过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用

过表达转录因子sthb6在改良马铃薯性状中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物技术领域，具体涉及过表达转录因子sthb6在改良马铃薯性状中的应用。


背景技术：

2.马铃薯是继玉米、水稻、小麦之后的第四大粮食作物，对确保国家粮食安全意义重大。然而马铃薯生长容易受到各种病害的影响，抗病育种一直是重要的育种目标。
3.转录因子(transcription factors，tf)是调控基因表达网络中的重要参与者。相关研究表明，tf是基因工程上提高植物抗病性的有希望的生物技术靶点，为了充分利用这些与免疫相关的tf，需要更深入地了解其功能和作用机制。前人在hd-zip i转录因子对植物的生长发育与非生物胁迫方面进行许多研究，但转录因子hd-zip i家族成员在马铃薯生长发育及抗病性调控中的机制尚不完全清楚。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供过表达转录因子sthb6在改良马铃薯性状中的应用。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.1、过表达转录因子sthb6在改良马铃薯性状中的应用。
7.本发明优选的，所述转录因子sthb6的氨基酸序列如seq id no.22所示。
8.本发明优选的，所述转录因子sthb6的核苷酸序列如seq id no.21所示。
9.本发明优选的，过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的单株结薯数中的应用。
10.本发明优选的，过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的结薯率中的应用。
11.本发明优选的，过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的总薯重中的应用。
12.本发明优选的，过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的平均薯重中的应用。
13.本发明优选的，过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的hpv抗性中的应用。
14.本发明优选的，过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的晚疫病抗性中的应用。
15.本发明优选的，所述过表达转录因子sthb6的方法为将权利要求3所述的sthb6的核苷酸序列通过ecor i和spe i酶切位点连接prc26b载体骨架获得重组表达载体，然后在农杆菌介导下转化马铃薯，获得过表达转录因子sthb6的转基因植株。
16.本发明的有益效果在于：
17.本研究构建了sthb6的过表达、干扰和载体，转化马铃薯，获得过表达、干扰转基因植株，通过对sthb6转基因植株的生理指标测定与表型观察，初步鉴定了sthb6在马铃薯生长发育和pvy、晚疫病抗性中的调控机制，初步解析了sthb6的调控网络和调控生长发育及抗病性的分子机制。sthb6可能通过与sttctp的启动子结合抑制sttctp的转录，正向调控植株对pvy和晚疫病的抗性。本研究结果为进一步揭示hd-zip家族在马铃薯生长发育中的功能，解析马铃薯pvy和晚疫病抗性分子机制和调控网络提供重要信息。为进一步提高马铃薯
的产量、品质和抗病性的分子育种提供基因资源和新的思路。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
19.图1为pcr扩增sthb6基因；
20.图2为sthb6基因和编码蛋白序列分析(a.基因结构；b.保守结构域；c.马铃薯sthb6与拟南芥β分支同源蛋白序列比对，红色的横线表示hd结构域，黄色的横线表示的是lz域；d.马铃薯sthb6与拟南芥hd-zip i亚家族同源序列进化树；)；
21.图3为sthb6启动子顺式作用元件分析；
22.图4为sthb6转录活性分析(a.载体转化ah109酵母在sd/-trp培养基上生长情况；b.载体转化ah109酵母在sd/-trp/-his/-ade培养基上生长情况；c.sthb6编码蛋白全长、n端、c端氨基酸结构示意图(sthb6编码区编码325个氨基酸，sthb6-n端编码蛋白149个氨基酸，sthb6-c端编码蛋白176个氨基酸))；
23.图5为sthb6表达模式分析(a.在马铃薯数据库预测的sthb6在各胁迫和激素诱导下的表达水平；b.在接种pvy后24h、48h、72h接种叶中sthb6的表达水平；c.接种pvy后24h、48h、72h上位叶中sthb6的表达水平，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，**p《0.01,****p《0.0001，用one-way anova分析；)；
24.图6为sthb6在马铃薯各组织器官的表达水平(a.sthb6在e3各个组织器官的表达水平，s1、s2、s4、s7代表匍匐茎的各个时期；b.sthb6在ac142各个组织器官的表达水平；)；
25.图7为prc26b-hb6载体图谱；
26.图8为sthb6过表达、干扰载体构建及阳性苗获取(a.过表达载体示意图；b.干扰载体示意图；c.薯块、茎段的抗性芽和阳性苗；)；
27.图9为sthb6过表达、干扰转基因植株鉴定(a.转基因植株的pcr鉴定；b.rt-qpcr检测转基因株系中sthb6的表达量；c.western blot免疫印迹检测；)；
28.图10为sthb6过表达、干扰植株地下部种植80d的农艺性状统计(a.过表达、干扰植株的地下部表型；b.过表达、干扰植株的单株结薯数；c.过表达、干扰植株的单株薯重；d.过表达、干扰植株的平均单个薯重；e.过表达、干扰植株的薯型(长宽比)；数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.0001，用one-way anova分析；)；
29.图11为sthb6过表达、干扰植株地下部室外种植90d的农艺性状(a.过表达、干扰植株的地下部表型；b.过表达、干扰植株的单株结薯数；c.过表达、干扰植株的单株薯重；d.过表达、干扰植株的平均单个薯重；e.过表达、干扰植株的薯长；f.过表达、干扰植株的薯宽；g.过表达、干扰植株薯的薯型(长宽比)，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.0001(用one-way anova分析)；)；
30.图12为sthb6过表达、干扰转基因植株异养结薯60d(a.过表达、干扰转基因植株异养结薯的表型；b.过表达、干扰转基因植株异养结薯的薯长；c.过表达、干扰转基因植株异养结薯的薯宽；d.过表达、干扰转基因植株异养结薯的薯长宽比值，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.001(用one-way anova分析)；)；
31.图13为pvy侵染后sthb6亚细胞定位；
32.图14为sthb6过表达、干扰转基因植株在pvy侵染21d的表型鉴定(a.sthb6过表达、干扰转基因植株在pvy侵染21d接种叶的表型；b.sthb6过表达、干扰转基因植株在pvy侵染21d上位叶的表型；)；
33.图15为pvy侵染3d时野生型和转基因植株叶片的dab染色；
34.图16为pvy侵染4d、11d时sthb6与pvy-cp在过表达、干扰植株与野生型植株的相对表达量(a.pvy侵染4d时sthb6在各转基因植株接种叶中的相对表达量；b.pvy侵染4d时sthb6在各转基因植株上位叶中的相对表达量；c.pvy侵染11d时sthb6在各转基因植株上位叶中的相对表达量；d.pvy侵染4d时pvy-cp在sthb6各转基因植株接种叶中的相对表达量；e.pvy侵染4d时pvy-cp在sthb6各转基因植株上位叶中的相对表达量；f.pvy侵染11d时pvy-cp在sthb6各转基因植株上位叶中的相对表达量，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.0001(用one-way anova分析)；)；
35.图17为pvy侵染21d时sthb6与pvy-cp在过表达、干扰植株与野生型植株的相对表达量(a.pvy侵染21d时sthb6在各转基因植株接种叶中的相对表达量；b.pvy侵染21d时sthb6在各转基因植株上位叶中的相对表达量；c.pvy侵染21d时pvy-cp在sthb6各转基因植株接种叶中的相对表达量；d.pvy侵染21d时pvy-cp在sthb6各转基因植株上位叶中的相对表达量，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.0001(用one-way anova分析))；；
36.图18为sthb6过表达株系、干扰株系的叶片接种晚疫病5d后发病情况(a.sthb6过表达株系、干扰株系的叶片接种晚疫病5d的表型；b.sthb6过表达株系、干扰株系的叶片接种晚疫病5d的病斑直径，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.0001(用one-way anova分析)；)；
37.图19为sthb6过表达株系、干扰株系叶片接种晚疫病5d后台盼染色结果(a.sthb6过表达株系、干扰株系叶片接种晚疫病5d的台盼蓝染色表型；b.sthb6过表达株系、干扰株系叶片接种晚疫病5d后台盼蓝染色的直径大小，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,**p《0.01(用one-way anova分析)；)；
38.图20为sttctp启动子具有athb6的绑定基序；
39.图21为本氏烟草中瞬时表达验证sthb6与sttctp启动子绑定；
40.图22为sthb6、pvy-cp、sttctp在接种pvy后的接种叶、上位叶的相对表达量；
41.a.sthb6在接种pvy 4d后接种叶中的相对表达；b.sthb6在接种pvy 4d后上位叶的相对表达；c.sthb6在接种pvy 11d后上位叶的相对表达；d.sthb6在接种pvy 21d后上位叶的相对表达；e.pcy-cp在接种pvy的4d后接种叶的相对表达；f.pcy-cp在接种pvy的4d后上位叶的相对表达；g.pcy-cp在接种pvy的11d后上位叶的相对表达；h.pcy-cp在接种pvy的21d后上位叶的相对表达；i.sttctp在接种pvy的4d后接种叶的相对表达；j.sttctp在接种pvy的4d后上位叶的相对表达；k.sttctp在接种pvy的11d后上位叶的相对表达；l.sttctp在接种pvy的21d后上位叶的相对表达，数据表示平均值
±
sd，星号表示统计显著性，*p《0.05,****p《0.0001(用one-way anova分析)。
具体实施方式
42.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以
更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
43.本实验研究所用植株材料为野生型脱毒鄂马铃薯3号(e3，四倍体)，二倍体马铃薯ac142，以及本氏烟草(nicotiana benthamiana)。
44.所有的马铃薯材料以及后续得到的马铃薯转基因株系均培养于含有4％蔗糖ms固体培养基中，在光周期16h光照，8h黑暗，温度为23℃的马铃薯组培间培养。试管苗生长2周后，将组培苗中的固体培养基洗去，在同等的培养环境中炼苗3天。
45.本研究所用引物均利用snapgene 3.2.1软件设计，根据所构建载体的酶切位点不同，在所需要的序列前面添加相应的碱基序列。引物序列以及相应的用途如表所示。
46.表1.引物序列
47.[0048][0049]
实施例1、马铃薯sthb6的克隆及生物信息学分析
[0050]
依据马铃薯基因组数据库spud db的马铃薯dm3-1参考基因组(v4.03)中pgsc0003dmg400016790序列上获取sthb6(soltu.dm.05g021250)cds序列，通过snapgene设计扩增引物sthb6-orf-f/r(如1表中seq id no.1～2所示)。以e3的cdna为模板通过pcr克隆了sthb6基因。如图1所示，大约1000bp处获得目的片段，胶回收目的片段后连接t载体，菌检阳性克隆子并送测序，检测扩增序列是否与登录序列一致。测序结果表明扩增获得的sthb6基因cds大小为978bp，编码325个氨基酸。ncbi序列编号：loc102592561，sthb6基因cds序列如se q id no.21所示，sthb6基因编码氨基酸序列如se q id no.22所示。
[0051]
对sthb6基因的染色体分布分析显示，该基因位于马铃薯5号染色体上。利用gsds软件分析其基因结构，结果如图2，a所示，有3个外显子，2内含子。
[0052]
通过对网站expasy预测的结果进行分析，sthb6基因编码的蛋白由5026个原子组成，分子式为c
1575h2449n445o547s10
，等电点pi为4.66，分子质量为36691.02，总亲水平均值(gravy)为-0.846，属于亲水蛋白，不稳定系数为48.07，属于不稳定蛋白。表明该蛋白没有跨膜结构域，在109-117(氨基酸)处，有一个核定位信号(nls)，符合sthb6作为转录因子的基本特征。
[0053]
将sthb6基因的蛋白序列在ncbi数据库和ensembl plants数据库进行比对分析，获取了在拟南芥、马铃薯中同源性最高的基因序列athb6。从马铃薯数据库中获取马铃薯sthb6基因的蛋白序列，通过ncbi和smart预测sthb6编码蛋白的保守结构域(图2，b)。在62-115氨基酸处有参与关键发育过程转录调控的dna结合域homeodomain(hox)，在117-149氨基酸处有halz(lz)，表明sthb6属于hd-zip家族(图2，c)。利用mega对在拟南芥中已经报道的hd-zip i型家族分类蛋白进行多序列比对，hb6与拟南芥具有保守同源盒结构域和lz结构的β亚类成员表现出高度相似性因此推测sthb6在马铃薯中属于hd-zip i型家族的β分支(图2，d)。
[0054]
实施例2、马铃薯sthb6基因启动子序列分析
[0055]
马铃薯数据库spud db中获取马铃薯sthb6基因上游2000bp的启动子序列(ncbi序列编号：cp055238，seq id no.23)，在马铃薯品种e3中扩增sthb6的启动子，将其构建到pbi121-gus载体上，经测序比对后，利用在线分析网站plantcare对所扩增的启动子序列进行顺式作用元件分析，结果如图3，表2所示，该序列中含有低温、干旱、生物胁迫等响应元件以及水杨酸(sa)、脱落酸(aba)、茉莉酸甲酯(meja)等激素响应顺式作用元件，推测sthb6可能参与了生物胁迫、干旱等生物学过程。
[0056]
表2.sthb6启动子顺式作用元件及相关功能分析
[0057][0058][0059]
实施例3、sthb6转录激活活性分析
[0060]
为了验证sthb6是否具有转录活性，我们克隆了该基因的cds全长序列，重组到pgbkt-7载体上，并按照酵母转化方法与空载pgbkt-7分别转至酵母菌株ah109，涂布于sd/-trp培养基培养3天结果，如图4，a所示，并挑取阳性克隆在sd/-trp/-his/-ade培养基上培养，结果如图4，b所示，该基因的蛋白全长具有转录活性。为了进一步确认是蛋白发挥功能
的区域，我们将该编码蛋白从hd-zip结构域(62-149氨基酸)处截断成两段，分别为hb6-n(含有hd-zip结构域)、hb6-c(不含hd-zip结构域)的基因编码序列然后分别构建到pgbkt-7载体上，转化至酵母菌株ah109中。结果如图4，c所示，sthb6的hb6-c区段具有转录活性，含有hd-zip结构域的hb6-n区段没有转录活性。说明sthb6基因编码一个具有转录活性的转录因子，其c端具有转录激活活性。
[0061]
实施例4、sthb6基因表达模式分析
[0062]
通过对马铃薯数据库spud db中转录组数据分析发现该基因受到苯并噻二唑(bth)、β-氨基丁酸(baba)处理诱导表达，且响应sa信号，结果如图5，a所示，推测sthb6可能参与生物胁迫的应答反应。
[0063]
为了确定上述结果，我们进一步通过rt-qpcr分析了sthb6在进行pvy处理24h、48h、72h下的表达模式。结果如图5，b所示，在接种pvy处理72h内，sthb6表达量出现变化，其中接种叶在24h表达量最高，结果如图5，c所示，随着时间的延长表达量有下降的趋势，在接种叶的上位叶sthb6表达量急剧升高，在72h之内表达量持续升高并维持较高的表达水平。实验结果进一步表明sthb6受pvy的诱导表达。
[0064]
通过rt-qpcr对sthb6在马铃薯各组织器官的表达进行分析，结果如图6，a所示，sthb6在四倍体e3的花中表达量最高，其次是匍匐茎，其他组织器官表达量较低。另外为了获得编辑效率较高的植株，我们拟采用二倍体马铃薯ac142进行sthb6基因编辑，因此，我们还检测了sthb6在ac142各组织器官中的表达。结果如图6，b所示，不同于四倍体马铃薯品种e3中的表达模式，sthb6在ac142的块茎和叶片中表达量最高。
[0065]
实施例5、过表达、干扰转基因株系的获得与鉴定
[0066]
sthb6表达模式结果暗示马铃薯sthb6可能参与对生物胁迫的应答反应，同时也参与到马铃薯各个器官的发育。为了深入研究sthb6在马铃薯中的具体功能，我们分别构建了sthb6过表达、干扰载体。通过设计含有ecor i和spe i酶切位点的引物prc26b-hb6-f/r(seq id no.3～4)，对sthb6的全长cds进行扩增，电泳检测表明在1000bp左右有明亮的条带。通过酶切连接prc26b载体骨架(prc26b-hb6载体图谱如图7所示)，转化大肠杆菌dh5α，进行菌落pcr检测和测序，结果如图8，a所示，获得过表达载体prc26b-3
×
flag-sthb6。转化农杆菌gv3101，用于后续马铃薯遗传转化。选取sthb6基因中特异的382bp作为干扰片段，通过设计带有xho i和xba i酶切位点的seq id no.5～8所示引物，对其进行扩增，在250-500bp之间有明亮条带。对其进行同源重组，转化大肠杆菌dh5α，进行菌落pcr检测和测序，结果如图8，b所示，获得干扰表达载体phellsgate8-sthb6。转化农杆菌gv3101，用于后续马铃薯遗传转化。
[0067]
利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化法，将sthb6过表达、干扰载体转化至马铃薯中。经过二次生根筛选，如图8，c所示，获得过表达、干扰植株分别为20株、18株转基因株系，将过表达植株命名为oe株系，干扰株系命名为ri株系。分别利用过表达植株检测引物(35s-f/prc26b-hb6-r)干扰植株检测引物(gat8-hb6-反向-f/gat8-hb6-反向-r)对转基因株系的gdna进行检测。结果如图9，a表明，以检测引物在转基因株系的gdna中可分别扩增获得1000bp/250-500bp左右的特异性条带，过表达植株oe-1、oe-3、oe-4、oe-9检测条带清晰，干扰植株ri-2、ri-4、ri-5、ri-8、ri-11、ri-12检测条带清晰。
[0068]
rt-qpcr结果如图9，b所示，表明sthb6的过表达转基因株系oe-1、oe-3、oe-4、oe-9
基因的表达量均显著高于对照，干扰转基因株系ri-2、ri-4、ri-5、ri-8、ri-11、ri-12中sthb6的表达量均显著低于对照。其中，过表达株系中sthb6的表达量与对照相比，分别为wt的11.31倍、4.14倍、5.12倍、2.85倍，干扰株系中sthb6的表达量与对照相比，分别为wt的0.38倍、0.197倍、0.35倍、0.124倍、0.11倍、0.44倍。挑选了oe-1、oe-4、oe-9植株进行western blot免疫印迹检测，进一步确定转基因植株中sthb6蛋白水平的表达。结果如图9，c所示，3个转基因植株中均可检测出目的蛋白大小的条带。
[0069]
实施例6、转基因株系的生长发育表型鉴定
[0070]
一、sthb6负调控块茎重量
[0071]
对转基因植株的块茎农艺性状进行考察，结果如图10所示，观察温室种植80天后的转基因植株块茎的形态及产量。与野生型(e3)相比，结果如图10，a所示，所有的转基因株系(oe-1、oe-3、oe-4、ri-2、ri-4、ri-11)的薯块形态无显著差异，单株薯数如图10，b所示，单株薯数与wt相比无显著差异。单株薯重如图10，c所示，在3个过表达株系和3个干扰株系中，oe-3、ri-4的单株薯重显著降低；平均单株薯重如图10，d所示，过表达株系oe-3平均单株薯重显著降低，而干扰株系ri-4平均单株薯重并无显著降低；薯型如图10，e所示，所有转基因植株的薯型无显著差异。因此当马铃薯室内种植80天后，过表达株系中的薯重发生变化，单株薯重降低，平均单个薯重也降低，综上的结果说明sthb6负调节植株块茎重量。
[0072]
为了验证sthb6转基因植株在自然条件下的生长发育情况，本实验将各个转基因植株种植在自然光照条件下，观察种植90天的转基因植株块茎发育情况。各株系块茎的表型如图11，a所示，所有的转基因株系(oe-1、oe-3、oe-4、oe-9、ri-2、ri-5、ri-8、ri-12)的块茎形态无明显差异。单株结薯数如图11，b所示，与对照相比，转基因株系oe-3、9；ri-2、8、12单株薯数均显著升高；单株薯重如图11，c所示，转基因株系oe-1单株薯重显著降低，ri-12单株薯重显著升高。平均单个薯重如图11，d所示，oe-1、oe-9、ri-5平均单个薯重显著降低。薯型如图11，e～g所示，各转基因的薯型没有明显差异。这些结果表明，自然光照条件下，sthb6过表达株系和干扰株系的薯数均增多，但过表达株系单株薯重降低，导致平均单个薯重显著降低，这个结果与室内盆栽种植结果一致，进一步说明sthb6负调控马铃薯块茎重量的产生。
[0073]
二、sthb6转基因植株异养结薯
[0074]
为了进一步研究马铃薯块茎的生长发育，用含8％蔗糖的ms固体培养基在短日照条件下诱导结薯，将组培苗插到固体培养基里，每个转基因株系各24株，诱导结薯90天，观察试管薯的薯长、薯宽、薯的长宽比、结薯率及平均薯重。如图12，a所示，干扰株系与对照相比，薯数增多。如12，b所示，干扰株系的薯长与对照相比显著增加。如图12，c所示，干扰株系的薯宽与对照相比显著增加。薯型如图12，d所示，各转基因的薯型(长宽比)未发生改变。如表3所示，干扰株系的异养结薯率、平均薯重比对照和过表达植株的结薯率和平均薯重增多，证明干扰株系生长发育要早于对照，说明sthb6负调控马铃薯块茎生长。
[0075]
表3.sthb6过表达、干扰株系异养结薯的统计情况
[0076]
[0077][0078]
实施例7、马铃薯sthb6转基因植株pvy抗性分析
[0079]
一、pvy侵染前后sthb6亚细胞定位变化
[0080]
结果如图12所示，sthb6定位于细胞核。在本氏烟草接种pvy病毒7天后，通过农杆菌介导法，将sthb6-gfp在本氏烟草的叶片中进行瞬时表达。结果如图13所示，gfp-ev(空载)的绿色荧光充满整个细胞膜和核；而sthb6-gfp荧光信号充满整个细胞，表明pvy侵染后，sthb6的亚细胞定位发生改变，可能定位于细胞核和细胞质。
[0081]
二、pvy侵染后sthb6转基因株系表型观察
[0082]
为了进一步研究sthb6在pvy侵染应答中的功能，本研究采用pvy分别接种野生型对照(wt)和sthb6的过表达、干扰转基因株系。结果显示，在pvy侵染21天之后，相比于植株的接种叶(图14，a)、sthb6过表达株系的上位叶与wt相比，对pvy侵染表现出一定的抗性，叶片受伤害程度较低，病斑数量较少(图14，b)；而干扰植株则表现出明显的易感性，叶片出现较多明显的坏死性斑点，损伤程度明显比对照植株严重。我们推测sthb6在马铃薯中的过表达可能提高了植株对pvy的抗性。
[0083]
三、pvy侵染后马铃薯sthb6转基因株系叶片dab染色
[0084]
马铃薯被pvy侵染后，感染部位在短时间内产生大量的活性氧(ros)分子从而导致细胞死亡，将病原体的生长限制在一定的范围内，能阻止病菌的扩散，防止产生大范围的损伤。在接种pvy的3天后，如图15所示，sthb6过表达、干扰植转基因植株与野生型对照植株的接种叶和上位叶经dab染色后，wt和干扰的叶片中观察到较小的范围被染成浅红色的区域，表明pvy在接种后会造成低水平的h2o2积累，不能产生超敏反应，病原体可以继续侵染周围的细胞，并最终使叶片枯萎。与此不同，在sthb6过表达株系叶片上可以观察到一些被染成深红色的部分，表明pvy的侵染可能引起h2o2大量的积累，这些被侵染部分的细胞会在短时间内发生程序性死亡，抑制了病毒的复制，使得pvy不能继续侵染周围的细胞。以上结果表明，sthb6可能正调控马铃薯对pvy的抗性。
[0085]
四、pvy侵染后sthb6转基因株系病毒积累量的定量检测
[0086]
为了进一步确定pvy侵染后sthb6转基因植株中病毒积累量的变化，我们采用rt-qpcr分别检测了侵染4天的接种叶和上位叶以及侵染11天的上位叶中pvy外壳蛋白(coat protein，cp)基因的表达量。如图16，a～c所示，在转基因植株和野生型对照接种pvy 4天、11天时，sthb6在过表达、干扰植株中差异表达。如图16，d所示，可以看出过表达和干扰表达植株叶片中pvy cp基因均有一定的表达量，说明pvy在接种叶中积累。从图16，e所示，接种4天时pvy已在上位叶积累，但sthb6过表达植株上位叶中病毒积累量与wt相比显著降低，sthb6干扰植株上位叶中病毒的积累量与wt相比显著升高。如图16，f所示，接种11天时的上
位叶中，sthb6过表达植株中pvy的积累量极显著降低，说明sthb6的表达量升高会延缓病毒的传播和积累速度，而降低sthb6的表达量有助于pvy的传播和积累。
[0087]
如图17，a，b所示，sthb6过表达、干扰表达植株在接种pvy 21天时，sthb6在接种叶和上位叶的相对表达量。如图17，c所示，在接种病毒21天后，可以看出过表达和干扰表达植株叶片中pvy cp基因均有一定的表达量，说明pvy在接种叶中积累。如图17，d所示，在接种病毒21天时，干扰植株的上位叶中病毒的积累量与wt相比显著升高，相反，过表达植株中上位叶的病毒积累与wt相比显著降低。综上所述，可以表示sthb6参与pvy的传播途径，sthb6表达量降低后，病毒的积累量显著增加，而sthb6的表达量增加后病毒的积累量显著降低，sthb6表达量增加可以延缓pvy病毒的传播和积累速度，正向调控pvy的侵染。
[0088]
实施例8、sthb6对马铃薯晚疫病的抗性调控
[0089]
一、病斑测定
[0090]
按照晚疫病的发病情况分级，如图18，a所示，接种晚疫病致病菌后，sthb6过表达株系的叶片可见少量的黑色病斑且病斑呈现针眼大小，不超过5mm，属于晚疫病发病情况分级的1-2级。sthb6干扰株系叶片呈现大片的黑色枯死的病斑，病斑大小在(8-15mm),在黑色枯死病斑上出现白色的菌丝体，属于晚疫病发病情况分级的3-4级。如图18，b所示，sthb6过表达株系叶片的病斑直径与wt相比显著降低，而sthb6干扰株系的病斑直径与wt相比显著升高，说明sthb6基因表达量增加能抑制晚疫病孢子的繁殖，sthb6的表达量降低加快了晚疫病致病菌孢子的繁殖速度。综上结果表明，sthb6可能参与对晚疫病抗性的正向调控。
[0091]
二、台盼蓝染色
[0092]
植物为抵抗病菌的入侵，大多通过细胞程序性死亡来阻止病菌向周围细胞的扩散，如图19，a所示，接种晚疫病5天后sthb6过表达植株的叶片经台盼蓝染色后的蓝色部分比wt叶片的蓝色部分小，而sthb6干扰植株的叶片蓝色部分比wt叶片的蓝色部分大，结果如图19，b所示，sthb6过表达植株叶片经台盼蓝染色后的病斑直径与wt相比显著降低，而sthb6干扰植株叶片经台盼蓝染色后的病斑直径与wt相比显著升高。再次验证接种晚疫病致病菌后的病斑大小结果，sthb6参与对晚疫病的抗性调控，且为正向调控。
[0093]
实施例9、thb6转录因子的调控网络分析
[0094]
一、sthb6结合sttctp的启动子
[0095]
在实验室前期通过烟草nthb6研究以及查阅相关文献后，发现翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein，tctp)，在人类基因组中也称为p23，是一个可能在茄科植物中帮助pvy进行转运的蛋白。如图20所示，对马铃薯tctp基因的启动子进行分析，发现sttctp的启动子中具有拟南芥athb6的绑定基序[taatnatt]。
[0096]
为了确认转录因子sthb6与sttctp的启动子绑定，我们进行了双荧光素酶报告基因实验。以e3的gdna为模板，采用pcr扩增sttctp包含[taataatt]顺式作用元件在内的seq id no.24所示tctp-1(soltu.dm.01g039490.1)启动子序列、seq id no.25所示tctp-2(soltu.dm.01g039500.1)启动子序列并构建到载体上，然后将pgreenii 0800-luc载体和空载pcambia1300-egfp载体、pgreenii 0800-luc-tctp载体和空载pcambia1300-egfp分别热激转入农杆菌gv3101，然后分别一起注射进本氏烟草中，2天后观察荧光并取样，液氮速冻。
[0097]
检测luc及ren的荧光值并计算luc/ren的比值。结果如图21所示，共注射到本氏烟
草的luc/ren比值显著低对照，说明sthb6与sttctp启动子互作且起抑制作用。
[0098]
二、sthb6、pvy-cp与sttctp三者之间的关系
[0099]
综上所述，sthb6绑定sttctp启动子并显著抑制sttctp的转录，推测sthb6通过抑制sttctp转录，使得tctp不能参与pvy的转运，从而正向调控植株的pvy抗性。
[0100]
通过检测接种pvy 4天、11天、21天的接种叶和上位叶中sthb6、sttctp、pvy-cp的表达，如图22，a～d所示，pvy侵染sthb6各转基因植株4天、11天、21天后的接种叶和上位叶中，sthb6在各转基因植株的相对表达量。图22，f所示，过表达植株的4天上位叶中sthb6表达量增加，pvy-cp和sttctp的表达量显著降低，干扰株系上位叶sthb6的表达量降低使得pvy-cp和sttctp的表达量显著高于wt；如图22，g所示，在接种pvy病毒11天时，pvy-cp在过表达株系的表达量显著降低；如图22，h所示，在接种pvy病毒21天时，pvy-cp在sthb6过表达株系中相对表达量与wt相比显著降低，而pvy-cp在sthb6干扰株系中的相对表达量与wt相比显著升高，如图22，l所示，sttctp的表达与wt相比无显著差异，说明sttctp可能在pvy的接种前期中表达效果好，后面tctp表达效果不显著，证明sttctp的表达是马铃薯感染的早期阶段被马铃薯y病毒所诱导。综上所述，通过rt-qpcr检测sthb6过表达、干扰转基因植株接种pvy 4天、11天、21天后pvy-cp、sttctp的相对表达量，推测sthb6通过抑制sttctp转录，使得sttctp不能参与pvy的转运，延缓了pvy病毒的传播和积累速度，从而正向调控植株的pvy抗性。
[0101]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.过表达转录因子sthb6在改良马铃薯性状中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转录因子sthb6的氨基酸序列如seq id no.22所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转录因子sthb6的核苷酸序列如seq id no.21所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的单株结薯数中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的结薯率中的应用。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的总薯重中的应用。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的平均薯重中的应用。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的hpv抗性中的应用。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：过表达转录因子sthb6在提高马铃薯的晚疫病抗性中的应用。10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述过表达转录因子sthb6的方法为将权利要求3所述的sthb6的核苷酸序列通过ecor i和spe i酶切位点连接prc26b载体骨架获得重组表达载体，然后在农杆菌介导下转化马铃薯，获得过表达转录因子sthb6的转基因植株。

技术总结
本发明公开了过表达转录因子StHB6在改良马铃薯性状中的应用，属于植物分子生物学技术领域，转录因子StHB6的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，在马铃薯中过表达转录因子StHB6可以提高马铃薯的单株结薯数、结薯率、总薯重、平均薯重，还能提高对HPV和晚疫病的抗性，研究结果为进一步揭示HD-Zip家族在马铃薯生长发育中的功能，解析马铃薯PVY和晚疫病抗性分子机制和调控网络提供重要信息。为进一步提高马铃薯的产量、品质和抗病性的分子育种提供基因资源和新的思路。路。路。


技术研发人员：张凯 吕长文 杜叶 都艺芝 熊逸凡 高艳 杨朝彬 韩永辉 刘勋 易小平 唐道彬 王季春
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/9/23