酶制剂混合物及其制备方法和25-羟基胆固醇或25-羟基维生素D3的制备方法与流程

酶制剂混合物及其制备方法和25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的制备方法
技术领域
1.本发明涉及酶催化领域，具体涉及一种酶制剂混合物及其制备方法和25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的制备方法。


背景技术：

2.25-羟基维生素d3，又称为骨化二醇，是维生素d3的一种生物活性衍生物，对骨质疏松、佝偻病、骨软化症等疾病有显著疗效，还被用于治疗血液透析所致的低血钙病。25-羟基维生素d3还可以作为食品和饲料添加剂使用。25-羟基胆固醇是化学法生产25-羟基维生素d3的重要原料。
3.25-羟基胆固醇和25-羟基维生素d3可以使用化学法进行合成，但均涉及径开环、断键、环和、还原、耦合、氧化、纯化等多步骤反应，存在着步骤多、转化率低、副产物多以及分离纯化困难等问题，大规模生产难度很大。近年来，随着合成生物学与基因编辑技术的快速发展，利用重组微生物发酵生产特定酶，而后利用获得的生物酶催化生产复杂化合物的方法越来越受到重视。生物酶法催化底物胆固醇或者维生素d3生成对应的25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3具有生产成本低、反应条件温和、转化率高、易提取等优点，适合进行大规模生产。但是现有的生物酶法制备25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3采用的是p450单酶法，需要使用价格昂贵的酶反应辅因子，如nadh或nadph、细胞色素c等，且转化率最高仅为80％，转化率仍有待提高。
4.因此亟需一种成本低且底物胆固醇或者维生素d3转化率高的生物酶法制备25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术的单酶法制备25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的转化率低，且需要使用价格昂贵的酶反应辅因子的问题，提供一种酶制剂混合物及其制备方法和25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的制备方法，采用自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶双酶联合催化法生产25-羟基胆固醇或者25-羟基维生素d3，可以采用较廉价的葡萄糖作为辅因子。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种酶制剂混合物，所述酶制剂混合物包含自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶；其中，
7.所述自洽型p450酶为(a)-(e)中任意一项所述的酶：
8.(a)具有如seq id no：2或seq id no：3所示氨基酸序列的酶；
9.(b)seq id no：2或seq id no：3所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸残基且仍具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；
10.(c)与seq id no：2或seq id no：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；
11.(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
12.(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
13.本发明第二方面提供一种酶制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
14.(1)将含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌或含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌的种子进行发酵培养，待得到的发酵液的od
600
值为10-15时，将发酵液与诱导剂混合进行诱导培养，得到含菌发酵液；其中，所述诱导剂为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐和异丙基硫代半乳糖苷；
15.(2)将所述含菌发酵液进行破壁，得到破壁液；
16.(3)将所述破壁液进行分离，得到自洽型p450酶或葡萄糖脱氢酶；
17.(4)将各自得到的自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶进行混合。
18.本发明第三方面提供一种本发明提供的制备方法制得的酶制剂混合物。
19.本发明第四方面提供一种25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将酶制剂混合物、助溶剂、辅因子、底物和溶剂进行混合，得到混合液，然后进行转化反应，得到所述25-羟基胆固醇或所述25-羟基维生素d3；
20.其中，所述底物为胆固醇或维生素d3，所述酶制剂混合物为本发明提供的酶制剂混合物。
21.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
22.本发明采用微生物双酶法既可以制备25-羟基胆固醇，也可以用来制备25-羟基维生素d3，酶反应条件温和，反应时间短，适合用来进行大规模生产。本发明采用微生物双酶法直接将底物胆固醇或者维生素d3转化为25-羟基胆固醇或者25-羟基维生素d3，转化率较高，副产物少，有利于后续提取工艺。
23.另外，本发明首次采用自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶双酶联合催化法生产25-羟基胆固醇或者25-羟基维生素d3，与只用p450单酶法相比，可以用较廉价的辅因子葡萄糖替代较昂贵的酶反应辅因子如nadh或nadph、细胞色素c等。与化学法相比，则大幅减少了反应步骤，提高了转化率，降低了生产成本，适合进行大规模生产。
24.本发明在对菌体破壁后，对破壁液进行絮凝沉降，离心获得含酶上清。絮凝沉降除去了大部分的细胞碎片和大蛋白，净化了酶反应体系，有利于提高转化效率和后续提纯操作。
25.在本发明的优选实施方式中，通过选择合适的自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶的种类，底物、辅因子、自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶的用量，以及酶转化反应条件，进一步提高了底物胆固醇或者维生素d3的转化率，转化率达97％以上。
附图说明
26.图1是本发明的一种具体实施方式的制备自洽型p450酶或葡萄糖脱氢酶的工艺流程图。
具体实施方式
27.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
28.本发明第一方面提供一种酶制剂混合物，所述酶制剂混合物包含自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶；其中，
29.所述自洽型p450酶为(a)-(e)中任意一项所述的酶：
30.(a)具有如seq id no：2或seq id no：3所示氨基酸序列的酶；
31.(b)seq id no：2或seq id no：3所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸残基且仍具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；
32.(c)与seq id no：2或seq id no：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；
33.(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
34.(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
35.本发明中，所述自洽型(self-sufficient)p450酶为催化自住型p450酶，即不仅包含p450氧化结构域，又包含单独的还原酶结构域。可以商购，也可以自制而得。
36.组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、甲硫氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)和脯氨酸(pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、天冬氨酸(asn)、谷氨酰胺(gln)和酪氨酸(tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)和组氨酸(his)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。
37.蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由arg取代lys或由leu取代ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述自洽型p450酶的任意一个氨基酸残基位置上。
38.除上所述的氨基酸残基取代，所述自洽型p450酶还包括相比于seq id no.2或seq id no：3所示氨基酸序列在氨基酸残基任意位置发生一个或多个氨基酸残基缺失或添加或兼而有之的蛋白。
39.所述自洽型p450酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。衍生的蛋白质指与具有上述氨基酸序列的自洽型p450酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。衍生的蛋白质还包括具有天然l型氨基酸的残基的类似物
(如d型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。
40.修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
41.在本发明中，所述自洽型p450酶还可以是与seq id no：2或seq id no：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶。优选地，所述自洽型p450酶为与seq id no：2或seq id no：3所示的氨基酸序列具有90％以上，更优选99％以上同源性，且具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶。
42.为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)、(b)或(c)进行添加修饰，举例来说，可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接有标签(poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一种标签)的氨基酸序列而获得。所述标签不会影响自洽型p450酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。
43.在本发明中，所述自洽型p450酶的氨基末端还可以连接信号序列。所述信号序列可以来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，但不限于此。
44.在本发明中，仍具有酶活力是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的酶仍具有酶活力，其酶活力与(a)的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于60％，优选不低于70％(或80％，或90％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。
45.根据本发明，优选地，所述自洽型p450酶为具有如seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4所示氨基酸序列的酶，更优选为具有如seq id no：4所示氨基酸序列的酶。
46.根据本发明，优选地，所述自洽型p450酶来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
47.来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，且具有如seq id no：1所示氨基酸序列的自洽型p450酶属于cyp102a1亚家族，将其命名为cyp102a1-1，其ncbi登录号为cub59589.1。
48.根据本发明，当cyp102a1-1具有的如seq id no：1所示的氨基酸序列的第200位的亮氨酸被精氨酸取代，得到具有如seq id no：2所示氨基酸序列的自洽型p450酶，将其命名为cyp102a1-1l200r。
49.根据本发明，当cyp102a1-1具有的如seq id no：1所示的氨基酸序列的第412位的亮氨酸被精氨酸取代，得到具有如seq id no：3所示氨基酸序列的自洽型p450酶，将其命名为cyp102a1-1l412r。
50.根据本发明，当cyp102a1-1具有的如seq id no：1所示的氨基酸序列的第200位的亮氨酸和第412位的亮氨酸同时被精氨酸取代，得到具有如seq id no：4所示氨基酸序列的自洽型p450酶，将其命名为cyp102a1-1l200r/l412r。
51.与cyp102a1-1相比，cyp102a1-1l200r、cyp102a1-1l412r和cyp102a1-1l200r/l412r具有更高的酶活性。
52.根据本发明，优选地，所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis 168)。来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis 168)的葡萄糖脱氢酶，将其命名为gdh，其ncbi登录号为np_388275.1。
53.根据本发明，优选地，所述自洽型p450酶和所述葡萄糖脱氢酶的体积比为(3-5)：1。
54.本发明第二方面提供一种酶制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
55.(1)将含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌或含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌的种子进行发酵培养，待得到的发酵液的od
600
值为10-15时，将发酵液与诱导剂混合进行诱导培养，得到含菌发酵液；其中，所述诱导剂为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ala)和异丙基硫代半乳糖苷(iptg)；
56.(2)将所述含菌发酵液进行破壁，得到破壁液；
57.(3)将所述破壁液进行分离，得到自洽型p450酶或葡萄糖脱氢酶；
58.(4)将各自得到的自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶进行混合。
59.即自洽型p450酶可以通过以下方法制得：
60.(1
′
)将含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌的种子进行发酵培养，待得到的发酵液的od
600
值为10-15时，将发酵液与诱导剂混合进行诱导培养，得到含菌发酵液；其中，所述诱导剂为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ala)和异丙基硫代半乳糖苷(iptg)；
61.(2
′
)将所述含菌发酵液进行破壁，得到破壁液；
62.(3
′
)将所述破壁液进行分离，得到自洽型p450酶。
63.葡萄糖脱氢酶可以通过以下方法制得：
64.(1
″
)将含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌的种子进行发酵培养，待得到的发酵液的od
600
值为10-15时，将发酵液与诱导剂混合进行诱导培养，得到含菌发酵液；其中，所述诱导剂为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ala)和异丙基硫代半乳糖苷(iptg)；
65.(2
″
)将所述含菌发酵液进行破壁，得到破壁液；
66.(3
″
)将所述破壁液进行分离，得到葡萄糖脱氢酶。
67.本发明中，所述发酵培养和所述诱导培养的总时间即为发酵周期。
68.本发明中，所述诱导剂的作用是诱导酶基因的表达，以5-ala和iptg共同作为诱导剂，5-ala和iptg能够起到相互协同的作用，提高酶基因的表达量。
69.本发明第二方面中酶制剂的制备方法中，自洽型p450酶、葡萄糖脱氢酶的种类及用量均与本发明第一方面中所述的酶制剂混合物中的自洽型p450酶、葡萄糖脱氢酶的种类及用量完全相同，为了避免重复，本发明在该第二方面中不再赘述，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。
70.根据本发明，所述自洽型p450酶的编码基因具有编码自洽型p450酶的核苷酸序列。
71.相应地，所述基因可以为如下的(1)或(2)：
72.(1)具有编码所述自洽型p450酶的氨基酸序列的dna分子；
73.(2)在严格条件下与(1)限定的dna序列杂交且编码的自洽型p450酶的酶活性不变的dna分子。其中，所述严格条件可以为：在6
×
scc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
scc，0.1％ sds和1
×
scc，0.1％ sds各洗膜一次。酶活性不变是指在相同的测定条
件下，由(2)编码的蛋白质的酶活力与(1)编码的蛋白质的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。
74.本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除met(atg)或trp(tgg)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录d)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的自洽型p450酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如pcr方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的dna序列，也可以通过本领域公知的方法，例如sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与所述自洽型p450酶活性一致的氨基酸序列。
75.根据本发明，优选地，所述自洽型p450酶的编码基因具有编码具有seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列，更优选为具有编码具有seq id no：4所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
76.根据本发明的一种优选实施方式，具有如seq id no：1所示的氨基酸序列的cyp102a1-1，其优化后的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。该核苷酸序列的至少一个氨基酸密码子被取代，得到具有编码具有seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
77.根据本发明的一种优选实施方式，具有如seq id no：2所示的氨基酸序列的cyp102a1-1l200r，其优化后的编码基因的核苷酸序列为seq id no：5中的第599-600位tg替换为gt。
78.根据本发明的一种优选实施方式，具有如seq id no：3所示的氨基酸序列的cyp102a1-1l412r，其优化后的编码基因的核苷酸序列为seq idno：5中的第1235-1236位tg替换为gt。
79.根据本发明的一种优选实施方式，具有如seq id no：4所示的氨基酸序列的cyp102a1-1l200r/l412r，其优化后的编码基因的核苷酸序列为seq id no：5中的第599-600位tg和第1235-1236位tg同时替换为gt。
80.编码基因的的核苷酸序列可以用聚合酶链式反应(pcr)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用pcr进行扩增获得有关核苷酸序列。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得有关核苷酸序列克隆入载体，得到重组载体，再将重组载体转入宿主细胞中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。
81.此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
82.根据本发明，含有编码基因的重组载体中使用的载体可以为本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。根据本发明，优选地，含有自洽型p450酶的编码基因的重组载体的表达载体，以及含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的重组载体
的表达载体均为pet系列质粒，更优选为适用于大肠杆菌的pet-28a(+)载体。pet-28a(+)载体可以商购获得，例如可以购自生物风。重组载体的构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒载体。
83.可以通过本领域常规的方法将重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。含有自洽型p450酶的编码基因的重组载体和含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的重组载体的宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌(escherichia coli)或放线菌，更优选为大肠杆菌(escherichia coli)，最优选为大肠杆菌bl21(de3)。大肠杆菌bl21(de3)可以商购获得，例如可以购自宝生物(北京)科技有限公司)。
84.根据本发明，优选地，所述发酵培养在发酵培养基中进行，以所述发酵培养基的总体积为100ml计，所述发酵培养基包括：葡萄糖2-3g、蛋白胨0.5-1g、酵母膏0.5-1g、磷酸二氢钾0.2-0.5g、氯化铵0.5-1g、七水硫酸镁0.05-0.1g、四水氯化锰0.005-0.01g、无水氯化铁0.005-0.01g。
85.根据本发明，所述发酵培养基的ph值为6.5-7，优选为使用氨水调节发酵培养基的ph值。配制好培养基后，于121℃灭菌30min后用于发酵培养。
86.根据本发明，优选地，所述发酵培养的通风比为0.8-1vvm，do值为30％以上；所述诱导培养的通风比为0.8-1vvm，do值为30％以上。当通风比和do值满足此范围时，既能够满足菌体正常生长供氧要求，又能满足菌体产酶供氧需求。
87.本发明中，所述通风比指的是每分钟通气量和实际发酵液体积之比；do值指的是溶氧电极测得的发酵液中溶解氧含量，do值为100％指的是氧气无消耗时，当前温度、ph和罐压下发酵液中氧的饱和溶解度；do值为30％以上表示将发酵液溶解氧控制在饱和溶解度值的30％以上。
88.根据本发明，优选地，所述发酵培养的温度为35-37℃。发酵培养的温度在此范围内时，能够使得菌体快速生长。
89.根据本发明，优选地，所述诱导培养的温度为22-25℃。诱导培养的温度在此范围内时，能够降低菌体生长代谢速率，有利于产物酶的合成。
90.根据本发明，优选地，所述发酵培养的ph值为6.5-7；所述诱导培养的ph值为6.5-7。发酵培养和诱导培养的ph在此范围内时，能够使得菌体较快速地生长和产酶。
91.根据本发明，优选地，所述发酵培养和所述诱导培养的总时间为22-26h。发酵培养和诱导培养总时间在此范围内时，能够提高菌体产酶量。
92.根据本发明，优选地，以所述发酵液的总体积为1l计，5-ala的用量为100-200mg，iptg的用量为0.1-0.15mmol。5-ala和iptg诱导浓度在此范围内时，能够提高菌体酶的表达量。
93.根据本发明，优选地，所述制备方法还包括：步骤(1)中，所述发酵培养进行4-6h时，在所述发酵液中连续补入补料培养基，直至所述发酵培养和所述诱导培养结束，得到所述含菌发酵液。培养4-6h时，初始培养基中底料葡萄糖已消耗较多，及时补入补料培养基能够使得菌体继续生长。
94.根据本发明，优选地，以所述补料培养基的总体积为100ml计，所述补料培养基包
括：葡萄糖40-60g和七水硫酸镁0.5-1g。配制好后于121℃灭菌30min。补料培养基在此浓度范围内时，能够使得菌体继续较快地生长和产酶。
95.根据本发明，优选地，所述补料培养基的补入速度为5-10ml/l/h，即相对于每升发酵液，每小时补入5-10ml补料培养基。补料速度控制在此范围内时，能够满足菌体正常生长和产酶的营养需求。
96.根据本发明，优选地，步骤(1)中，所述种子的制备方法包括：将所述含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌或所述含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌在种子培养基中进行培养，所述培养的温度为30-35℃，时间为3-5h，得到所述种子。
97.根据本发明，优选地，所述种子培养基为lb培养基，在摇床转速为220rpm条件下进行培养。
98.根据本发明，步骤(2)中，所述含菌发酵液通过第一离心进行固液分离，去除上清并收集菌体，然后对菌体进行破壁。优选地，所述破壁的方法包括：用ph值为7.2-7.5的磷酸盐缓冲液将所述菌体进行悬浮，得到悬浮液，再将所述悬浮液进行破壁，得到所述破壁液。
99.根据本发明的具体实施方式，采用离心机进行所述第一离心，优选地，离心机的转速为5000-10000rpm，所述第一离心的时间为20-30min；采用高压均浆机进行所述破壁，优选地，高压均浆机的破壁条件为80-100mpa压力条件下破壁两次。
100.根据本发明，优选地，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液的用量为所述菌体重量的3-6倍。
101.根据本发明，优选地，步骤(2)中，以所述磷酸盐缓冲液的体积为1l计，所述磷酸盐缓冲液中含有的磷酸根的含量为0.1mol。
102.根据本发明，优选地，步骤(3)中，所述分离的方法包括：将所述破壁液与浓度为10-15wt％的聚乙烯亚胺(pei)溶液混合进行絮凝沉淀，以去除细胞碎片以及大蛋白颗粒，然后进行第二离心并收集上清，得到所述自洽型p450酶或所述葡萄糖脱氢酶。
103.根据本发明的具体实施方式，采用离心机进行所述第二离心，优选地，离心机的转速为5000-10000rpm，所述第二离心的时间为20-30min。
104.根据本发明，浓度为10-15wt％的聚乙烯亚胺(pei)溶液可以采用以下方法配制：用去离子水将浓度为30wt％的pei原液稀释2-3倍，然后用30wt％的硫酸调节ph至7.2-7.5。
105.根据本发明，优选地，步骤(3)中，pei溶液的用量为步骤(2)中所述菌体重量的0.25-0.45倍。
106.根据图1对本发明的一种具体实施方式的自洽型p450酶或葡萄糖脱氢酶的制备方法进行说明。先将含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌或含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌的种子进行培养，得到含菌发酵液；然后将含菌发酵液进行离心以收集菌体，再用磷酸盐缓冲液将菌体进行悬浮，得到悬浮液，再将所述悬浮液进行破壁，得到破壁液；将破壁液与pei溶液混合进行絮凝沉淀，以去除细胞碎片以及大蛋白颗粒，然后进行离心并收集含酶上清，得到所述自洽型p450酶或所述葡萄糖脱氢酶。
107.本发明第三方面提供一种本发明提供的制备方法制得的酶制剂混合物。
108.本发明第四方面提供一种25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将酶制剂混合物、助溶剂、辅因子、底物和溶剂进行混合，得到混合液，然后进行转化反应，得到所述25-羟基胆固醇或所述25-羟基维生素d3；
109.其中，所述底物为胆固醇或维生素d3，所述酶制剂混合物为本发明提供的酶制剂混合物。
110.根据本发明，优选地，所述酶转化反应的温度为25-35℃，时间为2-5h。
111.根据本发明，所述辅因子的作用是促使底物与酶活性部位结合，从而提高酶的反应效率。优选地，所述辅因子为葡萄糖。
112.根据本发明，所述助溶剂的作用是提高底物维生素d3或胆固醇在酶反应体系中的溶解度，使得底物与酶活性部位更好地接触，提高酶反应效率。优选地，所述助溶剂为环糊精。
113.根据本发明，优选地，所述溶剂选自无水乙醇、乙酸乙酯和乙醚中的至少一种。
114.根据本发明，优选地，以所述混合液的总体积为100ml计，所述底物的用量为0.1-0.5g，所述助溶剂的用量为10-15g，所述辅因子的用量为2-5g。
115.根据本发明，所述酶制剂混合物的用量可以根据转化反应的实际需求来确定。优选地，以所述混合液的总体积为100ml计，所述酶制剂混合物的用量为85-95ml。
116.根据本发明的一种具体实施方式，所述制备方法包括以下步骤：将酶制剂混合物、助溶剂和辅因子进行混合，得到混合液-1；将底物和溶剂进行混合，得到混合液-2；将所述混合液-1和所述混合液-2进行混合，得到混合液-3，然后进行酶转化反应，得到所述25-羟基胆固醇或所述25-羟基维生素d3。
117.以下将通过实施例和对比例对本发明进行详细描述。以下实施例和对比例中，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
118.本发明的实施例和对比例中涉及的材料和测定方法如下：
119.宿主细胞大肠杆菌bl21(de3)，购自宝生物(北京)科技有限公司；
120.质粒载体pet-28a(+)，购自生物风；
121.编码cyp102a1-1的(如seq id no:1所示)氨基酸序列的基因(其优化后的编码基因的核酸序列如seq id no:5所示)通过苏州金唯智生物科技有限公司优化密码子并合成。
122.采用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的含量和转化率；
123.转化率％＝(产物25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的物质的量
÷
底物胆固醇或维生素d3的物质的量)
×
100％。
124.制备例1
125.按以下方法制备含有自洽型p450酶cyp102a1-1基因的基因工程菌：
126.(a)以合成的cyp102a1-1的编码基因为模板，以ndei-cyp102-a1-1f(seq id no:6)和hindiii-cyp102a1-1r(seq id no:7)为引物进行pcr扩增，切胶回收后得到两端带有酶切位点以及载体同源序列的基因片段。
127.(b)pet-28a(+)质粒使用限制性内切酶ndei/hindiii进行消化，利用pcr清洁试剂盒进行清洁，得到ndei/hindiii双酶切线性化的载体骨架，利用clonexpress ii one step cloning kit(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)一步法连接试剂盒将ndei/hindiii双酶切线性化的载体骨架和cyp102a1-1基因片段进行连接，然后转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，再涂布至lb+knr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行pcr验证，并将阳性转化子在lb+knr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用ndei和hindiii双酶切及测序验证，得到pet28a(+)-cyp102a1-1质粒。
128.(c)将构建获得的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+knr的平板上，于37℃培养过夜得到携带重组质粒的单克隆。
129.按以下方法制备自洽型p450酶cyp102a1-1：
130.(1)发酵培养：将制得的基因工程菌在装有lb培养基的摇瓶中，在摇床转速为220rpm且温度为32℃的条件下培养3h，得到种子液，然后接入装有发酵培养基的发酵罐中。在温度为35℃，ph值为7，通风比为1vvm的条件下进行培养，通过发酵罐搅拌转速将do值控制为30％，培养4h后开始连续补入补料培养基，补料速度维持在6ml/l/h，待发酵液中菌体od(600nm)值达10时，加入5-ala和iptg诱导剂(以发酵液的总体积为1l计，5-ala和iptg的用量分别为150mg和0.12mmol)，同时将培养温度降低至25℃进行诱导培养，培养至发酵周期为25h时得到含菌发酵液；其中，
131.lb培养基配方为：以lb培养基的总体积为100ml计，酵母浸粉0.5g，氯化钠1g，胰蛋白胨1g；
132.发酵培养基配方为：以发酵培养基的总体积为100ml计，葡萄糖2g，蛋白胨0.8g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾0.4g，氯化铵0.7g，七水硫酸镁0.06g，四水氯化锰0.006g，无水氯化铁0.006g。氨水调ph值至7，121℃灭菌30min；
133.补料培养基配方为：以补料培养基的总体积为100ml计，葡萄糖50g，七水硫酸镁0.8g。121℃灭菌30min；
134.(2)破壁：将含菌发酵液用离心机5000rpm离心20min后，去除上清并收集湿菌泥，然后用ph为7.5的磷酸根含量为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液重新悬浮，磷酸盐缓冲液用量为菌泥重量的4倍，菌悬液用高压均浆机在压力为95mpa的条件下进行破壁两次，获得破壁液；
135.(3)絮凝沉降离心：在破壁液中缓慢加入配制好的ph为7.5的浓度为10wt％的pei溶液对破壁液进行充分絮凝沉淀，pei溶液用量为湿菌泥重量的0.3倍，而后用离心机10000rpm离心30min后，收集上清即得自洽型p450酶cyp102a1-1含酶上清。
136.制备例2
137.按以下方法制备含有自洽型p450酶cyp102a1-1l200r基因的基因工程菌：
138.以构建好的pet28a(+)-cyp102a1-1质粒为模板，利用引物l200r-f(seq id no:8)和l200r-r(seq id no:9)进行扩增，对pcr产物进行清洁回收，利用dpni单酶切，将酶切之后的pcr产物转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于lb+knr平板上，于37℃倒置培养过夜，对长出的转化子进行测序验证，得到将cyp102a1-1氨基酸序列第200位的亮氨酸突变为精氨酸的pet28a(+)-cyp102a1-1l200r质粒。将构建获得的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+knr的平板上，于37℃培养过夜得到携带重组质粒的单克隆。
139.按照制备例1的方法，采用含有自洽型p450酶cyp102a1-1l200r基因的基因工程菌制备自洽型p450酶cyp102a1-1l200r含酶上清。
140.制备例3
141.按以下方法制备含有自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r基因的基因工程菌：
142.以构建好的pet28a(+)-cyp102a1-1l200r质粒为模板，利用引物l412r-f(seq id no:10)和l412r-r(seq id no:11)进行扩增，对pcr产物进行清洁回收，利用dpni单酶切，将酶切之后的pcr产物转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于lb+knr平板上，于37
℃倒置培养过夜，对长出的转化子进行测序验证，得到将cyp102a1-1氨基酸序列第200位和第412位的亮氨酸同时突变为精氨酸的pet28a(+)-cyp102a1-1l200r/l412r质粒。将构建获得的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+knr的平板上，于37℃培养过夜得到携带重组质粒的单克隆。
143.按照制备例1的方法，采用含有自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r基因的基因工程菌制备自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。
144.制备例4
145.来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis 168)的葡萄糖脱氢酶，将其命名为gdh，其ncbi登录号为np_388275.1。
146.按以下方法制备含有葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌：
147.以枯草芽孢杆菌168的细胞为模板，利用ndei-gdh-f(seq id no:12)和hindiii-gdh-r(seq id no:13)为引物进行pcr扩增，切胶回收后得到两端带有酶切位点以及载体同源序列的基因片段。利用clonexpress ii one step cloning kit(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)一步法连接试剂盒对ndei/hindiii双酶切线性化的载体骨架和gdh片段进行连接，然后转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，再涂布至lb+knr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行pcr验证，并将阳性转化子在lb+knr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用ndei和hindiii双酶切及测序验证，得到pet28a(+)-gdh质粒。将构建获得的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+knr的平板上，于37℃培养过夜得到携带重组质粒的单克隆。
148.按以下方法制备葡萄糖脱氢酶：
149.(1)发酵培养：将制得的基因工程菌在装有lb培养基的摇瓶中，在摇床转速为220rpm且温度为30℃的条件下培养5h，得到种子液，然后接入装有发酵培养基的发酵罐中。在温度为37℃，ph值为6.8，通风比为1vvm的条件下进行培养，通过发酵罐搅拌转速将do值控制为30％，培养6h后开始连续补入补料培养基，补料速度维持在10ml/l/h，待发酵液中菌体od(600nm)值达15时，加入5-ala和iptg诱导剂(以发酵液的总体积为1l计，5-ala和iptg的用量分别为200mg和0.15mmol)，同时将培养温度降低至22℃进行诱导培养，培养至发酵周期为24h时得到含菌发酵液；其中，
150.lb培养基配方同制备例1；
151.发酵培养基配方为：以发酵培养基的总体积为100ml计，葡萄糖3g，蛋白胨1g，酵母膏0.8g，磷酸二氢钾0.5g，氯化铵0.5g，七水硫酸镁0.08g，四水氯化锰0.01g，无水氯化铁0.008g。氨水调ph值至6.8，121℃灭菌30min。
152.补料培养基配方为：以补料培养基的总体积为100ml计，葡萄糖60g，七水硫酸镁0.5g。121℃灭菌30min；
153.(2)破壁：将含菌发酵液用离心机8000rpm离心30min后，去除上清并收集湿菌泥，然后用ph为7.2的磷酸根含量为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液重新悬浮，磷酸盐缓冲液用量为菌泥重量的6倍，菌悬液用高压均浆机在压力为90mpa的条件下进行破壁两次，获得破壁液；
154.(3)絮凝沉降离心：在破壁液中缓慢加入配制好的ph为7.2的浓度为10wt％的pei溶液对破壁液进行充分絮凝沉淀，pei溶液用量为湿菌泥重量的0.4倍，而后用离心机8000rpm离心30min后，收集上清即得葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清。
155.制备例5
156.按照制备例3的方法制备自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r，不同的是，步骤(3)中，使用浓度为15％wt的pei进行絮凝沉淀。得到自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。
157.制备例6
158.按照制备例3的方法制备自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r，不同的是，只使用iptg诱导剂，具体地，以发酵液的总体积为1l计，iptg的用量为0.15mmol。得到自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。
159.制备例7
160.按照制备例4的方法制备葡萄糖脱氢酶gdh，不同的是，待发酵液中菌体od(600nm)值达25时加入5-ala和iptg进行诱导培养。得到葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清。
161.制备例1-7中所用的引物的序列如表1所示。
162.表1
[0163][0164][0165]
实施例1
[0166]
按以下方法制备25-羟基胆固醇：
[0167]
将制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清和制备例4制得的葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清混合后加入环糊精和酶反应辅因子葡萄糖，充分搅拌溶解，得到混合液-1；将胆固醇溶解于无水乙醇，得到混合液-2；然后将混合液-1和混合液-2进行混合，得到混合液-3，于28℃条件下搅拌进行酶转化反应3h，得到25-羟基胆固醇。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为3.06g/l，转化率为98.08％；其中，
[0168]
以混合液-3的总体积为100ml计，环糊精的用量为10g，辅因子葡萄糖的用量为2g，胆固醇的用量为0.3g，自洽型p450酶含酶上清的用量为67.5ml，葡萄糖脱氢酶含酶上清的用量为22.5ml。
[0169]
实施例2
[0170]
按以下方法制备25-羟基维生素d3：
[0171]
将制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清和制备例4制得的葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清混合后加入环糊精和酶反应辅因子葡萄糖，充分搅拌溶解，得到混合液-1；将维生素d3溶解于无水乙醚，得到混合液-2；然后将混合液-1和混合液-2进行混合，得到混合液-3，于30℃条件下搅拌进行酶转化反应5h，得到25-羟基维生素d3。用hplc检测反应体系中25-羟基维生素d3的含量为5.09g/l，转化率为97.88％；其中，
[0172]
以混合液-3的总体积为100ml计，环糊精的用量为15g，辅因子葡萄糖的用量为5g，维生素d3的用量为0.5g，自洽型p450酶含酶上清的用量为72ml，葡萄糖脱氢酶含酶上清的用量为18ml。
[0173]
实施例3
[0174]
按照实施例1的方法制备25-羟基胆固醇，不同的是，所使用的自洽型p450酶不同，采用制备例5制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清代替等体积的制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为3.13g/l，转化率为97.08％。
[0175]
实施例4
[0176]
按照实施例1的方法制备25-羟基胆固醇，不同的是，辅因子葡萄糖的用量不同。具体地，以混合液-3的总体积为100ml计，辅因子葡萄糖的用量为8g。得到25-羟基胆固醇。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为2.6g/l，转化率为80.61％。
[0177]
实施例5
[0178]
按照实施例1的方法制备25-羟基胆固醇，不同的是，底物胆固醇的用量不同。具体地，以混合液-3的总体积为100ml计，胆固醇的用量为0.08g。得到25-羟基胆固醇。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为0.78g/l，转化率为90.68％。
[0179]
实施例6
[0180]
按照实施例2的方法制备25-羟基维生素d3，不同的是，酶转化反应条件不同。具体地，酶转化反应的温度为37℃，时间为1.5h。得到25-羟基维生素d3。用hplc检测反应体系中25-羟基维生素d3的含量为2.2g/l，转化率为78.36％。
[0181]
实施例7
[0182]
按照实施例2的方法制备25-羟基维生素d3，不同的是，自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶的用量比例不同。具体地，以混合液-3的总体积为100ml计，自洽型p450酶含酶上清的用量为45ml，葡萄糖脱氢酶含酶上清的用量为45ml。得到25-羟基维生素d3。用hplc检测反应体系中25-羟基维生素d3的含量为3.5g/l，转化率为73.3％。
[0183]
实施例8
[0184]
按照实施例1的方法制备25-羟基胆固醇，不同的是，采用制备例1制得的自洽型p450酶cyp102a1-1含酶上清代替等体积的制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。得到25-羟基胆固醇。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为
2.75g/l，转化率为88.14％。
[0185]
实施例9
[0186]
按照实施例1的方法制备25-羟基胆固醇，不同的是，采用制备例2制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r含酶上清代替等体积的制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。得到25-羟基胆固醇。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为2.88g/l，转化率为92.31％。
[0187]
对比例1
[0188]
按照实施例2的方法制备25-羟基维生素d3，不同的是，所使用的自洽型p450酶不同，采用制备例6制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清代替等体积的制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清。用hplc检测体系中25-羟基维生素d3的含量为3.6g/l，转化率为69.23％。
[0189]
对比例2
[0190]
按照实施例1的方法制备25-羟基胆固醇，不同的是，所使用的葡萄糖脱氢酶不同，采用制备例7制得的葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清代替等体积的制备例4制得的葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清。用hplc检测反应体系中25-羟基胆固醇的含量为1.9g/l，转化率为60.89％。
[0191]
由以上实施例和对比例的结果可以看出，实施例1-9按照本发明提供的技术方案，采用自洽型p450酶cyp102a1-1含酶上清、自洽型p450酶cyp102a1-1l200r含酶上清或自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清和葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清联合催化转化胆固醇或维生素d3生产25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3，转化率均达73％以上；而对比例1采用制备例6(只使用iptg诱导剂)制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清代替制备例3制得的自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清制备25-羟基维生素d3，对比例2采用制备例7(发酵液中菌体od
600
值达25时加入5-ala和iptg进行诱导培养)制得的葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清代替制备例2制得的葡萄糖脱氢酶gdh含酶上清制备25-羟基胆固醇，转化率均显著下降。说明采用本发明提供的方法制得的酶制剂混合物具有较高的酶活性，使胆固醇或维生素d3具有较高的转化率。如果葡萄糖脱氢酶的制备工艺选择的不合适，不仅不会促进底物的转化，反而可能会抑制转化反应进行。
[0192]
另外，实施例4在制备25-羟基胆固醇时，改变了辅因子葡萄糖的用量，实施例5在制备25-羟基胆固醇时，改变了底物胆固醇的用量，与实施例1相比，胆固醇的转化率均有所降低；实施例6在制备25-羟基维生素d3时，改变了酶转化反应条件，实施例7在制备25-羟基维生素d3时，改变了自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清和葡萄糖脱氢酶gdh的用量比例，与实施例2相比，维生素d3的转化率均有所降低。说明通过选择合适的底物、辅因子、酶转化反应条件以及酶制剂混合物中两种酶的比例，能够进一步提高底物胆固醇或者维生素d3的转化率。
[0193]
另外，实施例8选用自洽型p450酶cyp102a1-1含酶上清时胆固醇的转化率，以及实施例9选用自洽型p450酶cyp102a1-1l200r含酶上清时胆固醇的转化率均小于实施例1使用自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r含酶上清时胆固醇的转化率。实施例8与实施例9相比，实施例9使用自洽型p450酶cyp102a1-1l200r含酶上清时胆固醇的转化率高于实施例8使用自洽型p450酶cyp102a1-1含酶上清时胆固醇的转化率。由此说明，自洽型p450酶cyp102a1-1、自洽型p450酶cyp102a1-1l200r和自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r中，
自洽型p450酶cyp102a1-1l200r/l412r的酶活性最高，自洽型p450酶cyp102a1-1l200r次之。
[0194]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
[0195]
序列表
[0196]
seq id no:1来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的p450酶cyp102a1-1氨基酸序列
[0197]
mdkkvsaipqpktygplgnlplidkdkptlsfiklaeeygpifrmqtlsdtiivvsghelvaevcdetrfdksiegalakvrafagdglftsethepnwkkahnilmptfsqramkdyhammvdiavqlvqkwarlnpnenvdvpedmtrltldtiglcgfnyrfnsfyretphpfitsmtraldeamhqlqrldiedklmwrtkrqfqhdiqsmfslvdniiaerkssenqeendllsrmlnvqdpetgeklddenirfqiitfliaghettsgllsfaiyfllknpdklkkayeevdrvltdstptyqqvmklkyirmilneslrlwptapafslyakedtviggkypikkgedrisvlipqlhrdkdawgddveefqperfeeldkvphhaykpfgngqracigmqfalheatlvmgmllqhfefidyedyqldvkqtltlkpddfkirivprnqtishttvlaptdeklknreikqqvqktpsiigadnlsllvlygsdtgvaegiareladtaslegvqtevtalndrigslpkegavlivtssyngkppsnagqfvqwleelkpdelkgvqyavfgcgdhnwastyqripryideqmaqkgatrfstrgeadasgdfeeqleqwkqsmwsdamkafglelnkniekerstlslqfvsrlggsplartyeavyasilenrelqsssserstrhieislpegatykegdhlgvlpinseknvnrilkrfglngkdqvilsasgrsvnhipldspvrlydllsysvevqeaatraqiremvaftacpphkkeleslledgiyheqilkkrismldllekyeaceirferflellpalkpryysisssplvaqdrlsitvgvvnapawsgegtyegvasnylaqrhnkdeiicfirtpqsnfqlpenpetpiimvgpgtgiapfrgflqarrvqkqkgmkvgeahlyfgcrhpekdylyrtelenderdglvslhtafsrleghpktyvqhvikedrihlislldngahlyicgdgskmapdvedtlcqayqeihevseqearnwldrlqeegrygkdvwagi
[0198]
seq id no:2p450酶cyp102a1-1l200r氨基酸序列
[0199]
mdkkvsaipqpktygplgnlplidkdkptlsfiklaeeygpifrmqtlsdtiivvsghelvaevcdetrfdksiegalakvrafagdglftsethepnwkkahnilmptfsqramkdyhammvdiavqlvqkwarlnpnenvdvpedmtrltldtiglcgfnyrfnsfyretphpfitsmtraldeamhqlqrldiedkrmwrtkrqfqhdiqsmfslvdniiaerkssenqeendllsrmlnvqdpetgeklddenirfqiitfliaghettsgllsfaiyfllknpdklkkayeevdrvltdstptyqqvmklkyirmilneslrlwptapafslyakedtviggkypikkgedrisvlipqlhrdkdawgddveefqperfeeldkvphhaykpfgngqracigmqfalheatlvmgmllqhfefidyedyqldvkqtltlkpddfkirivprnqtishttvlaptdeklknreikqqvqktpsiigadnlsllvlygsdtgvaegiareladtaslegvqtevtalndrigslpkegavlivtssyngkppsnagqfvqwleelkpdelkgvqyavfgcgdhnwastyqripryideqmaqkgatrfstrgeadasgdfeeqleqwkqsmwsdamkafglelnkniekerstlslqfvsrlggsplartyeavyasilenrelqsssserstrhieislpegatykegdhlgvlpinseknvnrilkrfglngkdqvilsasgrsvnhipldspvrlydllsysvevqeaatraqiremvaftacpphkkeleslledgiyheqilkkrismldllekyeaceirferflellpalkpryysisssplvaqdrlsitvgvvnapawsgegtyegvasnylaqrhnkdeiicfirtpqsnfqlpenpetpiimvgpgtgiapfrgflqarrvqkqkgmkvgeahlyfgcrhpekdylyrtelenderdglvslhtafsrleghpktyvqhvikedrihlislldngahlyicgdgskmapdvedtlcqayqeihevseqearnwldrlqeegrygkdvwagi
[0200]
seq id no:3p450酶cyp102a1-1l412r氨基酸序列
[0201]
mdkkvsaipqpktygplgnlplidkdkptlsfiklaeeygpifrmqtlsdtiivvsghelvaevcdetrfdksiegalakvrafagdglftsethepnwkkahnilmptfsqramkdyhammvdiavqlvqkwarlnpnenvdvpedmtrltldtiglcgfnyrfnsfyretphpfitsmtraldeamhqlqrldiedklmwrtkrqfqhdiqsmfslvdniiaerkssenqeendllsrmlnvqdpetgeklddenirfqiitfliaghettsgllsfaiyfllknpdklkkayeevdrvltdstptyqqvmklkyirmilneslrlwptapafslyakedtviggkypikkgedrisvlipqlhrdkdawgddveefqperfeeldkvphhaykpfgngqracigmqfarheatlvmgmllqhfefidyedyqldvkqtltlkpddfkirivprnqtishttvlaptdeklknreikqqvqktpsiigadnlsllvlygsdtgvaegiareladtaslegvqtevtalndrigslpkegavlivtssyngkppsnagqfvqwleelkpdelkgvqyavfgcgdhnwastyqripryideqmaqkgatrfstrgeadasgdfeeqleqwkqsmwsdamkafglelnkniekerstlslqfvsrlggsplartyeavyasilenrelqsssserstrhieislpegatykegdhlgvlpinseknvnrilkrfglngkdqvilsasgrsvnhipldspvrlydllsysvevqeaatraqiremvaftacpphkkeleslledgiyheqilkkrismldllekyeaceirferflellpalkpryysisssplvaqdrlsitvgvvnapawsgegtyegvasnylaqrhnkdeiicfirtpqsnfqlpenpetpiimvgpgtgiapfrgflqarrvqkqkgmkvgeahlyfgcrhpekdylyrtelenderdglvslhtafsrleghpktyvqhvikedrihlislldngahlyicgdgskmapdvedtlcqayqeihevseqearnwldrlqeegrygkdvwagi
[0202]
seq id no:4p450酶cyp102a1-1l200r/l412r氨基酸序列
[0203]
mdkkvsaipqpktygplgnlplidkdkptlsfiklaeeygpifrmqtlsdtiivvsghelvaevcdetrfdksiegalakvrafagdglftsethepnwkkahnilmptfsqramkdyhammvdiavqlvqkwarlnpnenvdvpedmtrltldtiglcgfnyrfnsfyretphpfitsmtraldeamhqlqrldiedkrmwrtkrqfqhdiqsmfslvdniiaerkssenqeendllsrmlnvqdpetgeklddenirfqiitfliaghettsgllsfaiyfllknpdklkkayeevdrvltdstptyqqvmklkyirmilneslrlwptapafslyakedtviggkypikkgedrisvlipqlhrdkdawgddveefqperfeeldkvphhaykpfgngqracigmqfarheatlvmgmllqhfefidyedyqldvkqtltlkpddfkirivprnqtishttvlaptdeklknreikqqvqktpsiigadnlsllvlygsdtgvaegiareladtaslegvqtevtalndrigslpkegavlivtssyngkppsnagqfvqwleelkpdelkgvqyavfgcgdhnwastyqripryideqmaqkgatrfstrgeadasgdfeeqleqwkqsmwsdamkafglelnkniekerstlslqfvsrlggsplartyeavyasilenrelqsssserstrhieislpegatykegdhlgvlpinseknvnrilkrfglngkdqvilsasgrsvnhipldspvrlydllsysvevqeaatraqiremvaftacpphkkeleslledgiyheqilkkrismldllekyeaceirferflellpalkpryysisssplvaqdrlsitvgvvnapawsgegtyegvasnylaqrhnkdeiicfirtpqsnfqlpenpetpiimvgpgtgiapfrgflqarrvqkqkgmkvgeahlyfgcrhpekdylyrtelenderdglvslhtafsrleghpktyvqhvikedrihlislldngahlyicgdgskmapdvedtlcqayqeihevseqearnwldrlqeegrygkdvwagi
[0204]
seq id no:5来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的p450酶cyp102a1-1的核酸序列，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化
[0205]
atggataaaaaagtgagcgcgattccgcagccgaaaacgtatggcccgctgggcaacctgccgctgattgataaagataaaccgaccctgagctttattaaactggcggaagaatatggcccgatttttcgcatgcagaccctgagcgataccattattgtggtgagcggccatgaactggtggcggaagtgtgcgatgaaacccgctttgataaaagcattgaaggcgcgctggcgaaagtgcgcgcgtttgcgggcgatggcctgtttacgagcgaaacccatgaaccgaactggaaaaaagcccataacattctgatgccgacctttagtcagcgcgcgatgaaagattatcatgcgatgatggtggatattgcggtgcagctggtgcagaaatgggcgcgcctgaacccgaacgaaaacgtggatgtgccggaagatatgacccgcctgaccctggataccattggcctgtgcggctttaactatcgctttaacagcttttatcgcgaaaccccgcatccgtttattacgagcatgacccgcgcgctggatgaagcgatgcatcagctgcagcgcctggatattgaagataaactgatgtggcg
caccaaacgtcagtttcagcatgatattcagagcatgtttagcctggtggataacattattgcggaacgcaaaagcagcgaaaaccaagaagaaaacgatctgctgagccgcatgctgaacgtgcaagatccggaaaccggcgaaaaactggatgatgaaaacattcgctttcagattattacctttctgattgcgggccatgaaaccacgagcggcctgctgagctttgcgatttattttctgctgaaaaacccggataaactgaaaaaagcgtatgaagaagtggatcgcgtgctgaccgatagcaccccgacctatcagcaagtgatgaaactgaaatatattcgcatgattctgaacgaaagcctgcgcctgtggccgaccgcgccggcgtttagcctgtatgcgaaagaagataccgtgattggcggcaaatatccgattaaaaaaggcgaagatcgcattagcgtgctgattccgcagctgcatcgcgataaagatgcgtggggcgatgatgtggaagaatttcagccggaacgctttgaagaactggataaagtgccgcatcatgcgtataaaccgtttggcaacggtcagcgcgcgtgcattggcatgcagtttgcgctgcatgaagcgaccctggtgatgggcatgctgctgcagcattttgaatttattgattatgaagattatcagctggatgtgaaacagaccctgaccctgaaaccggatgactttaaaattcgcattgtgccgcgcaatcagaccattagccataccaccgtgctggcgccgaccgatgaaaaactgaaaaaccgcgaaattaaacagcaagtgcagaaaaccccgagcattattggcgcggataacctgagcctgctggtgctgtatggcagcgataccggcgtggcggaaggcattgcgcgcgaactggcggataccgcgagcctggaaggcgtgcagaccgaagtgaccgcgctgaacgatcgcattggcagcctgccgaaagaaggcgcggtgctgattgtgacgagcagctataacggcaaaccgccgagcaacgcgggtcagtttgtgcagtggctggaagaactgaaaccggacgaactgaaaggcgtgcagtatgcggtgtttggctgcggcgatcataactgggcgagcacctatcagcgcattccgcgctatattgatgaacagatggcgcagaaaggcgcgacccgctttagcacccgcggcgaagcggatgcgagcggcgattttgaagaacagctggaacagtggaaacagagcatgtggagcgatgcgatgaaagcgtttggcctggaactgaacaaaaacattgaaaaagaacgcagcacgctgagtctgcagtttgtgagccgcctgggcggcagcccattagcgcgcacctatgaagcggtgtatgcgagcattctggaaaaccgcgaactgcagagcagtagcagcgaacgcagcacccgccatattgaaattagcctgccggaaggcgcgacctataaagaaggcgatcatctgggcgtgctgccgattaacagcgaaaaaaacgtgaaccgcattctgaaacgctttggcctgaacggcaaagatcaagtgattctgagcgcgagcggccgcagcgtgaaccatattccgctggatagcccggtgcgcctgtatgatttattaagctatagcgtggaagtgcaagaagcggcgacccgcgcgcagattcgcgaaatggtggcgtttaccgcgtgcccgccgcataaaaaagaactggaaagcctgctggaagatggcatttatcatgaacagattctgaaaaaacgcattagcatgctggatctgctggaaaaatatgaagcgtgcgaaattcgctttgaacgctttctggaactgctgccggcgctgaaaccgcgctattatagcattagcagtagcccgttagtggcgcaagatcgcctgagcattaccgtgggcgtggtgaacgcgccggcgtggagcggcgaaggcacctacgaaggtgtggcgagcaactatctggcgcagcgccataacaaagatgaaattatttgctttattcgcaccccgcagagcaactttcagctgccggaaaacccggaaaccccgattattatggtgggcccgggcaccggcattgcgccgtttcgcggctttctgcaagcgcgccgcgtgcagaaacagaaaggcatgaaagtgggcgaagcccatctgtattttggctgccgccatccggaaaaagattatctgtatcgcacggagctggaaaacgatgaacgcgatggcctggtgagcctgcataccgcgtttagccgcctggaaggccatccgaaaacctatgtgcagcatgtgattaaagaagaccgtattcatctgattagcctgctggataacggcgcgcatctgtatatttgcggcgatggcagcaaaatggcgccggatgtggaagataccctgtgccaagcgtatcaagaaattcatgaagtgagcgaacaagaagcgcgcaactggctggatcgcctgcaagaagaaggccgctatggcaaagatgtgtgggcgggcatttaa

技术特征：
1.一种酶制剂混合物，其特征在于，所述酶制剂混合物包含自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶；其中，所述自洽型p450酶为(a)-(e)中任意一项所述的酶：(a)具有如seq id no：2或seq id no：3所示氨基酸序列的酶；(b)seq id no：2或seq id no：3所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸残基且仍具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；(c)与seq id no：2或seq id no：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。2.根据权利要求1所述的混合物，其特征在于，所述自洽型p450酶为与seq id no：2或seq id no：3所示的氨基酸序列具有90％以上，优选99％以上同源性，且具有自洽型p450酶活性的氨基酸序列所示的酶；优选地，所述自洽型p450酶为具有如seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4所示氨基酸序列的酶，更优选为具有如seq id no：4所示氨基酸序列的酶；优选地，所述自洽型p450酶来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；优选地，所述自洽型p450酶和所述葡萄糖脱氢酶的体积比为(3-5)：1。3.一种酶制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌或含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌的种子进行发酵培养，待得到的发酵液的od
600
值为10-15时，将发酵液与诱导剂混合进行诱导培养，得到含菌发酵液；其中，所述诱导剂为5-氨基乙酰丙酸盐酸盐和异丙基硫代半乳糖苷；(2)将所述含菌发酵液进行固液分离，得到菌体，并对菌体进行破壁，得到破壁液；(3)将所述破壁液进行分离，得到自洽型p450酶或葡萄糖脱氢酶；(4)将各自得到的自洽型p450酶和葡萄糖脱氢酶进行混合；优选地，所述自洽型p450酶的编码基因具有编码具有seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列，更优选为具有编码具有seq id no：4所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养在发酵培养基中进行，以所述发酵培养基的总体积为100ml计，所述发酵培养基包括：葡萄糖2-3g、蛋白胨0.5-1g、酵母膏0.5-1g、磷酸二氢钾0.2-0.5g、氯化铵0.5-1g、七水硫酸镁0.05-0.1g、四水氯化锰0.005-0.01g、无水氯化铁0.005-0.01g；优选地，所述发酵培养和所述诱导培养各自的通风比独立地为0.8-1vvm，各自的do值独立地为30％以上；优选地，所述发酵培养的温度为35-37℃；优选地，所述诱导培养的温度为22-25℃；优选地，所述发酵培养和所述诱导培养各自的ph值独立地为6.5-7；
优选地，所述发酵培养和所述诱导培养的总时间为22-26h；优选地，以所述发酵液的总体积为1l计，5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的用量为100-200mg，异丙基硫代半乳糖苷的用量为0.1-0.15mmol。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：步骤(1)中，所述发酵培养进行4-6h时，在所述发酵液中连续补入补料培养基；优选地，以所述补料培养基的总体积为100ml计，所述补料培养基包括：葡萄糖40-60g和七水硫酸镁0.5-1g；优选地，所述补料培养基的补入速度为5-10ml/l/h。6.根据权利要求3-5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌和所述含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌的宿主细胞各自独立地选自大肠杆菌或放线菌。7.根据权利要求3-6中任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子的制备方法包括：将所述含有自洽型p450酶的编码基因的基因工程菌或所述含有葡萄糖脱氢酶的编码基因的基因工程菌在种子培养基中进行培养，所述培养的温度为30-35℃，时间为3-5h，得到所述种子。8.根据权利要求3-7中任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述破壁的方法包括：用ph值为7.2-7.5的磷酸盐缓冲液将所述菌体进行悬浮，得到悬浮液，再将所述悬浮液进行破壁，得到所述破壁液。9.根据权利要求3-8中任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述分离的方法包括：将所述破壁液与浓度为10-15wt％的聚乙烯亚胺溶液混合进行絮凝沉淀，然后进行第二离心并收集上清，得到所述自洽型p450酶或所述葡萄糖脱氢酶。10.一种权利要求3-9中任意一项所述的制备方法制得的酶制剂混合物。11.一种25-羟基胆固醇或25-羟基维生素d3的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将酶制剂混合物、助溶剂、辅因子、底物和溶剂进行混合，得到混合液，然后进行转化反应，得到所述25-羟基胆固醇或所述25-羟基维生素d3；其中，所述底物为胆固醇或维生素d3，所述酶制剂混合物为权利要求1、2和10中任意一项所述的酶制剂混合物；优选地，所述酶转化反应的温度为25-35℃，时间为2-5h。12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述辅因子为葡萄糖；优选地，所述助溶剂为环糊精；优选地，所述溶剂选自无水乙醇、乙酸乙酯和乙醚中的至少一种；优选地，以所述混合液的总体积为100ml计，所述底物的用量为0.1-0.5g，所述助溶剂的用量为10-15g，所述辅因子的用量为2-5g。

技术总结
本发明涉及酶催化领域，公开了酶制剂混合物及其制备方法和25-羟基胆固醇或25-羟基维生素D3的制备方法。所述酶制剂混合物包含自洽型P450酶和葡萄糖脱氢酶。利用包括自洽型P450酶和葡萄糖脱氢酶的酶制剂混合物联合催化底物胆固醇或者维生素D3生成25-羟基胆固醇或者25-羟基维生素D3。与只用P450单酶法相比，可以用较廉价的葡萄糖作为辅因子，且底物转化率较高，副产物少，有利于后续提取工艺。有利于后续提取工艺。有利于后续提取工艺。


技术研发人员：司玉贵 路飞 冀勇良 陈玲 王凌旭
受保护的技术使用者：江西天新药业股份有限公司
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/9/23