一种嵌合抗原受体及其应用的制作方法

1.本发明的领域总体上涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和药学领域。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤(multiple myeloma，以下简称mm)是一种浆细胞异常增生的恶性肿瘤，其特征为骨髓浆细胞异常增生和单克隆免疫球蛋白(igg,iga,igd或ige)或其κ或γ轻链(统称为m蛋白)的过度增生(极少数患者不产生m蛋白)。mm起病徐缓，可有数月至十多年无症状期，早期易被误诊。mm的临床表现主要由骨髓瘤细胞浸润和m蛋白大量分泌引起，其症状表现为骨痛、贫血、肾功能不全、感染、出血、神经症状、高钙血症、淀粉样病变等。mm是第二常见的恶性血液肿瘤，其发病率约占血液恶性肿瘤的10％，每10万人中2-3例，男女比例为1.6：1，大多数患者年龄》40岁。尽管近年来mm治疗领域迅速发展，并取得了许多新进展，患者的5年生存期已超过50％，但mm仍然不可治愈，大多数患者最终会发生复发，所以治疗mm的原则主要是消除或减轻瘤细胞增生引起的各种临床表现。
3.传统mm患者的治疗主要以联合化疗和干细胞移植为主。近年来随着研究者对mm的深入认识以及mm治疗手段的不断进步，细胞免疫治疗逐渐成为除了放化疗和干细胞移植以外的较为安全有效的治疗多发性骨髓瘤的方法。在此基础上发展起来的car-t细胞免疫治疗在血液肿瘤治疗方面不断取得令人欣喜的成果，成为血液肿瘤治疗的新宠。
4.嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)t细胞疗法是近年来发展十分迅速的新一代肿瘤免疫治疗技术。car的结构主要由特异性识别肿瘤相关抗原((tumor associated antigen,taa)的单链可变区结构域(single chain variable fragment,scfv)、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区四个部分构成。scfv的形式一般为单克隆抗体的重链可变区(vh)与轻链可变区(vl)通过多肽接头连接起来构成的抗原结合区，即vh-linker-vl或vl-linker-vh；铰链区通常由免疫球蛋白超家族组成，如igg4、cd8、igg1等；跨膜区一般由cd8、cd28或cd4等组成；胞内信号传导区主要由cd3ζ链和协同共刺激信号分子41bb、cd28、icos、ox40等组成。因此表达car的t细胞不需要通过抗原递呈机制，可直接识别taa，具有mhc(major histocompatibility complex)非依赖性的独特优势。
5.尽管以bcma为靶点car-t细胞治疗复发难治型mm初期效果优异，临床缓解率高达81％-97％，但其中45％复发。bcma car-t治疗后进展的mm，4％-33％出现bcma表达下调或缺失。此外，由于car-t细胞的大多数靶抗原并不完全具有肿瘤特异性，非肿瘤组织表达也可能表达这些抗原，患者可能出现非肿瘤靶向毒性；如果用于靶向免疫效应细胞的受体结构与非恶性组织表达的其他抗原发生交叉反应，则可能发生脱靶毒性。而脱靶毒性即使在抗体耐受较好的靶标中也可能是致命的，正如her2靶向的car的情况(morgan等，molecular therapy：the journal of the american society of gene therapy 18，843-851(2010))。因此，需要新的治疗策略以设计靶向在mm细胞中高度表达而在正常组织中限制性表达的抗原的car来治疗多发性骨髓瘤，该策略能够以最小的毒性和免疫原性诱导有效的肿瘤根除。


技术实现要素：

6.在一方面，本文提供了嵌合抗原受体(car)，其胞外抗原结合结构域包括一个或更多个靶向fcrh5的抗体分子或其抗原结合片段，所述抗体分子的重链可变区(vh)的hcdr1、hcdr2、hcdr3和轻链可变区(vl)的lcdr1、lcdr2和lcdr3选自如下组合之一：
7.1)hcdr1的序列如seq id no：10所示；
8.hcdr2的序列如seq id no：11所示；
9.hcdr3的序列如seq id no：12所示；
10.lcdr1的序列如seq id no：7所示；
11.lcdr2的序列如seq id no：8所示；
12.lcdr3的序列如seq id no：9所示；
13.2)hcdr1的序列如seq id no：20所示；
14.hcdr2的序列如seq id no：21所示；
15.hcdr3的序列如seq id no：22所示；
16.lcdr1的序列如seq id no：17所示；
17.lcdr2的序列如seq id no：18所示；
18.lcdr3的序列如seq id no：19所示；以及
19.3)hcdr1的序列如seq id no：30所示；
20.hcdr2的序列如seq id no：31所示；
21.hcdr3的序列如seq id no：32所示；
22.lcdr1的序列如seq id no：27所示；
23.lcdr2的序列如seq id no：28所示；
24.lcdr3的序列如seq id no：29所示。
25.在一些实施方案中，1)所述重链可变区包括seq id no：6所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包括与seq id no：6所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区包括seq id no：4所示氨基酸序列，或者所述轻链可变区包括与seq id no：4所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氨基酸序列；2)所述重链可变区包括seq id no：16所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包括与seq id no：16所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区包括seq id no：14所示氨基酸序列，或者所述轻链可变区包括与seq id no：14所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氨基酸序列；或者3)所述重链可变区包括seq id no：26所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包括与seq id no：26所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区包括seq id no：24所示氨基酸序列，或者所述轻链可变区包括与seq id no：24所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氨基酸序列。
26.在一些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域为单链抗体(scfv)形式，优选地，所述单链抗体中采用seq id no：34所示氨基酸序列的连接肽。
27.在一些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包括串联连接的两个或更多个所述
抗体分子或其抗原结合片段。
28.在一些实施方案中，所述car从n端到c端依次包括所述胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、以及胞内共刺激结构域和信号传导结构域；优选地，所述铰链区来自igg4、igg1、igd或cd8，更优选seq id no：36所示氨基酸序列；优选地，所述跨膜结构域来自cd8、cd28或cd24，更优选seq id no：38所示氨基酸序列；优选地，所述共刺激结构域来自cd27、cd28或41bb，更优选seq id no:40或42所示氨基酸序列；优选地，所述信号传导结构域来自cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、fcrγ(fcer1g)、fcrβ(fc epsilon r1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10或dap12，更优选seq id no:44所示氨基酸序列。
29.在一些实施方案中，所述car在n末端还包括前导序列；优选地，所述前导序列包括seq id no：2所示氨基酸序列。
30.另一方面，本文提供了核酸分子，其包括上述car的编码核苷酸序列；优选地，所述核酸分子还包括sirt1和/或cd258的编码核苷酸序列；优选地，所述car的编码核苷酸序列与所述sirt1和/或cd258的编码核苷酸序列之间通过自剪切肽编码序列或ires序列连接；优选地，所述sirt1和cd258的氨基酸序列分别如seq id no：51和53所示。
31.另一方面，本文提供了宿主细胞，其表达上述car、包括上述核酸分子或包括携带上述核酸分子的表达载体；优选地，所述细胞为t细胞或nk细胞。
32.在一些实施方案中，所述细胞经修饰以表达或过表达sirt1和/或cd258；优选地，所述sirt1和cd258的氨基酸序列分别如seq id no：51和53所示。
33.另一方面，本文提供了上述car、核酸分子、或细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
34.在一些实施方案中，所述肿瘤表达fcrh5，或者所述肿瘤表达fcrh5且不表达fcrh3。
35.在一些实施方案中，所述肿瘤为多发性骨髓瘤。
36.另一方面，本文提供了药物组合物，其包括：
37.1)上述car、核酸分子或细胞；以及
38.2)药学上可接受的载体。
39.另一方面，本文提供了降低car-t细胞非特异性杀伤的方法，包括让所述car-t细胞表达或过表达sirt1和/或cd258。
附图说明
40.图1为t细胞及car-t细胞体外扩增结果图。
41.图2为car-t细胞car蛋白的表达检测结果图。
42.图3为car-t细胞分群检测结果图。
43.图4为t细胞及car-t细胞对293t-fcrh3细胞杀伤的效果图。(a)显微照片显示杀伤效果；(b)杀伤结果统计。
44.图5为t细胞及car-t细胞对293t-fcrh5细胞杀伤的结果图。
具体实施方式
45.除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常
理解的含义。
46.术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
47.术语“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。当使用“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及某组合或组合物“包括a和b”时，也旨在涵盖由a和b组成的组合或组合物。
48.在提及具体数值时，除非上下文另有说明或暗示，通常可认为同时提及所列数值的
±
10％范围内的任何数值。
49.fcrh5(fc receptor-like protein 5，又称为fcrl5、ifgp5、bxmas1、cd307和irta2)，属于免疫球蛋白超家族(ig sf)的6个基因家族中的一员。研究表明，fcrh5不仅在mm患者的恶性浆细胞中持续表达，还在抗原诱导的b细胞发育过程中参与了促进增殖和下游同型表达。
50.sirtuins是一类依赖于nad+和核心区域高度保守的蛋白去乙酰化酶和adp核糖基转移酶，在组蛋白的乙酰化/去乙酰化基因表达调控中起重要作用。哺乳动物中主要有七种sirtuins蛋白亚型，即sirt1-7。sirt1是酵母sir2基因的同源基因，也是目前研究最多的；sirt1定位于细胞核，主要调节转录、末端着丝粒染色质结构、衰老以及代谢等生物学过程。此外，sirt1在胞浆和线粒体中也存在。s1a为sirt1的功能突变体，由小分子sirtuin激活剂结合区(small molecule sirtuin-activating compounds binding domain，sbd，原始序列第183-229位)和去乙酰化酶区(deacetylase domain，原始序列第229-516位)组成。本文实施例中s1a序列如seq id no：51所示。
51.cd258又名肿瘤坏死因子超家族成员14(tumor necrosisfactor superfamily member 14，tnfsf14)、t细胞上可诱导表达的、与单纯疱疹病毒糖蛋白竞争结合单纯疱疹病毒侵入介体的淋巴毒素同源类似物[homologous to lymphotoxin，inducible expression，competes with herpes simplex virus(hsv)glycoprotein d for hsv entry mediator(hvem)，a receptor expressed on t lymphocytes，light]或hvem配体(herpesvirusentry mediator-ligand，hvem-l)。cd258主要表达在活化的t细胞、b细胞、自然杀伤(natural killer，nk)细胞、未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells，im dc)和单核细胞表面，有3种存在形式：全长型包含240个氨基酸残基、相对分子质量29ku的2型跨膜糖蛋白；由204个氨基酸残基组成、缺少跨膜区并仅激活t淋巴细胞的非糖基化蛋白及细胞表面金属酶剪切作用下可溶性的cd258蛋白。cd258介导的信号通路与炎症性及自身免疫性疾病的发生发展、移植物抗宿主病、病原体感染以及肿瘤的免疫调节有密切关系。c8a为膜结合型cd258，cd258蛋白水解位点第81-84位的eqli完全缺失，通过对该蛋白水解位点进行置换突变或缺失，使该蛋白始终以膜结合形式表达在细胞膜上，减少分泌形式的表达。本文实施例中c8a序列如seq id no：52所示。
[0052]“抗体”指由浆细胞(效应b细胞)分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。经典抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分
为位于氨基端的可变区(v)和位于羧基端的恒定区(c)。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(fv)。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(框架区，fr)更易变化，称为高变区(hvr)，高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining region,cdr)。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为hcdr1、hcdr2、hcdr3和lcdr1、lcdr2、lcdr3。
[0053]
抗体分子的“抗原结合片段”指抗体分子中参与抗原特异性结合的氨基酸片段，例如，fab、fab’和(fab’)2等。具有抗原结合能力的单链抗体和单域抗体为单肽链抗体分子，可视为经典抗体分子的“抗原结合片段”。
[0054]
单链抗体(single chain fragment variable,scfv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成fv段，因而scfv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
[0055]
嵌合抗原受体(car)，也称为嵌合t细胞受体、嵌合免疫受体，为一种工程化的蛋白受体分子，其可将期望的特异性赋予免疫效应细胞，例如与特定肿瘤抗原结合的能力。嵌合抗原受体通常由胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域构成。多数情况下，抗原结合结构域为一段scfv序列，负责识别和结合特定的抗原。胞内信号结构域通常包括免疫受体酪氨酸活化基序(itam)，例如来源于cd3ζ分子的信号传导结构域，负责激活免疫效应细胞，产生杀伤作用。另外，嵌合抗原受体还可在氨基端包括负责新生蛋白在细胞内定位的信号肽，以及在抗原结合结构域和跨膜结构域之间包括铰链区。除了信号传导结构域，胞内信号结构域还可包括例如来源于4-1bb分子的共刺激结构域。
[0056]“car-t细胞”指表达car的t细胞，通常采用编码car的表达载体转导t细胞获得。常用的表达载体为病毒载体，例如慢病毒表达载体。经嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)不受主要组织相容性复合体的限制，具有特异性靶向杀伤活性和持久扩增的能力。除t细胞外，也可以用编码car的表达载体转化诸如nk细胞的其他淋巴细胞，获得表达该car的靶向杀伤性细胞。
[0057]“自剪切肽”指可经核糖体跳跃而非蛋白酶水解来实现剪切蛋白的功能的短肽，可包括t2a、f2a和p2a等。
[0058]“靶向”或“特异性结合”指，相对于环境中同时存在的其他分子，一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如肿瘤细胞表面抗原)具有更高的结合亲和力。“靶向”或“特异性结合”并不排除该分子可以对一种以上的分子具有结合亲和力，例如双特异性抗体可以对两种不同抗原具有高亲和力。
[0059]
本文中，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)dna、rna和pna。“核酸序列”或“核苷酸序列”指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。
[0060]
术语“载体”指可经工程改造以含有目的多核苷酸(例如目的多肽的编码序列)的核酸分子或可在宿主细胞中复制的核酸分子(例如，核酸、质粒、或病毒等)。载体可包括以下组件中的一个或更多个：复制起点、一或更多个调控目的多核苷酸的表达的调控序列(诸如启动子和/或增强子子)和/或一个或更多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析中的基因，例如β-半乳糖)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达目的
多肽的载体。
[0061]“宿主细胞”在本文中指可表达本文提供的car的哺乳动物免疫效应细胞，尤其是人细胞，例如t细胞或nk细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始母细胞完全一致(在形态或基因组dna互补方面)。宿主细胞也包括在活体内经本文提供的核酸分子或表达载体转染的细胞。
[0062]
提及药物组合物，所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。本文所提供的药物组合物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径向受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
[0063]“受试者”指动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中，受试者指需要治疗疾病或病症的个体。在一些实例中，接受治疗的受试者可为患者，其患有与该治疗有关联的病症，或有风险患上该病症。在特定实例中，受试者为人类，诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
[0064]
提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性(sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件blast(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。
[0065]
本发明总体提供了一种特异性靶向fc受体样5(fcrh5)的嵌合抗原受体(car)以及降低car细胞脱靶毒性的方法(通过sirt1、cd258和car联用)。
[0066]
一方面，本技术提供了一种特异性靶向fc受体样5(fcrh5)的嵌合抗原受体(car)，其包含结合fcrh5的胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。
[0067]
在某些实施方式中，所述胞外抗原结合结构域为scfv。
[0068]
在某些实施方式中，所述胞外抗原结合结构域包含轻链可变区，其中所述轻链可变区由seq id no:3、seq id no:13或seq id no:23所示的核苷酸序列或与其具备至少80％一致性的核苷酸序列编码。在某些实施方式中，所述轻链可变区包含seq id no:4、seq id no:14或seq id no:24所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列。
[0069]
在某些实施方式中，所述轻链可变区包含vlcdr1-vlcdr3，其中所述vlcdr1包含
seq id no:7、seq id no:17或seq id no:27所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列；所述vlcdr2包含seq id no:8、seq id no:18或seq id no:28所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列；所述vlcdr3包含seq id no:9、seq id no:19或seq id no:29所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列。
[0070]
在某些实施方式中，所述胞外抗原结合结构域包含重链可变区，其中所述重链可变区由包含seq id no:5、seq id no:15或seq id no:25所示的核苷酸序列或与其具备至少80％一致性的核苷酸序列编码。在某些实施方式中，所述轻链可变区包含seq id no:6、seq id no:16或seq id no:26所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列。
[0071]
在某些实施方式中，所述重链可变区包含vhcdr1-vhcdr3，其中所述vhcdr1包含seq id no:10、seq id no:20或seq id no:30所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列；所述vhcdr2包含seq id no:11、seq id no:21或seq id no:31所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列；所述vhcdr3包含seq id no:12、seq id no:22或seq id no:32所示的氨基酸序列或与其具备至少80％一致性的氨基酸序列。
[0072]
在某些实施方式中，所述铰链区选自以下各项组成的组：igg4的铰链区、igg1的铰链区和cd8的铰链区(优选核苷酸序列如seq id no:35所示，氨基酸序列如seq id no:36所示)。在某些实施方式中，所述铰链区包含seq id no:36所示的序列或由其组成。
[0073]
术语“铰链区”通常是指免疫球蛋白重链ch1和ch2功能区之间的区域。铰链区为位于胞外抗原结合结构域(如scfv)和t细胞膜之间的一段区域。铰链区通常来源于igg家族，例如，可来源于igg1和igg4，还可以来源于igd和cd8。在本技术中，铰链区可以包含选自下组的部分：igg4的铰链区、igg1的铰链区和cd8的铰链区。
[0074]
在某些实施方式中，所述跨膜区选自以下各种组成的组：cd8的跨膜区(优选核苷酸序列如seq id no:37所示，氨基酸序列如seq id no:38所示)、cd28的跨膜区和cd24的跨膜区。在某些实施方式中，所述跨膜区包含seq id no:38所示的序列或由其组成。
[0075]
术语“跨膜区”通常是指连接胞外抗原结合域和胞内信号域的跨膜区段，一般来自二聚体膜蛋白，主要包括cd3ζ、cd4、cd8、cd28等，能将car结构锚定于t细胞膜上。跨膜区不同的设计能影响导入的car基因的表达。在本技术中，所述跨膜区可以包含选自下组的部分：cd8的跨膜区、cd28的跨膜区和cd24的跨膜区。
[0076]
在某些实施方式中，所述细胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。
[0077]
在某些实施方式中，所述信号传导结构域选自以下各项组成的组：cd3ζ的信号传导结构域(优选核苷酸序列如seq id no:43所示，氨基酸序列如seq id no:44所示)、cd3δ的信号传导结构域和cd3ε的信号传导结构域。在某些实施方式中，所述信号传导结构域包含seq id no:44所示的序列或与其具备至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的序列，只要该序列仍具备seq id no:44所示序列功能，或由其组成。
[0078]
术语“信号传导结构域”通常是指来自cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、fcrγ(fcer1g)、fcrβ(fc epsilon r1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10和dap12蛋白质的功能性信号传导结构域。在本技术中，所述信号传导结构域可以来自cd3ζ、cd3δ或cd3ε。
[0079]
在某些实施方式中，所述共刺激结构域选自以下各项组成的组：cd27的共刺激结
构域、cd28的共刺激结构域(优选核苷酸序列如seq id no:39所示，氨基酸序列如seq id no:40所示)和41bb的共刺激结构域(优选核苷酸序列如seq id no:41所示，氨基酸序列如seq id no:42所示)。在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含下述任一项所示的序列或与其具备至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的序列，或由其组成：seq id no:40和seq id no:42，只要仍具备seq id no:40或42所示序列功能。
[0080]
术语“共刺激结构域”通常是指来自以下一个或多个的蛋白质的功能性信号传导结构域:cd27、cd28、41bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2、cd7、nkg2c、b7-h3、特异结合cd83的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46和nkg2d。在本技术中，所述共刺激结构域可以来自：cd27、cd28或41bb。
[0081]
在某些实施方式中，本技术提供的car还可包括前导序列(如信号肽)。在一个具体实例中，前导序列的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no：1和2所示。
[0082]
另一方面，本技术提供了一种降低car细胞脱靶毒性(或非特异性杀伤)的方法，其包含以下步骤：使所述car细胞中sirt1和cd258联合的表达量上调，即将sirt1和/或cd258(作为调节单元)的表达用于调节或改善car细胞脱靶毒性。
[0083]
在某些实施方式中，所述sirt1和cd258来源于人。
[0084]
在某些实施方式中，所述sirt1蛋白包含下述任一项所示的序列：seq id no：51，或与其具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的序列，或由其组成，只要该序列序列仍具备seq id no:51所示序列的功能。
[0085]
在某些实施方式中，所述cd258蛋白包含下述任一项所示的序列：seq id no：53，或与其具备至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的序列，或由其组成，只要该序列仍具备seq id no:53所示序列的功能。
[0086]
在某些实施方式中，所述car通过连接元件连接调节单元，所述调节单元选自所述sirt1蛋白和cd258或其组合。
[0087]
术语“2a序列”通常是指一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列(即自剪切肽)。所述2a序列可以有助于转录产生两种蛋白。
[0088]
在某些实施方式中，所述连接元件为2a序列，选自下列各项组成的组：t2a(优选核苷酸序列如seq id no:45所示，氨基酸序列如seq id no:46所示)、p2a(优选核苷酸序列如seq id no:47所示，氨基酸序列如seq id no:48所示)、f2a、e2a和ires(优选核苷酸序列如seq id no:49所示)。在某些实施方式中，所述连接元件包含seq id no:46、48和49所示的
序列或由其组成。
[0089]
在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：分离获得外周血单核细胞pbmc、cd3
+
t淋巴细胞、cd8
+
t淋巴细胞、cd4
+
t淋巴细胞或调节t细胞。
[0090]
在某些实施方式中，所述方法还包括：向经分离的所述pbmc加入一种或多种t细胞刺激因子。在某些实施方式中，所述t细胞刺激因子选自以下组：b淋巴细胞表面抗原抗体、tnf抗体、细胞内聚酯和抗生素。在某些实施方式中，所述t细胞刺激因子选自以下组：cd3抗体、cd28抗体、4-1bb抗体、cd80抗体、cd86抗体、pha、pma和离子霉素。
[0091]
在某些实施方式中，所述t细胞刺激因子包括cd3抗体，且所述cd3抗体的浓度为1-10000ng/ml。在某些实施方式中，所述t细胞刺激因子包括cd28抗体，且所述cd28抗体的浓度为1-10000ng/ml。
[0092]
在某些实施方式中，所述方法还包括：向经分离的所述pbmc加入一种或多种细胞因子剂。
[0093]
在某些实施方式中，所述细胞因子剂包括白细胞介素。
[0094]
在某些实施方式中，所述白细胞介素包括选自下组的一种或多种：il2、il21、il7和il15。在某些实施方式中，所述白细胞介素包括il2，且所述il2的浓度为0.1-10000u/ml。在某些实施方式中，所述白细胞介素包括il21，且所述il21的浓度为0.01-1000ng/ml。在某些实施方式中，所述白细胞介素包括il7，且所述il7的浓度为0.01-1000ng/ml。在某些实施方式中，所述白细胞介素包括il15，且所述il15的浓度为0.01-1000ng/ml。
[0095]
在某些实施方式中，所述方法包括分离并激活所述经遗传修饰的免疫细胞的步骤，其中所述激活包括向经分离的所述经遗传修饰的免疫细胞施用t细胞培养基。
[0096]
在某些实施方式中，所述t细胞培养基选自以下组中的一种或多种：dmem培养基、1640培养基、mem培养基、x-vivo培养基和干细胞培养基。
[0097]
本技术至少部分地基于发明人偶然发现，在car-t细胞中表达sirt1和/或cd258，或增加其表达量可有助于减少非特异性杀伤，减弱其非靶毒性。
[0098]
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
[0099]
实施例1：慢病毒载体的构建
[0100]
人工合成表1所示各结构的片段，并构建到慢病毒载体(lv100a，system biosciences公司)中，随后按照其说明书描述的方式进行转染和慢病毒获取，分别得到car-101、car-102、car-104、car-105、car-128、car-129慢病毒。
[0101]
表1慢病毒载体中car结构
[0102][0103]
s1a指sirt1突变体，c8a指cd258突变体，氨基酸序列分别如seq id no：51和53所示。
[0104]
实施例2：慢病毒载体的病毒液的制备
[0105]
将293t细胞以5*10e5 cells/ml的细胞密度接种至六孔板中，培养基为含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，每孔接种2ml，放入细胞培养箱中培养过夜。次日，吸取200μl的opti-mem培养基加入1.5ml的ep管中，将实施例1获得的嵌合抗原受体的重组质粒、包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2g，按照4：2：3的比例，用fugene转染试剂共转染293t细胞。转染24h后，将细胞培养基更换为半完全培养基(含5％胎牛血清(fbs)的dmem培养基)；转染48h后，收集1ml的细胞培养上清液，并用预热好的半完全培养基(含5％胎牛血清(fbs)的dmem培养基)补液1ml；转染72h后，收取全部培养上清液，与48h收集的1ml的细胞培养上清液进行充分混匀，于室温下以2000g转速离心10min，收集上层清液，获得特异性靶向人fcrh5的嵌合抗原受体的慢病毒载体病毒液。
[0106]
实施例3：慢病毒滴度的检测
[0107]
将293t细胞以5*10e5 cells/ml的细胞密度接种入六孔板内，每孔2ml，加入3ul上述实施例2中获得的病毒上清液，再加入终浓度为8μg/ml的polybrene，将细胞放入培养箱继续培养；转导72h后，吸弃上清液，加入200ul的0.25％trypsin-edta消化液，消化20s后，加入1ml的完全培养基(含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基)终止消化；收集细胞染色后以细胞流式仪检测阳性率，并计算病毒滴度，所得结果见表2。
[0108]
病毒滴度＝接种细胞总数
×
孔阳性率/加入病毒体积(tu/ml)。
[0109]
表2病毒滴度
[0110]
病毒名称病毒滴度(tu/ml)car-1013.40*10e6car-1021.57*10e6car-1048.63*10e5
car-1059.67*10e5car-1288.57*10e5car-1297.57*10e5
[0111]
实施例4：t细胞的分离培养
[0112]
取健康供者的新鲜单采血，通过ficoll离心液分离得到外周血单核细胞。利用偶联了抗-cd3抗体和抗-cd28抗体的顺磁磁珠(invitrogen，human t-activator cd3/cd28)进行cd3+t细胞的激活；待磁珠混合均匀后，取出所需磁珠放入无菌ep管中，加入xvivo15培养基进行磁珠润洗；待磁珠润洗后，将磁珠与细胞混合均匀，补加t细胞培养基(xvivo15培养基+5％fbs+100u/mlil2+20ng/mlil21+20ng/mlil7)并将细胞培养激活密度调节至1*10e6 cells/ml；将计数后的细胞放入合适的培养容器中，并进一步转入细胞培养箱中培养，记为day0；
[0113]
实施例5：特异性靶向人fcrh5的嵌合抗原受体t细胞的制备
[0114]
day1 t细胞转导：取实施例4获得的cd3+t细胞，接种到12孔板中，接种量为5*10e5 cells/孔；从-80℃冰箱取出实施例2制备的病毒，在室温下融化，按照moi为3的量加入至含t细胞的孔内，再加入终浓度为8μg/ml的polybrene，吹打混匀；同时设置不加入病毒的对照组作为t组。将12孔板放入甩板机中，在配平后以1200rpm的转速进行室温离心1小时，之后放回细胞培养箱中继续培养；
[0115]
day2去病毒：从细胞培养箱中取出12孔板，将所有细胞悬液转移至15ml离心管内，以400g的转速离心5min；弃去上层清液后，使用适量新鲜t细胞完全培养基重悬后，接种至12孔板内。
[0116]
从day3开始，每隔1天进行细胞计数传代，传代密度5*10e5 cells/ml，结果如图1所示；培养到day10，各组之间的体外扩增倍数差异不大，同时细胞直径和活率也无明显差异。
[0117]
实施例6：利用流式细胞术分析检测car蛋白的表达以及t细胞分群
[0118]
取实施例5中培养至day10的细胞至流式管中，以400g的转速离心5min，弃去上层清液，每管加入1ml的pbs buffer进行两次洗涤，弃上层清液，加入30μl的pbs buffer，涡旋混匀；在每只流式管中加入0.5μg带有his标签的fcrh5蛋白，混匀后在4℃下孵育60min。孵育结束后，向流式管中加入2ml的pbs buffer洗涤一次，离心弃上清后加入30μl的pbs buffer进行涡旋混匀，再分别加入1.5μl的his(apc)抗体、1.0μl的cd8(percp-cy5.5)抗体，避光条件4℃孵育30min。孵育结束后，用2ml的pbs buffer洗涤一次，离心后弃上清，加入300μl的pbs buffer，涡旋混匀后上机检测，用flowjo分析结果。如图2所示，car-101、car-102、car-104、car-105、car-128和car-129组fcrh5的表达率分别为63.0％、66.0％、66.5％、68.7％、70.1％和63.2％，没有显现出明显的组间差异。如图3所示，cd8+t细胞占比分别为61.4％、65.1％、67.8％、64.5％、69.6％和64.6％，亦无明显的组间差异。
[0119]
实施例7：293t-fcrh3、293t-fcrh5瞬转细胞株的构建
[0120]
将293t细胞以5*10e5 cells/ml的细胞密度接种至六孔板中，每孔2ml，放入细胞培养箱中培养过夜。吸取200μl的opti-mem培养基加入1.5ml的ep管中，加入2μg目标表达质粒(fcrh3-luciferase、fcrh5-luciferase)和转染试剂fugene，混匀后室温条件下孵育15min。将形成的质粒-转染试剂复合物逐滴缓慢加入到六孔板中，放入细胞培养箱中培养
过夜，构建293t-fcrh3和293t-fcrh5瞬转细胞株。
[0121]
实施例8：cart细胞的特异性及非特异性杀伤检测
[0122]
将293t-fcrh3和293t-fcrh5细胞分别进行消化计数，每一种靶细胞系对应地设置七个实验组和一个对照组，取2*10e5 cells/孔的细胞量进行离心，以1000rpm的转速离心5min，弃去上层清液，用xvivo15培养基重悬细胞，再接种到12孔板中，每孔接种1ml。
[0123]
取实施例5中培养至day10的t细胞以及car-t细胞，t细胞取2*10e5 cells/孔进行离心，car-t细胞取car阳性细胞2*10e5 cells/孔进行离心，弃去上层清液后，以1ml的xvivo15培养基重悬每孔细胞，并分别加入对应孔中，对照组只加入1ml的xvivo15培养基；细胞接种完毕后，以移液枪轻柔吹打混匀，再放入37℃细胞培养箱中培养。
[0124]
待细胞培养96h后，在显微镜下观察12孔板内靶细胞的存活状态，并拍照记录；弃去上层清液，加入1ml的pbs buffer重悬贴壁细胞，然后每孔取50μl细胞悬液至96孔白板中，加入50μl提前平衡至室温的steady-glo检测试剂(promega，货号e2520)，5分钟后在酶标仪上检测发光信号，并计算杀伤率。
[0125]
杀伤率(％)＝(对照组荧光值-实验组荧光值)/对照组荧光值*100％。
[0126]
如图4所示，t组、car-101、car-102组对于293t-fcrh3细胞没有明显的非特异性杀伤，而car-104、car-105、car-128和car-129组对于293t-fcrh3的杀伤率分别为76.87％、51.58％、55.98％、26.53％，car-105组对于293t-fcrh3的杀伤率显著低于car-104组，car-129组对于293t-fcrh3的杀伤率显著低于car-128组，具备显著降低非特异性杀伤的特性。
[0127]
与此同时，如图5所示，各组对于293t-fcrh5均有明显的杀伤效果，car-101、car-102、car-104、car-105、car-128和car-129组对于293t-fcrh5的杀伤率分别为59.43％、53.97％、55.59％、69.02％、86.82％和85.83％。car-104组和car-105组，两组之间对于293t-fcrh5的杀伤率无显著差异性；car-128组和car-129组，两组之间对于293t-fcrh5的杀伤率亦无显著差异性。
[0128]
本文提及或用到的一些核苷酸和氨基酸序列如下。
[0129]
seq id no.1：前导序列核苷酸序列
[0130]
atggctctgcctgtgaccgctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgcaagacct
[0131]
seq id no.2：前导序列氨基酸序列
[0132]
malpvtalllplalllhaarp
[0133]
seq id no.3：101 vl核苷酸序列
[0134]
gacatccagatgacccagagcccctctagcctctccgcctccgtgggagatagagtgaccattacatgcaaggccagccaggacgtgtccaccgcagttgcttggtaccagcagaaacctggaaaggccccaaagctgctgatctacagcgcttcttatagatacaccggcgtgcccagccggttcagcggctctggaagcggaactgacttcaccctgacaatcagctctctgcaacctgaggatttcgccacatactactgccagcaacacttcagcagccctagaaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaaaaga
[0135]
seq id no.4：101 vl氨基酸序列
[0136]
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdvstavawyqqkpgkapklliysasyrytgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqhfssprtfgqgtkveikr
[0137]
seq id no.5：101 vh核苷酸序列
[0138]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggcctggtccagcctggcggcagcctgcggctgagctgcgcc
gccagcggctttaccttcagcagctacgccgtgagctgggtgcggcaggcccctggcaagggcctggaatgggtcgccaccatctcctctggcggctctcttacattttacctggacagcgtgcggggcagattcacaatcagcagagacaacagcaagaataccctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacacagccgtgtactattgtgccagacctatccccgactactacgccctggactactggggccagggcacactggtcacagtgtccagc
[0139]
seq id no.6：101 vh氨基酸序列
[0140]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyavswvrqapgkglewvatissggsltfyldsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarpipdyyaldywgqgtlvtvss
[0141]
seq id no.7：101 vl cdr1氨基酸序列
[0142]
kasqdvstava
[0143]
seq id no.8：101 vl cdr2氨基酸序列
[0144]
sasyryt
[0145]
seq id no.9：101 vl cdr3氨基酸序列
[0146]
qqhfssprt
[0147]
seq id no.10：101 vh cdr1氨基酸序列
[0148]
gftfssyavs
[0149]
seq id no.11：101 vh cdr2氨基酸序列
[0150]
atissggsltfyldsvr
[0151]
seq id no.12：101 vh cdr3氨基酸序列
[0152]
pipdyyaldy
[0153]
seq id no.13：104 vl核苷酸序列
[0154]
gacatccagatgacccagagccccagctccctgagcgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacatgcaaggccagccaggacgtgcggaacctggtggtgtggttccagcagaagcccggcaaggcccctaagctgctgatctacagcggctcatatagatacagcggagtgcctagcagatttagcggcagcggctctggcaccgatttcaccctgaccatcagcagcctccagcccgaggacttcgccacctactattgtcagcaacactactctccaccttacaccttcggccagggaacaaaggtggaaatcaag
[0155]
seq id no.14：104 vl氨基酸序列
[0156]
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdvrnlvvwfqqkpgkapklliysgsyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqhysppytfgqgtkveik
[0157]
seq id no.15：104 vh核苷酸序列
[0158]
gaggtgcagctggtcgagagcggtcctggcctggttaagcctagcgagacactgagcctgacctgcaccgtgtccggcttcagcctgaccagattcggagtgcactgggtgcggcagcctccaggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatctggcggggcggcagcaccgactacaacgccgcctttgtgagcagactgacaattagcaaggacaattctaaaaaccaggtgtccctgaagctgtctagcgtgaccgccgctgatacagctgtgtactactgcagcaaccactactacggctctagcgattacgccctggacaactggggacaaggcacactggtcacagtgtccagc
[0159]
seq id no.16：104 vh氨基酸序列
[0160]
evqlvesgpglvkpsetlsltctvsgfsltrfgvhwvrqppgkglewlgviwrggstdynaafvsrltiskdnsknqvslklssvtaadtavyycsnhyygssdyaldnwgqgtlvtvss
[0161]
seq id no.17：104 vl cdr1氨基酸序列
[0162]
kasqdvrnlvv
[0163]
seq id no.18：104 vl cdr2氨基酸序列
[0164]
sgsyrys
[0165]
seq id no.19：104 vl cdr3氨基酸序列
[0166]
qqhysppyt
[0167]
seq id no.20：104 vh cdr1氨基酸序列
[0168]
rfgvh
[0169]
seq id no.21：104 vh cdr2氨基酸序列
[0170]
viwrggstdynaafvs
[0171]
seq id no.22：104 vh cdr3氨基酸序列
[0172]
hyygssdyaldn
[0173]
seq id no.23：128 vl核苷酸序列
[0174]
gatatcgtgatgacccagagccacaagatcatgagcacctctgtgggcgacagagtgtctattacatgcaaggccagccaggacgtgtccaacatcgtggtgtggttccagcagaagcccggacaatctcctaacctgctgatctacagcgctagctacagatacaccggcgtgcccgatcggtttacaggcagcggatctggcaccgacttcaccttcaccatcagcagcgtgcaggccgaggacctggccgtgtactattgtcagcagcactacagcagcccttatacatttggcggcggcaccaaactggaaatcaag
[0175]
seq id no.24：128 vl氨基酸序列
[0176]
divmtqshkimstsvgdrvsitckasqdvsnivvwfqqkpgqspnlliysasyrytgvpdrftgsgsgtdftftissvqaedlavyycqqhysspytfgggtkleik
[0177]
seq id no.25：128 vh核苷酸序列
[0178]
caggtgcagctgaagcagagcggcccaggcctggtccagcctagccaaagcctgtccatcacctgcacagtttccggcttcagcctgaccaggttcggcgtgcactgggtcagacagtcccctggcaagggactcgagtggctgggcgtgatctggcggggcggcagcacagattacaacgccgctttcatgagcagactgacaatcaccaaggacaacagcaagagccaagtgttcttcaagctgaactctctgaaagtggacgatacagccatctactactgcagcaaccattactacggctccagcgactacgccctggacaattggggccagggcatcagcgtgaccgtgtcctcc
[0179]
seq id no.26：128 vh氨基酸序列
[0180]
qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltrfgvhwvrqspgkglewlgviwrggstdynaafmsrltitkdnsksqvffklnslkvddtaiyycsnhyygssdyaldnwgqgisvtvss
[0181]
seq id no.27：128 vl cdr1氨基酸序列
[0182]
kasqdvsnivv
[0183]
seq id no.28：128 vl cdr2氨基酸序列
[0184]
sasyryt
[0185]
seq id no.29：128 vl cdr3氨基酸序列
[0186]
qqhysspyt
[0187]
seq id no.30：128 vh cdr1氨基酸序列
[0188]
rfgvh
[0189]
seq id no.31：128 vh cdr2氨基酸序列
[0190]
viwrggstdynaafms
[0191]
seq id no.32：128 vh cdr3氨基酸序列
[0192]
hyygssdyaldn
[0193]
seq id no.33：linker核苷酸序列
[0194]
ggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggcggcggcggctct
[0195]
seq id no.34：linker氨基酸序列
[0196]
ggggsggggsggggs
[0197]
seq id no.35：cd8铰链区核苷酸序列
[0198]
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatc
[0199]
seq id no.36：cd8铰链区氨基酸序列
[0200]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdi
[0201]
seq id no.37：cd8跨膜区核苷酸序列
[0202]
tacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
[0203]
seq id no.38：cd8跨膜区氨基酸序列
[0204]
yiwaplagtcgvlllslvitlyc
[0205]
seq id no.39：cd28胞内结构核苷酸序列
[0206]
aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc
[0207]
seq id no.40：cd28胞内结构氨基酸序列
[0208]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs
[0209]
seq id no.41：41bb胞内结构核苷酸序列
[0210]
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
[0211]
seq id no.42：41bb胞内结构氨基酸序列
[0212]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0213]
seq id no.43：cd3zeta胞内结构核苷酸序列
[0214]
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
[0215]
seq id no.44：cd3zeta胞内结构氨基酸序列
[0216]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0217]
seq id no.45：t2a核苷酸序列
[0218]
gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct
[0219]
seq id no.46：t2a氨基酸序列
[0220]
egrgslltcgdveenpgp
[0221]
seq id no.47：p2a核苷酸序列
[0222]
gccaccaattttagcctgctgaaacaggccggagacgtggaggaaaaccccggcccc
[0223]
seq id no.48：p2a氨基酸序列
[0224]
atnfsllkqagdveenpgp
[0225]
seq id no.49：ires序列
[0226]
tccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccaca
[0227]
seq id no.50：s1a核苷酸序列
[0228]
ggtccatatacttttgttcagcaacatcttatgattggcacagatcctcgaacaattcttaaagatttattgccggaaacaatacctccacctgagttggatgatatgacactgtggcagattgttattaatatcctttcagaaccaccaaaaaggaaaaaaagaaaagatattaatacaattgaagatgctgtgaaattactgcaagagtgcaaaaaaattatagttctaactggagctggggtgtctgtttcatgtggaatacctgacttcaggtcaagggatggtatttatgctcgccttgctgtagacttcccagatcttccagatcctcaagcgatgtttgatattgaatatttcagaaaagatccaagaccattcttcaagtttgcaaaggaaatatatcctggacaattccagccatctctctgtcacaaattcatagccttgtcagataaggaaggaaaactacttcgcaactatacccagaacatagacacgctggaacaggttgcgggaatccaaaggataattcagtgtcatggttcctttgcaacagcatcttgcctgatttgtaaatacaaagttgactgtgaagctgtacgaggagatatttttaatcaggtagttcctcgatgtcctaggtgcccagctgatgaaccgcttgctatcatgaaaccagagattgtgttttttggtgaaaatttaccagaacagtttcatagagccatgaagtatgacaaagatgaagttgacctcctcattgttattgggtcttccctcaaagtaagaccagtagcactaattccaagttccataccccatgaagtgcctcagatattaattaatagagaacctttgcctcatctgcattttgatgtagagcttcttggagactgtgatgtcataattaatgaattgtgtcataggttaggtggtgaatatgccaaactttgctgtaaccctgtaaagctttcagaaattactgaaaaacctccacga
[0229]
seq id no.51：s1a氨基酸序列
[0230]
gpytfvqqhlmigtdprtilkdllpetipppelddmtlwqivinilseppkrkkrkdintiedavkllqeckkiivltgagvsvscgipdfrsrdgiyarlavdfpdlpdpqamfdieyfrkdprpffkfakeiypgqfqpslchkfialsdkegkllrnytqnidtleqvagiqriiqchgsfatasclickykvdceavrgdifnqvvprcprcpadeplaimkpeivffgenlpeqfhramkydkdevdllivigsslkvrpvalipssiphevpqilinreplphlhfdvellgdcdviinelchrlggeyaklccnpvklseitekppr
[0231]
seq id no.52：c8a核苷酸序列
[0232]
atggaggagagtgtcgtacggccctcagtgtttgtggtggatggacagaccgacatcccattcacgaggctgggacgaagccaccggagacagtcgtgcagtgtggcccgggtgggtctgggtctcttgctgttgctgatgggggccgggctggccgtccaaggctggttcctcctgcagctgcactggcgtctaggagagatggtcacccgcctgcctgacggacctgcaggctcctggcaagagcgaaggtctcacgaggtcaacccagcagcgcatctcacaggggccaactccagcttgaccggcagcggggggccgctgttatgggagactcagctgggcctggccttcctgaggggcctcagctaccacgatggggcccttgtggtcaccaaagctggctactactacatctactccaaggtgcagctgggcggtgtgggctgcccgc
tgggcctggccagcaccatcacccacggcctctacaagcgcacaccccgctaccccgaggagctggagctgttggtcagccagcagtcaccctgcggacgggccaccagcagctcccgggtctggtgggacagcagcttcctgggtggtgtggtacacctggaggctggggagaaggtggtcgtccgtgtgctggatgaacgcctggttcgactgcgtgatggtacccggtcttacttcggggctttcatggtg
[0233]
seq id no.53：c8a氨基酸序列
[0234]
meesvvrpsvfvvdgqtdipftrlgrshrrqscsvarvglglllllmgaglavqgwfllqlhwrlgemvtrlpdgpagswqerrshevnpaahltganssltgsggpllwetqlglaflrglsyhdgalvvtkagyyyiyskvqlggvgcplglastithglykrtprypeelellvsqqspcgratsssrvwwdssflggvvhleagekvvvrvlderlvrlrdgtrsyfgafmv。

技术特征：
1.嵌合抗原受体(car)，其胞外抗原结合结构域包括一个或更多个靶向fcrh5的抗体分子或其抗原结合片段，所述抗体分子的重链可变区(vh)的hcdr1、hcdr2、hcdr3和轻链可变区(vl)的lcdr1、lcdr2和lcdr3选自如下组合之一：1)hcdr1的序列如seq id no：10所示；hcdr2的序列如seq id no：11所示；hcdr3的序列如seq id no：12所示；lcdr1的序列如seq id no：7所示；lcdr2的序列如seq id no：8所示；lcdr3的序列如seq id no：9所示；2)hcdr1的序列如seq id no：20所示；hcdr2的序列如seq id no：21所示；hcdr3的序列如seq id no：22所示；lcdr1的序列如seq id no：17所示；lcdr2的序列如seq id no：18所示；lcdr3的序列如seq id no：19所示；以及3)hcdr1的序列如seq id no：30所示；hcdr2的序列如seq id no：31所示；hcdr3的序列如seq id no：32所示；lcdr1的序列如seq id no：27所示；lcdr2的序列如seq id no：28所示；lcdr3的序列如seq id no：29所示。2.如权利要求1所述的car，其中：1)所述重链可变区包括seq id no：6所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包括与seq id no：6所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区包括seq id no：4所示氨基酸序列，或者所述轻链可变区包括与seq id no：4所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氨基酸序列；2)所述重链可变区包括seq id no：16所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包括与seq id no：16所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区包括seq id no：14所示氨基酸序列，或者所述轻链可变区包括与seq id no：14所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氨基酸序列；或者3)所述重链可变区包括seq id no：26所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包括与seq id no：26所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区包括seq id no：24所示氨基酸序列，或者所述轻链可变区包括与seq id no：24所示序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的car，其中所述胞外抗原结合结构域为单链抗体(scfv)形式，优选地，所述单链抗体中采用seq id no：34所示氨基酸序列的连接肽。
4.如权利要求1所述的car，其中所述胞外抗原结合结构域包括串联连接的两个或更多个所述抗体分子或其抗原结合片段。5.如权利要求1所述的car，其中所述car从n端到c端依次包括所述胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、以及胞内共刺激结构域和信号传导结构域；优选地，所述铰链区来自igg4、igg1、igd或cd8，更优选seq id no：36所示氨基酸序列；优选地，所述跨膜结构域来自cd8、cd28或cd24，更优选seq id no：38所示氨基酸序列；优选地，所述共刺激结构域来自cd27、cd28或41bb，更优选seq id no:40或42所示氨基酸序列；优选地，所述信号传导结构域来自cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、fcrγ(fcer1g)、fcrβ(fc epsilon r1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10或dap12，更优选seq id no:44所示氨基酸序列。6.如权利要求4所述的car，其中所述car在n末端还包括前导序列；优选地，所述前导序列包括seq id no：2所示氨基酸序列。7.核酸分子，其包括权利要求1-6任一项所述的car的编码核苷酸序列；优选地，所述核酸分子还包括sirt1和/或cd258的编码核苷酸序列；优选地，所述car的编码核苷酸序列与所述sirt1和/或cd258的编码核苷酸序列之间通过自剪切肽编码序列或ires序列连接；优选地，所述sirt1和cd258的氨基酸序列分别如seq id no：51和53所示。8.宿主细胞，其表达权利要求1-6任一项所述的car、包括权利要求7所述的核酸分子或包括携带权利要求7所述的核酸分子的表达载体；优选地，所述细胞为t细胞或nk细胞。9.如权利要求8所述的细胞，其中所述细胞经修饰以表达或过表达sirt1和/或cd258；优选地，所述sirt1和cd258的氨基酸序列分别如seq id no：51和53所示。10.权利要求1-6任一项所述的car、权利要求7所述的核酸分子、或权利要求8或9所述的细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。11.如权利要求10所述的用途，其中所述肿瘤表达fcrh5，或者所述肿瘤表达fcrh5且不表达fcrh3。12.如权利要求11所述的用途，其中所述肿瘤为多发性骨髓瘤。13.药物组合物，包括：1)权利要求1-6任一项所述的car、权利要求7所述的核酸分子、或权利要求8或9所述的细胞；以及2)药学上可接受的载体。14.降低car-t细胞非特异性杀伤的方法，包括让所述car-t细胞表达或过表达sirt1和/或cd258。

技术总结
本文提供了靶向FcRH5的嵌合抗原受体(CAR)。本文还提供了表达该CAR以及SIRT1和CD258的CAR-T细胞。本文提供的CAR-T细胞可用于多发性骨髓瘤的治疗。于多发性骨髓瘤的治疗。于多发性骨髓瘤的治疗。


技术研发人员：凌有国 沈文华 吴昊天
受保护的技术使用者：南京紫珑生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/9/23