一种稳定的重组cTnI-C复合物及其应用与制备的制作方法

一种稳定的重组ctni-c复合物及其应用与制备
[0001][0002]
技术领域
[0003][0004]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定的重组ctni-c复合物及其应用与制备。


背景技术：

[0005][0006]
肌钙蛋白复合物是一种参与钙依赖性肌肉收缩调节的肌肉蛋白，在心肌和骨骼肌的收缩过程中起重要作用，其主要由3种亚基组成，分别是肌钙蛋白i（tni），肌钙蛋白t（tnt）和肌钙蛋白c（tnc）。其中，tni主要负责抑制肌球蛋白atp酶的活性，在缺乏ca2+的情况下，tni会抑制肌动蛋白的形成。tnt的n端调节肌钙蛋白复合物和细肌丝的相互作用，c端则在ca2+的存在的条件下与tni和tnc发生相互作用。tnc作为ca2+结合亚基，主要起到调节肌肉收缩和稳定心肌肌钙蛋白i（ctni）的作用（gomesav,potterjd,szczesna-cordaryd.theroleoftroponinsinmusclecontraction[j].iubmblife,2010,54(6):323-333）。
[0007]
在人体中，根据各亚基的不同可以分成骨骼肌型肌钙蛋白（stn）和心肌型肌钙蛋白（ctn），tnc骨骼肌型和心肌型相同，tni和tnt均存在三种亚型，分别为快型骨骼肌肌钙蛋白i和t、慢型骨骼肌肌钙蛋白i和t，以及心肌肌钙蛋白i（ctni）和心肌肌钙蛋白t（ctnt）。ctni只在心肌组织中进行表达，有很高的心脏特异性，和骨骼肌型的序列存在40%的差异（bodorgs,porterfieldd,vossem,etal.cardiactroponin-iisnotexpressedinfetalandhealthyordiseasedadulthumanskeletalmuscletissue.[j].clinicalchemistry,1995,41(12pt1):1710-1715）。ctnt特异性稍低，其除了在心肌组织中表达外还会在某些发生病变的骨骼肌中表达（jaffeas,vasilevc,milonem,etal.diseasedskeletalmuscle:anoncardiacsourceofincreasedcirculatingconcentrationsofcardiactroponint.[j].journaloftheamericancollegeofcardiology,2011,58(17):1819-1824）。
[0008]
急性心肌梗死（ami）的早期诊断和治疗对于降低死亡风险有非常重要的意义，但是ami的诊断非常依赖于心肌组织标志物的检测，在20世纪80年代以前临床使用的心肌组织标志物有肌酸磷激酶（ck）及其同工酶（ck-mb）、肌红蛋白（mb）等，但根据临床数据显示这些标志物的特异性不够高、升高时间晚且持续时间短，严重制约了心脏疾病的早期诊断和治疗工作。在20世纪90年代初期，美国fda批准了ctni用于临床ami诊断，ctni的释放形式和ck-mb相似，在心肌损伤4-6h后血液中的ctni值即可检测到升高，但ctni的升高时间能够持续6-10天，比ck-mb持续时间长很多，这极大的延长了心脏损伤疾病诊断的窗口期；而且ctni只在心肌组织中表达，不会受到骨骼肌损伤的影响，具有独特的心肌特异性。因此，
ctni也被誉为心肌损伤疾病检测的金标准。
[0009]
目前我国临床检测使用的ctni检测试剂盒很大程度上依赖于进口，由于天然和重组来源的ctni单体都极易降解，运输和储存均十分困难，极大的限制了ctni这一高特异性的心肌标志物在临床诊断中的使用。在心肌损伤患者的血液中，ctni绝大部分是以肌钙蛋白i-c复合物（ctni-c）的形式存在，tnc的c端能够和ctni的33-80氨基酸形成α螺旋结构从而起到稳定ctni的作用，但是天然ctni-c的提取也存在着诸多困难，例如实验材料的缺少、成本高、操作繁琐和产量低等。随着基因工程技术的快速发展，已有许多国内外学者尝试体外重组表达ctni-c，但这一研究工作目前大多数还处于实验阶段，只有国外有少数的商品化重组ctni-c复合物问世，但其价格依旧高昂且稳定性较差，临床诊断使用的标准品依旧受到限制。


技术实现要素：

[0010][0011]
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明提供一种稳定性高的重组ctni-c复合物及其纯化方法
[0012]
具体如下：
[0013]
一种稳定的重组ctni-c复合物，所述ctni-c复合物的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0014]
另一方面，本发明提供了编码上述重组ctni-c复合物的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0015]
另一方面，本发明提供了含有上述基因的重组载体。优选的，所述重组载体选自pet28a、pet22b、pet32a、pcold ii或pet21a。
[0016]
另一方面，本发明提供了含有上述基因或上述重组载体的重组菌。优选的，所述重组菌中的菌株选自bl21（de3）、bl21(de3)
‑ꢀ
er2566或bl21(de3)-t7。
[0017]
另一方面，本发明还提供了一种制备所述重组ctni-c复合物的方法，包括如下步骤：
[0018]
(1)构建表达所述基因的重组菌；
[0019]
(2)对所述步骤(1)中的重组菌进行诱导表达，得到所述重组ctni-c复合物。
[0020]
另一方面，本发明还提供了一种校准品，所述校准品含有所述重组ctni-c复合物。
[0021]
另一方面，本发明还提供了一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括上述重组ctni-c复合物或所述校准品。
[0022]
另一方面，本发明还提供了一种所述重组ctni-c复合物的纯化洗脱液，所述纯化为柱纯化，所述洗脱液含有dtt。
[0023]
本发明所述“重组ctni-c复合物的纯化”指的是重组菌经诱导表达后得到的重组ctni-c复合物。
[0024]
所述“诱导表达后得到的重组ctni-c复合物”指的是将诱导表达后的重组菌破碎、离心收集上清并过滤后得到的重组ctni-c复合物。
[0025]
另一方面，本发明还提供了一种所述重组ctni-c复合物的纯化方法，包括如下步骤：
[0026]
（1） 亲和层析；
[0027]
（2）离子交换层析；
[0028]
其中，所述亲和层析所用填料含有硫酸钴。
[0029]
有益效果：
[0030]
（1） 本发明重组ctni-c复合物稳定性高，抗原反应性高，能够被用作校准品；
[0031]
（2） 本发明纯化重组ctni-c复合物的方法，采用钴柱代替传统ni柱，可以使得产物纯度更高；
[0032]
（3） 在洗脱液中添加特定还原剂dtt，可以分离二聚体得到更纯的ctni-c单体蛋白，从而减少生产过程中的批间差，更具有可制造性。
附图说明
[0033][0034]
图1：ctni-c诱导表达的电泳鉴定结果；
[0035]
图2：ctni-c的纯化鉴定结果；
[0036]
图3a：纯化洗脱液中不添加dtt时所得纯化产物的电泳鉴定结果；
[0037]
图3b纯化洗脱液中添加1mm dtt后所得纯化产物的电泳鉴定结果。
具体实施方式
[0038][0039]
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0040]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0041]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
[0042]
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”及其变体旨在是开放式的 不排除附加行为或结构的可能性的过渡性短语、术语或词语。
[0043]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0044]
实施例1 ctni-c复合物表达菌株的构建
[0045]
根据uniprot数据库公布的ctni和ctnc的蛋白序列，将人ctni蛋白序列的第28-110位氨基酸残基用（ggggs）4和全长的ctnc氨基酸序列进行连接，得到拼接氨基酸序列。
[0046]
将所述拼接序列对应的dna序列n端添加bamh i酶切位点，c端添加hind iii酶切位点，根据表达宿主大肠杆菌进行密码子偏好性进行优化，交由上海捷瑞生物工程有限公司进行基因合成并用酶切位点bamh i和hind iii连接到表达载体pet28a中，然后转化到表达菌株bl21（de3）中。
[0047]
在其他的一些实施例中载体还可以选择pet22b、pet32a、pcold ii或pet21a。
[0048]
表达菌株还可以选择bl21(de3)
‑ꢀ
er2566或bl21(de3)-t7。
[0049]
ctni-c的氨基酸序列为如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0050]
实施例2 高表达工程菌株的筛选
[0051]
选10株上述构建好的表达菌株分别接种到lb+kana试管中，37℃，200~250rpm过夜培养，然后按照1%的接种量接种到tb+kan培养基中，37℃，250rpm培养1.8-2.2小时至od600为0.6-0.8时留取1ml诱导前的菌液作为对照，然后加入终浓度0.5mm iptg在25℃，200~250rpm条件下诱导表达6小时。
[0052]
取诱导前后各1ml菌液离心去上清，分别用500μl1
×
pbs进行重悬，然后进行sds-page电泳鉴定，考马斯亮蓝进行染色，经脱色后分析电泳条带。诱导后的条带在预测分子量大小处有一条明显的条带，而诱导前的条带在相同分子量处无明显条带，选取表达量最高的菌株作为表达工程菌株。
[0053]
将诱导后的菌体用1
×
pbs重悬后超声破碎，离心后分别将上清和沉淀用sds-page进行鉴定，结果显示重组蛋白主要存在于上清中，证明重组蛋白时可溶性蛋白。
[0054]
实施例3 工程菌的高密度上罐发酵
[0055]
（1）上罐种子液制备
[0056]
取一支工程菌于生物安全柜中用接种环在含卡那抗性的lb固体培养基平皿上划线，将平皿密封后倒置于37℃的生化培养箱中，培养16-24 h。
[0057]
用无菌的接种环在lb固体培养基平皿上挑取单菌落，接入预先加入25 μl卡那霉素母液（50 mg/ml）的25 ml lb液体培养基中，置于恒温培养振荡器中，37℃，200~250 rpm培养4 ~ 10 h作为初级种子液。
[0058]
分别向2瓶加入500 μl卡那霉素母液（50 mg/ml）的500 ml lb液体培养基中接入25 ~ 100 μl初级种子液。将接种后的lb液体培养基置于恒温培养振荡器中，37 ℃，200 ~250 rpm培养6~ 10 h作为上罐种子液。
[0059]
（2）上罐发酵
[0060]
将上罐种子液倒入发酵罐中。将氨水补料瓶经过酸碱补料泵后通过补料口接入发酵罐中，通过自动反馈流加氨水控制ph为6.8～7.2。当发酵罐溶氧低于30%时，先调节搅拌转速，每次提升200 rpm（最高至750 rpm），搅拌转速达到750 rpm后，再调节通气量，每次提升10 l/min（最高至30 l/min），每次提升通气量的同时，提升压力0.02 mpa（最高至0.08mpa），维持发酵罐溶氧25%~150%。当发酵罐中菌浓od600=15-20时，降低温度至25℃，加入终浓度5 mm iptg进行诱导，诱导6小时后停止发酵，放出发酵液，离心收集菌体。
[0061]
（3）诱导结果
[0062]
诱导结果如图1所示，其中，泳道m为maker，泳道1-4分别为诱导0、2、4、6h的表达菌样品经过sds-page电泳后的染色结果。以诱导0h作为阴性对照，分别在2h、4h和6h取样进行sds-page鉴定，箭头所示为目的蛋白，该图表明ctni-c获得了高表达。
[0063]
实施例4 肌钙蛋白i-c复合物的纯化
[0064]
（1）菌体的重悬和破碎
[0065]
用天平称取50 g菌体于烧杯中，按1:8的料液比加入1
×
pb搅拌至无明显菌体块。然后将菌体重悬液加入高压均质机，循环破碎3次，将破碎后的菌液离心收集上清，并用
0.45 μm的滤膜进行过滤。
[0066]
（2）亲和层析
[0067]
将钴柱连接纯化仪，全程流速15 ml/min。用a液（1
×
pb）平衡层析柱，然后将步骤（1）过滤后的上清全部上样，然后继续用a液进行平衡，待紫外吸收值降低至50 mau以下开始用5%的b液（1
×
pb+0.5 m咪唑）进行洗杂，紫外吸收值出峰后重新降低至50 mau以下停止洗杂，此部分不收集。将比例阀梯度调整到40% b洗脱目的蛋白，收集样品于产品瓶中并在洗脱液中加入1 m dtt母液至终浓度为1 mm。
[0068]
（3）离子交换层析
[0069]
将q柱连接纯化仪，全程流速10 ml/min。先用a液（1
×
pb+1mm dtt）平衡层析柱，待紫外吸收峰平稳后暂停。将步骤（2）中的洗脱液全部上样，然后继续用a液进行平衡，待紫外吸收值降低至20 mau以下开始进行线性洗脱。将比例阀梯度调整为50个cv内0-100%b液（1
×
pb+1 m nacl+1 mm dtt），出峰后紫外吸收值大于50 mau开始收集，此时的b液浓度约为24%左右，电导值约23 ms/cm左右，在峰底停止收集，收集样品于产品瓶。
[0070]
（4）纯化结果
[0071]
ctni-c纯化结果如图2所示，其中泳道m为marker，泳道1为上清，泳道2为流穿，泳道3为洗杂，泳道4为第一步洗脱，泳道5为第二步洗脱还原胶，泳道6为洗脱非还原胶，泳道7为第二步洗杂
[0072]
上清：ctni-c发酵菌破壁上清；
[0073]
流穿：第一步亲和层析上样穿透液；
[0074]
洗杂：亲和层析5%b液洗脱；
[0075]
第一步洗脱：亲和层析40%b液洗脱；
[0076]
第二步洗脱液的还原胶和非还原胶显示纯度均达到了95%以上，表示成功纯化到了单体目的蛋白ctni-c，且纯度达95%以上。
[0077]
实施例5 洗脱液中dtt的影响
[0078]
除洗脱液中添加或不添加dtt的区别，其余纯化步骤同实施例4，结果如图3a（未添加dtt）和图3b（添加终浓度未1 mm 的dtt）所示。
[0079]
其中泳道m为marker，泳道1为还原，泳道2为非还原，可以看出未添加dtt非还原胶鉴定时纯化后有一个明显的二聚体存在（70位置处），而添加了dtt进行非还原胶鉴定时纯化结果为单体ctni-c。
[0080]
实施例6 ctni-c抗原反应性的鉴定
[0081]
测试试剂：ctni成品试剂盒lots210602
[0082]
蛋白浓度：2.2mg/ml（bca法）
[0083]
bca法测蛋白浓度原理：蛋白质中的肽键将cu
2+
还原为cu
1+
，cu
1+
可以和bicinchoninic acid形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。bca蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5 μg/ml），应用更加灵活。
[0084]
s1和s2为试剂盒自带校准品，rlu为光值
[0085]
表1 试剂盒校准
[0086][0087]
表2 线性实验
[0088][0089]
可以看出ctni-c复合物抗原反应性和线性较好，ctni-c复合物可以用作校准质控品。
[0090]
实施例7 ctni-c复合物冻融和37℃加速稳定性鉴定
[0091]
将ctni-c复合物原液置于37℃加速7天和-20℃反复冻融5次后，用稀释液稀释至检测范围内，用成品试剂盒测试结果如下
[0092]
表3 稳定性实验
[0093]
[0094][0095][0096]
可以看出将抗原原液置于37℃加速7天和-20℃反复冻融5次后稳定性均不受影响，ctni-c复合物可以作为校准品或者质控品被应用在诊断试剂中。
[0097]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种稳定的重组ctni-c复合物，其特征在于，所述ctni-c复合物的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码权利要求1所述重组ctni-c复合物的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述的基因。4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体选自pet28a、pet22b、pet32a、pcold ii或pet21a。5.重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的重组载体；优选的，所述重组菌中的菌株选自bl21（de3）、bl21(de3)
‑ꢀ
er2566或bl21(de3)-t7。6.一种制备如权利要求1中所述的重组ctni-c复合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建表达权利要求2中所述基因的重组菌；(2)对所述步骤(1)中的重组菌进行诱导表达，得到所述重组ctni-c复合物。7.一种校准品，其特征在于，所述校准品含有权利要求1中所述重组ctni-c复合物。8.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括权利要求1中所述重组ctni-c复合物或权利要求7中所述的校准品。9.一种纯化权利要求1中所述的重组ctni-c复合物的纯化洗脱液，其特征在于，所述纯化为柱纯化，所述洗脱液含有dtt。10.一种如权利要求1中所述的重组ctni-c复合物的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1） 亲和层析；（2） 离子交换层析；其中，所述亲和层析所用填料含有硫酸钴。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定的重组cTnI-C复合物及其应用与制备。本发明利用截短的cTnI经4段重复linker（GGGGS）偶联全长cTnC，组成cTnI-C复合物，本发明重组cTnI-C复合物稳定性高，抗原反应性高，能够被用作校准品；且纯化采用独特的纯化方法，可以分离二聚体得到更纯的cTnI-C单体蛋白，从而减少生产过程中的批间差，更具有可制造性。更具有可制造性。更具有可制造性。


技术研发人员：刘超 薛军 朱攀 姬成东 赵忠颢 易维京
受保护的技术使用者：重庆艾生斯生物工程有限公司
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/9/23