成熟的原位移植是肠的原位移植。皮下移植因其操作简单、容易观察、方便定期测量和适合传代等优点被广泛使用，但成功率相对较低，约40-60％，而且皮下异种移植瘤模型一般局限于皮下成团生长，很少出现转移扩散和转移瘤。肾包膜下移植因其血供比较丰富，成功率能达到95％以上，但肾包膜移植技术要求较高，受体小鼠的手术损伤较大，小鼠肾脏较小且肾包膜脆弱，操作容易失败，且易导致感染，肾包膜下移植不能直接
观察肿瘤的大小也局限了其应用范围。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型的构建方法，以解决上述现有技术存在的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
9.本发明提供一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型的构建方法，将原代肿瘤组织与脱细胞支架共培养，得到携带肿瘤组织的脱细胞支架。
10.优选的是，包括以下步骤：
11.(1)鱼皮脱细胞支架制作：将清洗后的鱼皮材料进行初次病毒灭活和提高稳定性处理，随后进行脱细胞处理，清洗后进行再次病毒灭活和提高稳定性处理、去金属清洗、保护液处理和冻干处理；
12.(2)制备原代肿瘤细胞悬液；
13.(3)原代肿瘤细胞与脱细胞支架共培养；
14.(4)携带肿瘤组织的脱细胞支架移植。
15.优选的是，所述去金属清洗为：以料液比1:3-1:20的5-50mmol/l的乙二胺四乙酸二钠溶液和0.1-2wt％中性盐溶液组成的第二混合溶液中清洗；所述保护液处理为将脱细胞基质浸泡在以料液比1:3-1:20的保护液中，浸泡0.5-6h后去除废液；所述保护液的成分为氯化钠溶液和2-15wt％甘油溶液中的至少一种；所述甘油溶液为由hank’s液、d-hank’s液或透明质酸溶液和甘油配制得到。
16.优选的是，所述制备原代肿瘤细胞悬包括以下步骤：
17.s1、将新鲜肿瘤组织置于培养皿中，并向其中加入pbs，去除组织上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用含有抗生素(1％的青霉素&1％链霉素)的pbs清洗2次；
18.s2、将癌组织放入新的培养皿中并向其中加入dmem培养基将组织完全浸入，将组织剪成碎块，用pbs冲洗4次，组织块自动下沉后，除去pbs；
19.s3、将组织块转入培养瓶中并向其中加入5ml复合酶(0.1％的胶原酶，0.01％透明质酸酶，融于高糖dmem中)溶液，吹散组织碎块，调节ph至7-8；然后将培养瓶置于恒温摇床上，在温度为37℃的条件下消化处理6min后，向其中加入胎牛血清终止消化，制成组织细胞悬液；
20.s4、每隔25min于显微镜下观察一次，待组织细胞悬液镜下透光性良好且呈絮状时，转入15ml离心管中离心5min，并弃去上清液；
21.s5、pbs洗涤2次，备用。
22.优选的是，所述初次病毒灭活和提高稳定性处理为在料液比1:3-1:20第一混合溶液中，浸泡0.5-1h；所述第一混合溶液由0.05-1wt％的过氧乙酸和0.5-10wt％的盐溶液组成；所述盐溶液包括氯化钠溶液、氯化钾溶液和氯化钙溶液中的至少一种；所述盐溶液的质量浓度为0.5-7％。
23.优选的是，所述脱细胞处理为以料液比1:3-1:20的脱细胞溶液处理，将鱼皮材料在脱细胞溶液中挤压吸涨，先处理8-40h，更换新鲜脱细胞溶液再处理2-8h；所述脱细胞溶
液由洗涤剂和中性盐溶液组成；所述洗涤剂为0.1-3wt％脱氧胆酸钠溶液、0.1-1wt％聚乙二醇对异辛基苯基醚、0.1-5wt％十二烷基硫酸钠溶液和0.1-1wt％的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐中的至少一种；所述中性盐溶液为氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液中的至少一种。
[0024]
优选的是，所述再次病毒灭活和提高稳定性处理为以料液比1:3-1:20的0.05-1wt％的过氧乙酸和0.5-10wt％的盐溶液组成的第一混合溶液处理2-6h。
[0025]
优选的是，制备原代肿瘤细胞悬液的步骤包括：将癌组织进行消化处理后，制成细胞悬液，待组织块镜下透光性良好且呈絮状时，离心，收集癌组织。
[0026]
优选的是，所述原代肿瘤细胞与脱细胞支架共培养中，共培养培养基为：dmem高糖+15％fbs(胎牛血清)；培养时间为8-24h。
[0027]
优选的是，所述携带肿瘤组织的脱细胞支架移植至小鼠侧腹区域。
[0028]
本发明还提供所述构建方法得到的基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型。
[0029]
本发明还提供所述的基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型在筛选药物中的应用。
[0030]
本发明公开了以下技术效果：
[0031]
本发明提供一种基于鱼皮脱细胞支架的pdx肿瘤模型建模方法，采用皮下移植方案，成功率达到100％，且成瘤迅速。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]
图1为鱼皮脱细胞支架的pdx肿瘤模型构建示意图；
[0034]
图2为鱼皮脱细胞支架电镜图(100μm)；
[0035]
图3为鱼皮脱细胞支架电镜图(50μm)；
[0036]
图4为原代肿瘤细胞与鱼皮脱细胞支架共培养图(500μm)；
[0037]
图5为鱼皮脱细胞支架pdx成瘤图；
[0038]
图6为pdx皮下肿瘤生长曲线图(graphpad，mean
±
sem)；
[0039]
图7为pdx组织he染色图，其中，a代表传统pdx肿瘤组织he染色图，b代表脱细胞支架制作的pdx模型he染色图。
具体实施方式
[0040]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0041]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0042]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0043]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0044]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0045]
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开，下面将按照图1的模式进行实施。
[0046]
实施例1鱼皮脱细胞支架制作
[0047]
s1、鱼皮预处理：将新鲜鱼皮清洗，刮去鱼鳞及残肉，去除冗余组织、杂质及表面带色素的皮层组织，用纯化水清洗干净；
[0048]
s2、清洗：以料液比1:3的5wt％的氯化钠溶液浸泡处理鱼皮原料4h后去除废液；
[0049]
s3、初次病毒灭活和提高稳定性处理：将清洗后的鱼皮材料经裁剪成所需尺寸(3*3mm2)后，浸泡在料液比1:3的0.05wt％的过氧乙酸和5wt％的盐溶液组成的第一混合溶液中，浸泡0.5h后去除废液；
[0050]
s4、脱细胞处理：以料液比1:3的脱细胞溶液处理12h，将鱼皮材料在脱细胞溶液中挤压吸涨；第一次脱细胞时间为12h，第二次更换新鲜脱细胞溶液再处理5h，去除废液；
[0051]
s5、清洗：以料液比1:3的中性盐溶液浸泡处理1h后去除废液，浸泡处理为一次或多次；
[0052]
s6、再次病毒灭活和提高稳定性处理：以料液比1:10的0.5wt％的过氧乙酸和5wt％的盐溶液组成的第一混合溶液处理4h后去除废液；
[0053]
s7、去重金属清洗：以料液比1:10的25mmol/l的乙二胺四乙酸二钠(edta)溶液和1wt％中性盐溶液组成的第二混合溶液中清洗，第一次清洗时间为1h，第二次更换新鲜溶液再处理12h，去除废液，即通过螯合作用去除重金属，将组织间切成3mm*3mm的组织块，备用；
[0054]
s8、保护液处理：将脱细胞基质浸泡在以料液比1:10的保护液中，浸泡3h后去除废液；
[0055]
s9、湿态样品无菌包装终端灭菌：将步骤(8)中样品加入少量保护溶液封装、经γ辐射灭菌，即为湿态成品；
[0056]
s10、干态样品无菌包装终端灭菌：将步骤(7)中样品用无菌水以料液比1:3-1:20清洗1-3次，去除废液，封装于透气性tyvek包装袋中，冻干后进行环氧乙烷(eo)灭菌，即为干态成品。图2-3即为制作的鱼皮脱细胞支架的电镜图，其中图2为100μm，图3为50μm，脱细胞支架内部有均匀的孔隙，以供细胞附着生长。
[0057]
实施例2原代肿瘤组织提取与处理
[0058]
s1、将新鲜肿瘤组织置于培养皿中，并向其中加入适量pbs，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用含有抗生素(1％的青霉素&1％链霉素)的pbs清洗2次；
[0059]
s2、将癌组织放入新的培养皿中并向其中加入少量的dmem培养基，使用眼科剪将组织剪成碎块，并转入15ml离心管中，用pbs冲洗4次，组织块自动下沉后，除去pbs；
[0060]
s3、将组织块转入培养瓶中并向其中加入5ml复合酶(0.1％的胶原酶，0.01％透明质酸酶，融于高糖dmem中)溶液，吹散组织碎块，调节ph至7-8；然后将培养瓶置于恒温摇床上，在温度为37℃的条件下消化处理6min后，向其中加入胎牛血清终止消化，制成组织细胞悬液；
[0061]
s4、每隔25min于显微镜下观察一次，待组织细胞悬液镜下透光性良好且呈絮状时，转入15ml离心管中离心5min，并弃去上清液；
[0062]
s5、pbs洗涤2次，备用。
[0063]
实施例3原代肿瘤组织与脱细胞支架培养
[0064]
s1、取1中20块冻干的鱼皮脱细胞支架(3mm*3mm)置于培养皿中，用含有抗生素的pbs清洗2次；
[0065]
s2、将2中处理的1*106个原代肿瘤细胞放入s1培养皿中并向其中加入完全培养基(高糖dmem+15％fbs)，使用眼科镊将脱细胞支架平铺，防止重叠，之后缓慢注入完全培养基；
[0066]
s3、将培养品移至培养箱中培养14h，于显微镜下观察脱细胞支架内细胞情况，如大量细胞爬入支架内，可进行下步操作，如细胞较少，可适当增加培养时间。
[0067]
如图4所示，为镜下细胞与脱细胞支架共培养图，如图所示，肿瘤细胞均匀分布在支架内部。
[0068]
实施例4携带肿瘤组织的脱细胞支架移植
[0069]
s1、将实施例3中爬满细胞的脱细胞支架植入到高压灭菌的12g套管针中，并确保将其完全推入套管针中；
[0070]
s2、在无菌通风橱中，将8只小鼠放入麻醉箱中，该麻醉箱与异氟烷麻醉机(2％异氟醚和3％氧气用于维持麻醉)连接；
[0071]
s3、观察小鼠的疼痛反射，确保鼠标完全麻醉。
[0072]
s4、将麻醉的小鼠放在清洁的区域上，将肿瘤注射到中背颈区域，然后皮下滑动套管针，直到用高压灭菌的12g套管针到达侧腹区域，并荷包及“8”字缝合穿刺点，防止肿瘤脱出。
[0073]
s5、从第六天开始，每隔一天检测小鼠肿瘤瘤径并记录，观察记录30天，并制作表格(表1)。
[0074]
如图5所示，小鼠成瘤稳定，但是脱细胞支架组更为稳定，瘤体生长速度快(如表1及图6)。
[0075]
实施例5pdx模型瘤体he染色
[0076]
s1、取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0.5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
[0077]
s2、脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
[0078]
s3、浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
[0079]
s4、切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
[0080]
s5、脱蜡：常用he染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(hematoxylin，h)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(eosin，e)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
[0081]
s6、染色：he染色过程是：
[0082]
①
将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
[0083]
②
酸水及氨水中分色，各数秒钟。
[0084]
③
流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
[0085]
④
入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
[0086]
⑤
入酒精伊红染色液染色2分钟。
[0087]
s7、脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
[0088]
s8、封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。如图7所示，传统pdx模型与鱼皮脱细胞支架构建的pdx模型，he染色结果显示，两者组织特异性没有明显差异。
[0089]
表1小鼠pdx荷瘤瘤径统计表
[0090][0091]
本发明中使用鱼皮脱细胞支架构建小鼠pdx模型，首先构建成功率更高，在本次实验中，构建成功率高达90％，而传统方式成瘤成功率约为70％；此外采用鱼皮脱细胞支架构建小鼠pdx模型成瘤更快；同时采用鱼皮脱细胞支架构建小鼠pdx模型，可以做到植入前定
量，更易于观察统计，便于验证药物效果。
[0092]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型的构建方法，其特征在于，将原代肿瘤组织与脱细胞支架共培养，得到携带肿瘤组织的脱细胞支架。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)鱼皮脱细胞支架制作：将清洗后的鱼皮材料进行初次病毒灭活和提高稳定性处理，随后进行脱细胞处理，清洗后进行再次病毒灭活和提高稳定性处理、去金属清洗、保护液处理和冻干处理；(2)制备原代肿瘤细胞悬液；(3)原代肿瘤细胞与脱细胞支架共培养；(4)携带肿瘤组织的脱细胞支架移植。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述初次病毒灭活和提高稳定性处理为在料液比1:3-1:20第一混合溶液中，浸泡0.5-1h；所述第一混合溶液由0.05-1wt％的过氧乙酸和0.5-10wt％的盐溶液组成；所述盐溶液包括氯化钠溶液、氯化钾溶液和氯化钙溶液中的至少一种；所述盐溶液的质量浓度为0.5-7％。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述脱细胞处理为以料液比1:3-1:20的脱细胞溶液处理，将鱼皮材料在脱细胞溶液中挤压吸涨，先处理8-40h，更换新鲜脱细胞溶液再处理2-8h；所述脱细胞溶液由洗涤剂和中性盐溶液组成；所述洗涤剂为0.1-3wt％脱氧胆酸钠溶液、0.1-1wt％聚乙二醇对异辛基苯基醚、0.1-5wt％十二烷基硫酸钠溶液和0.1-1wt％的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐中的至少一种；所述中性盐溶液为氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液中的至少一种。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述再次病毒灭活和提高稳定性处理为以料液比1:3-1:20的0.05-1wt％的过氧乙酸和0.5-10wt％的盐溶液组成的第一混合溶液处理2-6h。6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述原代肿瘤细胞与脱细胞支架共培养中，共培养培养基为：dmem高糖+15％fbs(胎牛血清)；培养时间为8-24h。7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述携带肿瘤组织的脱细胞支架移植至小鼠侧腹区域。8.一种权利要求1-7任一项所述构建方法得到的基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型。9.如权利要求8所述的基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤pdx肿瘤模型在筛选药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于鱼皮脱细胞支架的骨肉瘤PDX肿瘤模型的构建方法，属于生物技术领域。将原代肿瘤组织与脱细胞支架共培养，得到携带肿瘤组织的脱细胞支架。本发明提供一种基于鱼皮脱细胞支架的PDX肿瘤模型建模方法，采用皮下移植方案，成功率达到100％，易于定量，且成瘤迅速。且成瘤迅速。且成瘤迅速。


技术研发人员：柴旭鹏 汪方乾 殷王艾洛伊 陈家煜 张家豪 章文侃 周皓 陈世鑫
受保护的技术使用者：杭州贤石生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/15