用于快速检测5种人冠状病毒的引物探针组合、缓冲剂液及试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种用于快速检测5种人冠状病毒的引物探针组合、缓冲剂液及试剂盒。


背景技术：

2.截至当前，共发现7种可感染人类的冠状病毒，分别是hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。这些冠状病毒的致病力、传染性、流行情况不尽相同。
3.hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1从首次发现到现在，一直散发或局部流行，主要引起轻度或中度的上呼吸道疾病，症状主要包括流鼻涕、头痛、咳嗽、咽喉痛、发热等，有时会引起肺炎或支气管炎等下呼吸道疾病，心肺疾病患者、免疫力低下人群、婴儿和老年人中较为常见，在呼吸道感染占比中位居第二。
4.sars-cov可引起严重急性呼吸综合征，症状较为严重，病死率超过10％，其危害性很大，但自2003年中期疫情逐渐消灭后，至今未再出现。
5.mers-cov引起中东呼吸综合征。临床可表现为无症状或轻度呼吸道症状，也可发展为严重的急性呼吸道症状甚至死亡，病死率曾超过30％，我国通报过1例输入性中东呼吸综合征确诊病例外，至今也未再发现。
6.sars-cov-2全球持续大流行，造成极大的危害，虽然当前疫情正逐渐消退，但仍有散发或局部流行，是否与人类长期共存还有待继续研究。
7.随着各种可感染人类的冠状病毒的发现，国内的技术团队先后开发了一些检测试剂盒，主要如下：
8.专利“一种实时荧光rt pcr检测冠状病毒的试剂盒(申请号：cn201310392720.2)”，采用1套引物、探针基于实时荧光rt pcr技术检测人冠状病毒，其检测灵敏度为1000copies/ml，但是未明确检测哪些人冠状病毒，其耗时不详。
9.专利“一种用于检测冠状病毒的试剂盒及其应用(申请号：cn201510479272.9)”，用2套引物、探针基于nasba扩增技术检测人冠状病毒，其中引物对1用于扩增冠状病毒hku1/oc43，引物对2用于扩增冠状病毒229e/nl63，其检测灵敏度不详，耗时约1小时。
10.专利“同时检测包括2019-ncov在内的四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒(申请号：cn202010083161.7)”，用4套引物、探针基于实时荧光rt pcr/qrt pcr技术分别检测sars-cov-2、mers cov、hcov-oc43、hcov-hku1，其检测灵敏度与耗时均不详。
11.鉴于当前只流行hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov-2这5种人冠状病毒，且暂无核酸提取加核酸扩增的全程时间短至30分钟以内的检测试剂，故研发可同时快速检测5种人冠状病毒的试剂盒具有良好的社会、经济效益。


技术实现要素：

12.本发明实施例提供一种用于快速检测5种人冠状病毒引物探针组合，旨在解决目前人冠状病毒试剂盒检测种类不全及时间过长等问题。
13.本发明实施例是这样实现的，用于快速检测5种人冠状病毒引物探针组合，包括四组引物探针组合，其中，
14.第一组为检测hcov-229e、hcov-nl63的引物探针组合，包括如seq id no.:1所示的正向引物；如seq id no.:2所示的反向引物；和如seq id no.:3所示的探针；
15.第二组为检测hcov-oc43、hcov-hku1的引物探针组合，包括如seq id no.:4所示的正向引物；如seq id no.:5所示的反向引物；和如seq id no.:6所示的探针；
16.第三组为检测sars-cov-2的引物探针组合，包括如seq id no.:7所示的正向引物；如seq id no.:8所示的反向引物；和如seq id no.:9所示的探针；
17.第四组为检测人源性内标的引物探针组合，包括如seq id no.:10所示的正向引物；如seq id no.:11所示的反向引物；和如seq id no.:12所示的探针。
18.更进一步地，所述5种人冠状病毒为hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov-2。
19.更进一步地，探针标记包括fam、vic、hex、joe、rox、cy5、cy5.5。探针的淬灭基团选择本领域常用的。
20.本发明实施例还提供一种用于快速检测5种人冠状病毒的缓冲液，配方如下：
[0021][0022]
本发明实施例还提供一种用于快速检测5种人冠状病毒的试剂盒，包括上述引物探针组合。
[0023]
更进一步地，所述试剂盒还包括上述缓冲液。
[0024]
更进一步地，所述试剂盒地pcr扩增试剂的配方如下：
[0025][0026]
更进一步地，所述试剂盒的pcr反应体系包括pcr扩增试剂10μl和rna模板15μl。
[0027]
更进一步地，荧光pcr扩增反应程序为：55℃2min；95℃2sec；95℃1sec、55℃10sec，40个循环。
[0028]
本发明实施例还提供上述引物探针组合的用途，用于制备检测人冠状病毒的试剂盒。
[0029]
本发明实施例还提供上述缓冲液的用途，用于制备检测人冠状病毒的试剂盒。
[0030]
相较于单重rt pcr、融解曲线多重rt pcr及基因测序等核酸检测技术，本发明具有以下优势：
[0031]
(1)功能方面，不仅能一管同时快速检测当前流行或散发的hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov-2这5种人冠状病毒，而且还可监测样本采集、核酸提取、pcr扩增等全过程的质量，符合当前社会需求与要求；
[0032]
(2)性价比方面，一管可同时检测5种人冠状病毒，检测灵敏度可达1000copies/ml，无需特殊场所、设备及专业人才，操作简单、技术成熟、成本可低至10元或以下；
[0033]
(3)时效性方面：从上机至报告，全程仅需28分钟，能为建立15分钟步行圈的新型医防融合体系提供快速响应条件；
[0034]
(4)适用场景方面：可单人份独立检测或多人份批量检测，可随到随检，既适于社
区检验，又适于医院检验。
具体实施方式
[0035]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036]
本发明的检测人冠状病毒的试剂盒采用hcov-229e/hcov-nl63、hcov-oc43/hcov-hku1、sars-cov-2这些人冠状病毒引物及taqman-mgb探针，结合人源性内标引物及taqman-mgb探针，基于快速逆转录酶、快速dna聚合酶的pcr体系，在快速4色及以上的荧光pcr仪上同时检测5种人冠状病毒并可监测样本采集、核酸提取、pcr试剂的质量。
[0037]
实施例一
[0038]
引物及探针的设计
[0039]
本发明依托深圳市中西医结合医院检验科平台优势，收集了大量的人冠状病毒阳性灭活样本，并进行测序分析，获取了这5种在我国流行的人冠状病毒核酸序列的大量信息，经生物信息学分析后，找到了适于我国流行株检测的引物、探针区域的序列，确保了检测试剂的特异性及灵敏度，从而提高检测准确性。
[0040]
本发明的4套引物、探针是从十多套引物、探针中优选出来，通过较多阳性样本实验验证，除了检测灵敏度最高、特异性最好外，相互间的干扰影响最小，还能最大限度地均相扩增5种人新冠病毒，即用4重体系与各单重体系扩增某种人冠状病毒同浓度阳性样本时，其ct值相差小于0.5～1.5循环，用4重体系扩增同浓度的单阳性样本或多重阳性样本时，其ct值相差也小于0.5～1.5循环。
[0041]
本发明检测5种人冠状病毒及人源性内标的引物探针组合，具体包括：
[0042]
第一组为检测hcov-229e、hcov-nl63的引物探针组合，用于检测hcov-229e、hcov-nl63两种人冠状病毒，引物、探针具体序列为：
[0043]
229e/nl63-fwd：5'gctaagcatgatttctttacttgg 3'(如seq id no.:1所示)
[0044]
229e/nl63-rwd：5'ttcatcaaagttacgcagagc 3'(如seq id no.:2所示)
[0045]
229e/nl63-p：5'fam-catttatggtaatgttagtagac-mgb 3'，(如seq id no.:3所示)，不限于fam标记，可以是vic、hex、joe、rox、cy5、cy5.5等。
[0046]
第二组为检测hcov-oc43、hcov-hku1的引物探针组合，用于检测hcov-oc43、hcov-hku1两种人冠状病毒，引物、探针具体序列为：
[0047]
oc43/hku1-fwd：5'gttaaacctggtgaracttttactg 3'，如seq id no.:4所示；
[0048]
oc43/hku1-rwd：5'tacataaccaacagatccaca 3'，如seq id no.:5所示；
[0049]
oc43/hku1-p：5'vic-actatgcgtagtagttatac-mgb 3'，如seq id no.:6所示，不限于vic标记，可以是fam、hex、joe、rox、cy5、cy5.5等染料。
[0050]
第三组为检测sars-cov-2的引物探针组合，用于检测新型人冠状病毒，引物、探针具体序列为：
[0051]
cov-2-fwd：5'aattctatggtggttggcaca 3'，如seq id no.:7所示；
[0052]
cov-2-rwd：5'agtgaggccataattctaagca 3'，如seq id no.:8所示；
[0053]
cov-2-p：5'rox-cctcaccttatgggttggg-mgb 3'，如seq id no.:9所示；不限于rox
标记，可以是fam、vic、hex、joe、cy5、cy5.5等染料。
[0054]
第四组为检测人源性内标的引物探针组合，用于监测样本采集及核酸提取的质量，引物、探针具体序列为：
[0055]
human-fwd：5'gattgctcctgtctatactcttcc 3'，如seq id no.:10所示；
[0056]
human-rwd：5'gtgccaaattctgttatgacga 3'，如seq id no.:11所示；
[0057]
human-p：5'cy5-tccttcaggttcatccgca-mgb 3'，如seq id no.:12所示；不限于cy5标记，可以是fam、vic、hex、joe、rox、cy5.5等染料。
[0058]
引物、探针设计是决定检测试剂准确性的关键因素。其中，引物、探针区域核酸序列的唯一性(序列仅存在于被测病原体基因组中，别的病原体不能含有该序列，否则会出现交叉反应)决定检测方法的特异性，而保守性(序列内不能存在突变、插入、缺失等现象，所有被测病原体流行株该区域均是同一序列，否则会出现灵敏度下降)决定检测方法的灵敏度。事实上，所有病原体都在进化或变异进行中，造成不同国家或地区和/或不同时期的流行株核酸序列不完全相同，尤其在rna病毒中更甚，给核酸检测试剂的引物、探针设计带来很大的困难，这也是不同厂家研发的核酸检测试剂准确性不一致的主要原因。
[0059]
截至目前，已发现感染人的人冠状病毒有7种，当前在我国流行的有5种，作为rna病毒且流行了很长一段时期，每种人冠状病毒之间的核酸序列差异很大，即使同一种人冠状病毒不同流行株间也存在大量的变异位点，这给引物、探针设计带来巨大挑战，已经无法找到一段序列可适于检测全球所有流行株，如果基于美国ncbi网站既往公布的核酸序列设计相应的引物、探针来检测我国的流行株，必将造成准确性的下降。
[0060]
实施例二
[0061]
缓冲液的筛选
[0062]
为了解决传统pcr候检时间过长的问题，本发明的pcr体系中采用了特殊的5
×
pcr buffer，该缓冲液除了提供逆转录酶、dna聚合酶最适的离子强度、ph值及酶稳定剂外，还可大幅降低体系的粘度，使pcr反应体系中各组份能在温度的加特下快速运动、碰撞，实现引物、探针与模板极速杂交及快速延伸，从而大幅缩短检测时间。比如，逆转录时间在短至2分钟与传统的15至30分钟等效，扩增40个循环短至25分钟与传统的75至100分钟等效。
[0063]
本实施例的5
×
pcr缓冲液的配方如下：
[0064][0065]
本实施例所配制的pcr体系缓冲液在20℃时粘度可以低至0.2mpa.s，是水的五分之一，是传统pcr体系的十分之一。
[0066]
采用实施例一的引物探针组合及实施例二的缓冲液的试剂盒，基于快速4色荧光
定量pcr仪及其配套的膜式反应管方可实现28分钟完成检测，如果基于普通荧光定量pcr平台及8联管，则总检测时间为48分钟。如果采用实施例一的引物探针组合及传统的缓冲剂，基于快速4色荧光定量pcr仪需要至少1.5小时。
[0067]
实施例三
[0068]
用于快速检测5种人冠状病毒的试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：
[0069]
1、材料和试剂
[0070]
(1)特异性引物探针：委托生物技术公司合成与标记实施例一的特异性引物及探针；
[0071]
(2)pcr缓冲液：自配实施例二的5
×
pcr buffer；
[0072]
(3)扩增酶混合物：one step u+enzyme mix；
[0073]
(4)epc处理水：自制；
[0074]
(5)人冠状病毒阳性样本：hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov-2阳性样本来自本院患者靶向测序检测后的剩余标本，每种8份，共40份；
[0075]
(6)其他病原体阳性样本：甲型流感病毒(flu a)、乙型流感病毒(flu b)、副流感病毒(piv)、合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、鼻病毒(hrv)阳性样本来自本院患者靶向测序检测后的剩余标本，每种5份，共30份。
[0076]
(7)阴性样本(neg)：8份阴性样本采自健康志愿者；
[0077]
(8)快速荧光定量pcr仪(4色4模块)：购自杭州默礼生物公司。
[0078]
2、检测方法步骤
[0079]
(1)模板制备
[0080]
用手工或自动化核酸提取仪提取咽拭子、痰液、肺泡灌洗液样本中病毒rna备用。
[0081]
(2)pcr扩增试剂配制
[0082]
表1 pcr扩增试剂配制
[0083]
组分终浓度5
×
pcrbuffer1
×
onestepu+enzymemix1
×
229e/nl63-fwd0.36μm229e/nl63-rwd0.36μm229e/nl63-p0.06μmoc43/hku1-fwd0.36μmoc43/hku1-rwd0.36μmoc43/hku1-p0.06μmcov-2-fwd0.36μmcov-2-rwd0.36μmcov-2-p：0.06μmhuman-fwd0.2μmhuman-rwd0.2μmhuman-p0.05μmdepc处理水to10μl
[0084]
(3)荧光pcr扩增
[0085]
①
pcr反应体系构建(25μl)：pcr扩增试剂10μl+rna模板15μl。
[0086]
②
反应程序：55℃2min；95℃2sec；95℃1sec、55℃10sec，40个循环(55℃时采集荧光信号)。
[0087]
(4)结果判断
[0088]
①
质控标准
[0089]
cy5荧光通道有s型扩增曲线，且cy5荧光通道的ct值≤32；否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。
[0090]
②
ct值和阴、阳性关系结果判定实验有效的前提下，阴、阳性结果判断如表2：
[0091]
表2 ct值和阴、阳性关系的结果
[0092][0093]
实施例四
[0094]
最低检出限测试实验
[0095]
1、实施方法与结果
[0096]
将高浓度阳性模板经数字pcr定值后，分别稀释成4.0
×
103copies/ml、2.0
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml、5.0
×
102copies/ml的梯度模板，按照实施例三的检测方法，进行扩增检测，每个浓度递度重复5次，以5次检测全部为阳性的最低浓度为最低检出限，结果如下表3：
[0097]
表3最低检出限测试结果表
[0098][0099][0100]
2、结论
[0101]
当病毒浓度为1.0
×
103copies/ml时，5种人新冠病毒模板5次重复实验全部可检出阳性，表明本发明的试剂的最低检出限为1000copies/ml。
[0102]
实施例五
[0103]
阳性符合率测试实验
[0104]
1、实施方法与结果
[0105]
将提取的5种人冠状病毒阳性模板共40例按照实施例三的检测方法，进行扩增检测，计算阳性符合率，结果如下表4：
[0106]
表4阳性符合率
[0107][0108][0109]
2、结论经验证，本发明与靶向测序法的阳性符合率为100％(40/40)。
[0110]
实施例六
[0111]
阴性符合率测试实验
[0112]
1、实施方法与结果
[0113]
将提取的6种其他病毒阳性样本模板与正常健康人样本模板共38例按照实施例三的检测方法，进行扩增检测，计算阴性符合率，结果如下表5：
[0114]
表5阴性符合率
[0115][0116]
2、结论
[0117]
经验证，本发明与靶向测序法的阴性符合率为97.4％(37/38)。
[0118]
由此可见，本发明可以快速同时甄别五种人冠状病毒hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov-2；还可监测样本采集、核酸提取、pcr扩增等全过程的质量，检测灵敏度可达1000copies/ml，成本可低至10元以下；从上机至报告，全程仅需28分钟；可单人份独立检测或多人份批量检测，可随到随检，既适于社区检验，又适于医院检验。
[0119]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于快速检测5种人冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，包括四组引物探针组合，其中，第一组为检测hcov-229e、hcov-nl63的引物探针组合，包括如seq id no.:1所示的正向引物；如seq id no.:2所示的反向引物；和如seq id no.:3所示的探针；第二组为检测hcov-oc43、hcov-hku1的引物探针组合，包括如seq id no.:4所示的正向引物；如seq id no.:5所示的反向引物；和如seq id no.:6所示的探针；第三组为检测sars-cov-2的引物探针组合，包括如seq id no.:7所示的正向引物；如seq id no.:8所示的反向引物；和如seq id no.:9所示的探针；第四组为检测人源性内标的引物探针组合，包括如seq id no.:10所示的正向引物；如seq id no.:11所示的反向引物；和如seq id no.:12所示的探针。2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述5种人冠状病毒为hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov-2。3.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针标记包括fam、vic、hex、joe、rox、cy5、cy5.5。4.一种用于快速检测5种人冠状病毒的缓冲液，其特征在于，配方如下：聚氧乙烯40氢化蓖麻油1.0-2.0％。5.一种用于快速检测5种人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括如权利要求4所述缓冲液。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的pcr扩增试剂的配方如下：
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的pcr反应体系包括pcr扩增试剂10μl和rna模板15μl。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，荧光pcr扩增反应程序为：55℃2min；95℃2sec；95℃1sec、55℃10sec，40个循环。10.权利要求1所述的引物探针组合的用途，其特征在于，用于制备检测人冠状病毒的试剂盒。

技术总结
本发明适用于生物医药领域，提供一种用于快速检测5种人冠状病毒的引物探针组合、缓冲剂液及试剂盒。引物如SEQ ID NO.:1、2、4、5、7、8、10、11所示，探针序列如SEQ ID NO.:3、6、9、12所示。本发明的试剂盒选择特异性引物探针，同时采用特殊的5


技术研发人员：刘和录 朱美玲 黄旋妹 赵丽君 江勇 劳梓钊 周紫娟
受保护的技术使用者：深圳市中西医结合医院
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/9/23